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.2000年4月；11(4):1315-27.
doi:10.1091/mbc.11.41315。

一种新的paxillin-binding蛋白，PAG3/Papalpha/KIAA0400，具有ADP-核糖基化因子GTPase激活蛋白活性，参与paxillin募集到局部黏附和细胞迁移

A近藤 1, S桥本, H亚诺, K Nagayama公司, Y Mazaki（马扎基）, H Sabe公司
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一种新的paxillin-binding蛋白，PAG3/Papalpha/KIAA0400，具有ADP-核糖基化因子GTPase激活蛋白活性，参与paxillin募集到局部黏附和细胞迁移

近藤等。 分子生物学细胞. 2000年4月.
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摘要

帕罗西林在整合素信号传导中起着适配器分子的作用。帕西林定位于局部接触，但似乎也存在于相对较大的细胞质池中。在这里，我们报告了一种新的paxillin-binding蛋白PAG3（具有ADP-核糖基化因子[ARF]GTPase激活蛋白[GAP]活性的paxilin-associated protein，编号3）的鉴定，该蛋白参与调控paxillin的亚细胞定位。PAG3与所有paxillin亚型结合，并在单核细胞成熟过程中诱导，此时paxilin表达也增加，整合素被激活。PAG3在早产单核细胞中广泛分布在细胞质中，但在成熟单核细胞中定位在细胞外周，其中一部分随后与帕罗西汀共定位。另一方面，PAG3在局灶性黏附斑块处没有积聚，这表明PAG3不是整合素组装蛋白。PAG3与KIAA0400/Papalpha相同，该蛋白先前被鉴定为一种Pyk2-结合蛋白，在体外对几种ARF具有GAP活性。哺乳动物ARF分为三类，我们发现所有类别都会影响paxillin的亚细胞定位。我们还研究了PAG3与ARF之间可能的相互作用，并证明其中至少有一种ARF6似乎是PAG3 GAP活性的细胞内底物。此外，PAG3的过度表达，而不是其GAP-非活性突变体，抑制了帕西林在局部接触中的募集，阻碍了细胞迁移活动，而细胞粘附活动几乎不受影响。因此，我们的结果表明，局部粘连对帕西林的募集不是通过简单的细胞质扩散介导的；相反，PAG3似乎参与了这一过程，可能是通过其对ARF蛋白的GAP活性。因此，我们的结果揭示了细胞迁移活动调控的一个新方面。

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数字

图1
图1
PAG3的结构及其与paxillin的结合。（A） PAG3的示意图及其与使用GST-paxillinα作为探针分离的原始两个克隆的比较（克隆43和81）。（B） PAG3（残基420–505）的锌指结构域与ARF1 GAP（残基6–91）、ASAP1（残基453–538；棕色等。，1998年），GCS1（残基10-95），PAG1（残基1-83），PAG2（对应克隆81），PAG4（残基404-489）和p95PKL（残基1-83）。PAG2的cDNA并不完整；因此，没有指定残留数量。相同的残留物被框起来并遮住。锌指基序的四个保守半胱氨酸的位置用点标记，PAG3 CA突变体中突变的残基用星号标记。ASAP1对应于s19克隆，PAG1、PAG2和PAG4对应于我们收集的paxillin-binding蛋白（我们未发表的数据）。（C） PAG3与帕西林亚型结合。用15μg Sf-9细胞裂解物培养COS-7细胞中表达并纯化的每2.5μg GST（4-6道）或PAG3的GST融合形式（7-9道），每种裂解物均产生重组paxillin亚型α、β和γ。孵育后，清洗珠子，并使用抗帕西林抗体Ab 199-217对珠子上的蛋白质进行免疫印迹分析。每0.5μg相同的细胞裂解物被纳入“总量”（1–3道）。（D） 帕罗西林与PAG3的COOH末端区域结合。如材料和方法所述，用谷胱甘肽珠纯化的PAG3野生型和缺失突变体的每2.5μg单独GST（第2道）或GST融合形式（第3-7道）与15μg产生重组paxillinα的Sf-9细胞裂解物孵育以测试结合，如上所述。通道1包括0.5μg相同的细胞裂解液。关于M1–M4的缺失突变体，参见A.（E）PAG3与NH结合2-帕西林终末区。在谷胱甘肽珠上纯化材料和方法中描述的每5μg单独GST（第2道）和帕西林野生型和突变体（第3-5道）的GST融合形式，并用500μg表达PAG3 EGFP融合形式的COS-7细胞裂解液孵育以测试结合。车道1中含有30微克的COS-7细胞总裂解物。用抗GFP抗体进行免疫印迹。（F） 体内PAG3和帕西林的相关性。每个1×106用10μg pEBG或pEBG/PAG3质粒转染COS-7细胞，并使用谷胱甘肽珠从每1mg细胞裂解液中提取GST（第3道）或GST-PAG3（第4道），以分析其与内源性帕西林的相关性。每30μg总细胞裂解物均包含在第1条通道（含有pEBG的细胞）和第2条通道（带有pEBG/PAG3的细胞）中。用抗帕罗西林抗体Ab 199–217进行免疫印迹。（G） 内源性PAG3和帕罗西汀的体内关联。使用抗PAG3抗体（第2道）或免疫前血清（第1道）结合蛋白A-Sepharose珠对TPA处理的U937细胞制备的每1mg细胞裂解液进行免疫沉淀。然后使用抗帕西林抗体Ab 199-217和抗PAG3抗体对沉淀蛋白进行免疫印迹分析。在C–F中，用于下拉分析的每个融合蛋白的数量通过考马斯亮蓝染色（CBB）显示。
图2
图2
在单核细胞成熟过程中诱导PAG3表达并增加其与paxillin的结合。（A） 用SDS-PAGE分离U937单核细胞、人外周血单核细胞（PBL）和其他几种细胞系的细胞裂解物，并使用抗PAG3抗体进行免疫印迹分析。显示未分化的单核细胞（−TPA）或经三天TPA处理后分化的单细胞（+TPA）。（B） 从用（泳道3）或不用（泳道1和2）TPA处理的U937细胞中免疫沉淀PAG3蛋白，并使用抗磷酸酪氨酸抗体（4G10；抗pY）和抗PAG3抗体进行连续免疫印迹分析。最初使用不同数量的细胞裂解物（通道1中1 mg，通道2中7.5 mg，通道3中1 mg）来比较酪氨酸磷酸化水平。（C） 将TPA处理或未处理的U937细胞的细胞裂解液与谷胱甘肽珠纯化的GST-PAG3孵育，以分析PAG3与帕西林和Pyk2的结合。通过与抗帕西林抗体（Ab 199–217，Pax）和抗派克2抗体（Pyk2）的顺序杂交，使用相同的膜过滤器进行免疫印迹。在C中，通过考马斯亮蓝染色（CBB）显示用于下拉分析的每个融合蛋白的数量（第3道，GST；第4道和第5道，GST-PAG3）。
图3
图3
U937单核细胞（A）和COS-7上皮细胞（B）细胞质和细胞外周内源性PAG3和酯林的共定位。图中显示了未分化的U937单核细胞（A，A–c）或经TPA处理3 d（A，d–f）后分化的单核细胞。用3.7%多聚甲醛固定细胞，分别用兔多克隆抗PAG3抗体（a和d）和小鼠单克隆抗paxillin抗体（b和e）进行双重免疫标记，然后用Cy2-偶联驴抗兔IgG和Cy5-偶联驴抗鼠IgG进行免疫标记，并用共聚焦激光扫描显微镜进行检测。在A（A–c）中，焦点调整在玻璃室板表面上方5.0μm，在B（A–c）中调整在玻璃室内板表面上方3.0μm，每个焦点都穿过大多数细胞的细胞核中心，或在靠近细胞底层的A（d–f）和B（d–f）中，焦度调整在玻璃室外板表面上方0.5μm。在B的e和f中，除了局限于局灶性黏附斑块外，还可以看到定位于细胞质池的paxillin，一些局灶性粘连斑块上有箭头标记。右列表示左图像和中间图像的合并。为了获得更清晰的PAG3和paxillin分布图像，B（a、B、d和e）中的一些照片显示为黑白图像。棒材，20μm。
图4
图4
PAG3和ARF亚型。（A） PAG3的亚细胞定位与ARF1、ARF5和ARF6重叠，但与PAG3共定位更容易观察到ARF5、ARF6而不是ARF1。通过钙沉淀法瞬时转染COS-7细胞，每个质粒编码一种HA标记的野生型ARF亚型（a–c，ARF1；d–f，ARF5；g–i，ARF6），然后固定，使用小鼠单克隆抗HA抗体和Cy5-偶联驴抗小鼠抗体（b、e和h），通过免疫标记HA表位来显示每个ARF蛋白。通过抗PAG3抗体和Cy2-结合驴抗兔抗体（a、d和g）观察内源性PAG3。（B） PAG3的过度表达，而不是其GAP-非活性突变体，抵消了ARF6转染细胞和AlF处理细胞中的ARF6活性。用FuGENE 6瞬时转染COS-7细胞，转染质粒编码HA标记的野生型ARF6（a–c），或与编码HA标记野生型ARF 6和EGFP标记野生型（d–f）的质粒共转染，或与质粒编码HA标签野生型ARF-6和PAG3的CA突变体（g–i）共转染。根据我们的初步滴定实验，每使用0.5μg PAG3和0.5μg ARF质粒。然后按照材料和方法中的描述，在37°C下用AlF处理细胞1h并固定。通过EGFP标记（d和g）的荧光显示PAG3蛋白。ARF6（b、e和h）如图A所示。在A和b中，焦点被调整到玻璃室板表面上方3.0μm处，穿过大多数细胞的细胞核中心，每个右列代表左图像和中间图像的合并。棒材，20μm。
图5
图5
ARF活性影响帕西林的亚细胞定位。将未经转染（a–c）或经FuGENE 6瞬时转染的COS-7细胞与编码HA-标记野生型ARF1（d–f）、ARF5（g–i）或ARF6（j和k）的每个质粒在37°c下用AlF处理1小时。然后固定细胞，并使用兔多克隆抗paxillin抗体，结合Cy5偶联驴抗兔抗体，显示内源性paxilin（a、d、g和j），并显示HA-ARF蛋白（e、h和k），结合Cy2偶联驴抗鼠抗体，显示小鼠单克隆抗HA抗体。在玻璃室板表面上方3.0μm处调整焦距。右列表示左图像和中间图像（c、f、i和l）的合并。图1中的箭头表示帕罗西汀与ARF6共定位的区域。棒材，20μm。在没有AlF处理的情况下，这些野生型HA-ARF蛋白的表达对paxillin的亚细胞定位没有显著影响（我们未发表的数据）：比较见图3B（b），了解paxillin在未经AlF处理细胞中的亚细胞分布。
图6
图6
PAG3的过度表达，而不是其GAP-非活性突变体，抑制了局部接触者对帕西林的募集。通过钙沉淀法将编码EGFP标记的PAG3（a和b）或CA突变体（c和d）的质粒瞬时转染COS-7细胞。然后固定细胞，分别如图4和图3所示显示EGFP-PAG3（a和c）和内源性帕罗西汀（b和d）。将焦点调整到玻璃室板表面上方0.5μm处，以可视化焦点接触。右栏与左栏的字段相同，箭头表示表达EGFP-PAG3蛋白的细胞。棒材，20μm。
图7
图7
PAG3的过度表达，而不是其GAP-非活性突变体，降低了细胞迁移活性，但对细胞粘附活性没有显著影响。用编码EGFP标记的PAG3（WT）或CA突变体（CA）的质粒瞬时转染COS-7细胞或U937细胞，或进行无质粒DNA的转染程序（Mock）。用TPA处理U937细胞3天。通过胰蛋白酶化收集细胞，然后按照材料和方法中的描述，在不含血清的情况下，对胶原蛋白（Col）、纤维连接蛋白（FN）或玻璃体凝集素（VN）进行结合迁移试验（A）或粘附试验（B）。BSA涂层作为阴性对照。通过计数EGFP荧光阳性的细胞计数移植后30分钟粘附的转染细胞，并通过计数膜底面EGFP阳性细胞计数3小时内迁移的细胞。按照材料和方法中的描述计算细胞粘附和迁移的百分比。每个条形代表三次试验的平均值±SEM。A中的插入物是抗GFP抗体免疫印迹，显示这些实验中使用的COS-7细胞中EGFP标记的PAG3（WT）或CA突变体（CA）的表达水平。EGFP标记的PAG3蛋白的表达高于内源性PAG3的10–20倍（我们的未发表数据）。
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    1. Andreev J、Simon JP、Sabatini DD、Kam J、Plowman G、Randazzo PA、Schlessinger J。具有Arf-GAP活性的新Pyk2靶蛋白的鉴定。分子细胞生物学。1999年；19:2338–2350.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Balch WE、Kahn RA、Schwaninger R.ADP-核糖基化因子是内质网和顺高尔基室之间的囊泡转运所必需的。生物化学杂志。1992;267:13053–13061.-公共医学
    1. Boman AL和Kahn RA。Arf蛋白：膜交通警察？生物化学科学趋势。1995;20:147–150.-公共医学
    1. Bonifacino JS、Suzuki CK、Lippincott-Schwartz J、Weissman AM、Klausner RD。新合成T细胞抗原受体链的前高尔基降解：内在敏感性和亚单位组装的作用。细胞生物学杂志。1989;109:73–83.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Brown HA、Gutowski S、Moomaw CR、Slaugter C、Sternweis PC。ADP-核糖基化因子是一种依赖GTP的小调节蛋白，刺激磷脂酶D活性。细胞。1993年；75:1137–1144.-公共医学

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