跳到主页面内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https公司

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.1999年8月；19(8):5363-72.
doi:10.1128/MCB19.8.5363。

作为人类雌激素受体α激活功能1特异性转录辅激活物的p68 RNA解旋酶的纯化和鉴定

H恩多 1, K丸山, Y Masuhiro先生, Y小林, M转到, H台, 柳泽J, D梅茨格, S桥本, S加藤
附属公司

p68RNA解旋酶的纯化和鉴定作为人类雌激素受体α激活功能1特异性转录辅激活因子

H恩多等。 分子细胞生物学. 1999年8月.

缩回

摘要

雌激素受体（ER）以配体依赖的方式调节靶基因的表达。ER的配体依赖性激活功能AF-2位于配体结合域（LBD），而N末端A/B域（AF-1）在与LBD分离时以配体依赖的方式发挥作用。AF-1和AF-2表现出细胞类型和启动子上下文特异性。此外，通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化Ser（118）残基，增强了人ERalpha（hERalpha）的AF-1活性。我们从MCF-7细胞中纯化并克隆了一个68-kDa蛋白（p68），该蛋白与a/B结构域相互作用，但不与hERalpha的LBD相互作用。hERalpha-Ser（118）的磷酸化增强了与p68的相互作用。我们证明，p68以细胞类型特异的方式增强AF-1的活性，但不增强AF-2的活性，以及雌激素诱导的全长ERalpha的抗雌激素诱导的转录活性。然而，它并没有增强ERbeta、雄激素受体、视黄酸受体α或盐皮质激素受体的AF-1或AF-2。我们还表明，先前归因于p68的RNA解旋酶活性对于ERalpha AF-1辅激活剂活性是不必要的，并且p68在体外与CBP结合。此外，ERalpha A/B结构域中p68的相互作用区域对hERalpha-AF-1的全部活性至关重要。综上所述，这些发现表明p68作为ERalpha AF-1的特异性辅活化子发挥作用，并强烈表明p68和hERalpha-a/B结构域之间的相互作用受MAPK诱导的Ser磷酸化调节（118）。

PubMed免责声明

数字

图1
图1
MCF-7细胞hERαA/B结构域结合蛋白的检测。（A） 使用hERα（显示区域A至F）和GST-ER融合蛋白。（B） MCF-7细胞中与hERαA/B结构域结合的蛋白质。等分的35在1μM和10μM条件下，将S标记的MCF-7核提取物与单独装载GST的谷胱甘肽-脑葡萄糖珠、GST-HE15、GST-HE15/458、GST-HE15/457或GST-LBD在无E2或有E2的情况下孵育。结合蛋白经SDS-PAGE（5至20%聚丙烯酰胺梯度凝胶）后进行放射自显影。开口箭头表示68kDa蛋白质的位置。尺寸标记以千道尔顿表示。实心箭头表示SRC-1/TIF2 160-kDa家族蛋白质的位置（9，14）。
图2
图2
人类p68 RNA解旋酶蛋白的氨基酸序列。通过微测序确定的五个序列下划线，并与报告的p68 RNA解旋酶蛋白完全匹配（GenBank登录号X15729和X52104）。核受体识别基序（LXXLL基序[15]）带有双下划线，DEAD框基序被装箱。
图3
图3
p68 RNA解旋酶转录物在正常人类组织（A）和癌细胞系（B）中的表达模式。如前所述进行Northern blot分析（43）。PBL，外周血白细胞。肿瘤细胞系如下：HL60，早幼粒细胞白血病细胞系；宫颈癌细胞系HeLa S3；慢性粒细胞白血病细胞系K562；Raji，Burkitt淋巴瘤细胞系；SW480，大肠腺癌细胞系；A549，肺癌细胞系；G361，黑色素瘤细胞系；乳腺癌细胞系MCF-7；乳腺癌细胞系T47D；前列腺癌细胞株LNCaP；骨肉瘤细胞系；卵巢癌细胞系；Ishikawa，子宫体癌细胞系；PC12，大鼠嗜铬细胞瘤细胞系。使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（G3PDH）转录物作为内部对照。RNA标记的相对位置（以千碱基为单位）显示在面板B的右侧。
图4
图4
重组p68 RNA解旋酶在体外特异性结合hERαA/B结构域。（A） p68仅与hERαA/B结构域相互作用，而不与LBD相互作用，与E2的存在无关。通过SDS-PAGE（5至20%聚丙烯酰胺梯度凝胶）分析体外翻译的p68 RNA解旋酶重组蛋白（左面板，第1通道）。将固定在小球上的GST-ER融合蛋白与15μl p68的体外翻译反应混合物混合；在输入通道上加载2μl平移反应混合物。如前所述（39），SRC-1仅在E2（右侧面板；车道4）存在的情况下与hERαLBD相互作用。开放箭头表示p68 RNA解旋酶蛋白的位置，实心箭头表示SRC-1蛋白的位置。（B） 通过替换Ser增强p68的交互作用118细菌表达的GST融合蛋白中含有Glu（S118E）的残基[GST-HE15/458]。（C） MAPK对hERαA/B结构域的磷酸化增加了其与p68的结合。GST-HE15或GST-HE15/457在30°C下与活化MAPK孵育0、15或30分钟，用作体外下拉试验的探针35S标记的p68蛋白。
图5
图5
p68与hERαA/B结构域相互作用，但不与体内LBD相互作用。在哺乳动物双杂交系统中，p68与hERαA/B结构域相互作用。将带有GAL4-p68融合蛋白和VP16-ER融合蛋白（VP16-HE15和VP16-LBD）的哺乳动物双杂交系统用于COS-1细胞。COS-1细胞与1μg GAL4-DBD、GAL4-p68、VP16-HE15或VP16-LBD在E2（10−7M） 以及2μg 17M2G-CAT报告质粒。仅在p68和hERαA/B结构域之间检测到显著的相互作用。
图6
图6
p68通过AF-1增强hERα的配体诱导反式激活功能。（A） p68增强hERα的AF-1，但不增强AF-2。COS-1细胞与0.40μg HE15-GAL（AF-1）、LBD-GAL（AF-2）或HEGO（AF-1+AF-2）（26）共转染，并与0、0.3或0.6μg pSG5-p68在E2（10）存在或不存在的情况下共转染−7M） ，以及2μg 17M2G-CAT或2μg ERE-g-CAT（仅适用于HEGO）。p68增强配体诱导的全长hERα和AF-1的反式激活，但不增强E2激活的AF-2。（B） p68对hERβ的反式激活功能（AF-1和AF-2）无影响。（C） p68增强COS-1细胞中的hERαAF-1活性，但不增强HeLa细胞中的活性。（D） p68对其他核受体的AF-1活性没有影响。（E） p68增强在血清中磷酸化的hERαAF-1118残留物。将COS-1细胞与HE15-GAL或HE15/457-GAL以及0、0.3或0.6μg的pSG5-p68和2μg的17M2G-CAT共转染。（F） p68不影响hERαA/B结构域的表达水平。用0.40μg HE15-GAL和0、0.15、0.3或0.6μg pSG5-p68转染COS-1细胞。Western blot分析表明，表达的嵌合蛋白量不受p68表达的影响。开口箭头表示蛋白质的位置。
图7
图7
p68增强OHT诱导的hERα的反式激活功能，但不增强ICI的反式激发功能。用0.40μg HEGO和2μg ERE-g-CAT以及0、0.3或0.6μg pSG5-p68共同转染COS-1细胞，并用100 nM E2、OHT或ICI处理。
图8
图8
hERαAF-1的辅激活子活性不需要p68的RNA解旋酶活性。（A） hERαA/B结构域的p68相互作用域对hERαAF-1的p68辅活化子活性至关重要。显示了用于体外GST下拉分析（中间面板）和瞬时表达分析（右侧面板）的p68缺失突变体的表示。35用GST-HE15蛋白作为探针对S标记的p68突变体进行了检测，结果表明ATP结合域和DEAD盒基序的区域（aa 300至400）是与hERαa/B域直接相互作用所必需的。在瞬时表达试验中测定p68缺失突变体的辅活化子活性。用0.40μg HE15-GAL、2μg 17M2G-CAT和0.6μg p68突变表达载体共同转染COS-1细胞。显示了三个独立实验中p68突变体对AF-1活性的平均诱导倍数。（B） p68的hERαA/B结构域的相互作用区域是p68增强AF-1活性所必需的。显示了用于体外GST下拉分析（中间面板）和瞬时表达分析（右侧面板）的hERαA/B结构域缺失突变体的表示。35用GST融合的A/B结构域缺失突变蛋白作为探针对S标记的p68进行分析，表明A/B结构区中的区域（aa 56至127）是直接p68结合所必需的。在瞬时表达试验中测定了A/B结构域缺失突变体p68的辅激活子活性。将0.40μg A/B缺失突变体-plus-GAL（pM-A/B-Ms）与2μg 17M2G-CAT和0.6μg p68表达载体共同转染COS-1细胞。显示了三个独立实验中p68对AF-1活性的平均诱导倍数。（C） 对RNA解旋酶活性至关重要的ATP结合域发生突变的p68突变仍然增强hERαAF-1。ATP结合域和DEAD框基序分别由实心框和阴影框表示。在解旋酶中高度保守的氨基酸残基（AXXGXGKT）被装箱。星号表示被替换的氨基酸。用0.40μg pM-HE15和2μg 17M2G-CAT以及0、0.3或0.6μg p68突变表达载体共同转染COS-1细胞。野生型p68和p68的K144R突变体均增强了hERαAF-1的活性。（D） p68与CBP结合。为了测试p68和CBP之间的结合，将GST控制蛋白、GST-p68N（aa 1至387）融合蛋白或GST-p68 C（aa 388至614）融合蛋白固定在小球上，并与15μl体外CBP翻译反应混合物混合。结合蛋白用SDS-PAGE分析。在体外翻译的CBP与GST融合的p68N和p68C结合，但不与GST控制蛋白结合。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Ali S，Metzger D，Bornert J M，Chambon P。人类雌激素受体A/B区域的配体依赖性磷酸化对转录激活的调节。EMBO J.1993；12:1153–1160.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Anzick S L、Kononen J、Walker R L、Azorsa D O、Tanner M M、Guan X Y、Sauter G、Kallioniemi O P、Trent J M、Meltzer P S.AlB1，一种在乳腺癌和卵巢癌中扩增的类固醇受体辅激活剂。科学。1997;277:965–968.-公共医学
    1. Aronica S M，Katzenellenbogen B S.雌激素、环磷酸腺苷和胰岛素样生长因子-I刺激雌激素受体介导的大鼠子宫雌激素受体磷酸化状态的转录和改变。分子内分泌。1993;7:743–752.-公共医学
    1. Baniahmad A，Ha L，Reinberg D，Tsai S，Tsai-M-J，O’Malley B。人类甲状腺激素受体β与转录因子TFIIB的相互作用可能通过甲状腺激素介导靶基因的去表达和激活。美国国家科学院院刊1993；90:8832–8836.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Beato M，Herrlich P，Schutz G.类固醇激素受体：许多演员在寻找情节。单元格。1995;83:851–857.-公共医学

出版物类型

MeSH术语

LinkOut-更多资源