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.2000年8月；1(2):151-7.
doi:10.1093/embo-reports/kvd028。

转录中介因子TIF2介导的雌激素受体α激活功能AF1和AF2之间的协同作用

A贝内克 1, P Chambon公司, H Gronemeyer公司
附属公司

转录中介因子TIF2介导的雌激素受体α激活功能AF1和AF2的协同作用

A贝内克等。 EMBO代表. 2000年8月.

摘要

雌激素受体ERα和ERβ配体结合域中的激活功能AF2通过招募核受体辅活化剂发出信号。最近的证据表明，共激活物，如转录中介因子TIF2，也与两个ER的N末端AF1功能结合并相互作用。我们已经生成了AF1或AF2相互作用不足的TIF2突变体蛋白质，并使用这些突变体来研究AF对TIF2招募和反式激活的相对贡献。我们观察到，在转染的哺乳动物细胞和体外，TIF2能够同时与分离的ERα的N-和C-末端相互作用，这表明TIF2可以桥接这两个受体结构域。TIF2与两种AF的共同作用导致转录的协同激活。因此，ERαAF1和AF2之间的协同作用是TIF2和/或p160辅活化因子家族其他成员合作招募的结果。

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数字

无
图1。本研究中使用的结构。给出了本研究中采用的主要TIF2和ERα结构的示意图。请注意，域没有按比例进行描述。右侧的western blot证实了TIF2突变蛋白在cDNA转染细胞中的表达水平与野生型TIF2相当。分子量标记的位置显示在90°旋转图像的顶部。本研究中使用的缩写为：hTIF2，人类转录中间因子2（Voegel等。, 1996); hTIF2m123，TIF2的一种突变，在所有三个LxxLL盒（Voegel等。, 1998); hTIF2ΔQ，一种缺乏富Q结构域的TIF2缺失突变体（本研究）；hTIF2m123ΔQ，TIF2的双突变体，结合LxxLL到LxxAA突变和富Q缺失突变（本研究）；人雌激素受体α；大写字母表示相应结构中存在的hERα的不同域；括号中是之前研究中使用的不同结构的名称。注意，与其他结构相比，hTIF2ΔQ的表达稍高（为进行western blot分析加载了等量的蛋白质）。
无
图2。TIF2有两个功能独立的ERα接口。(A类)如图所示，GST与hTIF2、hTIF2m123、hTIV2ΔQ、hTIF2m123ΔQ和纯化的GST–hERαAB（通道3），以及GST–h ERαCDEF（通道4和5）在没有和存在雌二醇（E2）的情况下的相互作用分析。野生型和突变型TIF2蛋白编码的不同cDNA为在体外翻译并随后分析蛋白质与两种ER融合蛋白的相互作用模式。使用干凝胶的自显影扫描图像生成图形。注意，考马斯染色证实GST融合蛋白的负载量相等（未显示）。（B–D）以17m-ERE-TATA-CAT构建物、不同TIF2 cDNA和hERαABC为报告物在COS-1细胞中的瞬时转染实验(B)，hERαCDEF(C类)和整个hERα(D类)揭示不同TIF2突变体的转录刺激。通过ELISA测定CAT值，并借助共表达β-半乳糖苷酶的活性进行标准化。注意，为了清楚起见，在（C）中省略了在没有配体的情况下hERαCDEF的活性值。羟基三苯氧胺（OHT）是hERαCDEF的完全拮抗剂，同时也是hERα的部分激动剂，其活性在ICI164-384（ICI）存在下完全被阻断。
无
图3。TIF2可以桥接两个ER AF(A类)实验设置如所示(B). 进行与图2中类似的瞬时转染。然而，报告者选择的[5×Gal4-结合位点位于TATA元件前，指示氯霉素乙酰转移酶（17m5-TATA-CAT）的表达]对Gal4-hERαAB不起作用。再次，在存在或不存在TIF2及其突变体、VP16-hERαCDEF和柱下所示配体的情况下，对系统的活性进行了比较。(C类)实验设置示意图如所示(D类). 图2A所示为基于GST的相互作用分析。保留在体外翻译，35GST–hERαAB珠上的S标记hERαCDEF在TIF2.1蛋白（见图1）和配体的存在和不存在下测定。显示了干燥凝胶的放射自显影图。
无
图4。TIF2可以调节AF1和AF2之间的协同作用。(A类)显示了CEF细胞瞬时转染的实验装置。(B)使用指示报告者和表达载体的实际实验，类似于图2B-D。
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