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miR-27a和miR-27b通过靶向PTEN诱导的假定激酶1（PINK1）调节受损线粒体的自噬清除

分子神经退行性疾病 体积 11，物品编号：55(2016)引用这篇文章

摘要

背景

功能丧失突变粉红色1和停车场是常染色体隐性遗传帕金森病（PD）最常见的病因。PINK1是一种线粒体丝氨酸/苏氨酸激酶，在线粒体吞噬（受损线粒体的选择性自噬清除）中起着关键作用。越来越多的证据表明线粒体功能障碍是PD发病的核心机制之一。因此，确定PINK1表达的调控机制可能会为PD提供新的治疗机会。虽然已经广泛研究了PINK1在线粒体损伤后的翻译后稳定作用，但对PINK1在转录或翻译水平上的调控机制知之甚少。

结果

在这里，我们证明了microRNA-27a（miR-27a）和miR-27b通过直接结合其mRNA的3′-非翻译区（3′UTR），在翻译水平上抑制PINK1的表达。重要的是，我们的数据表明，PINK1的翻译对其在线粒体损伤时的积累至关重要。线粒体损伤后PINK1的积累受到miR-27a和miR-27b表达水平的强烈调节。miR-27a和miR-27b通过抑制PINK1的表达来防止线粒体吞噬内流，这可以通过减少受损线粒体中的泛素磷酸化、Parkin易位和LC3-II积累来证明，如受损线粒体向溶酶体传递的减少和线粒体标记物细胞色素c氧化酶2（COX2）的降解所示。此外，我们的数据表明，在慢性有丝分裂流下，miR-27a和miR-27b的表达显著诱导，这表明PINK1介导的有丝分裂与miR-27a-miR-27b+之间存在负反馈调节。

结论

我们证明miR-27a和miR-27b调节PINK1的表达和受损线粒体的自噬清除。我们的数据进一步支持了一种新的负调控机制，即miR-27a-miR-27bPINK1-介导的线粒体吞噬。因此，我们的结果大大提高了我们对PINK1表达和有丝分裂调节的理解，并表明miR-27a和miR-27b可能是PD的潜在治疗靶点。

背景

帕金森氏病（PD）是第二常见的神经退行性疾病，临床表现为运动迟缓、静止性震颤、僵硬和姿势不稳等运动症状[1]。PD的病理特征是黑质多巴胺能神经元的丢失致密部（序号）[1]。一些遗传危险因素的识别使我们对帕金森病发病机制的理解有了重大进展。迄今为止，一些基因的突变，例如SNCA（α-突触核蛋白）、富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2）、DJ-1、PARK2（PARKIN）、，和PTEN诱导的假定激酶1(粉红色1) [1]，已被证明可导致家族性早发性帕金森病，占所有病例的5-10%[2].

越来越多的证据表明线粒体功能障碍是PD发病的核心机制[三]。例如，线粒体毒素，如MPTP和鱼藤酮，会在动物模型和人类中诱发帕金森综合征[4]。此外，老年和帕金森病患者SN线粒体DNA损伤增加[5,6]。此外，PD患者SN中复合物I的活性降低[7,8]。因此，更好地了解线粒体在损伤后是如何保持完整性和功能的，可能为PD治疗提供新的机会。

中的突变停车场和粉红色1是常染色体隐性遗传PD的主要病因[9,10]。它们一起通过自噬降解（称为线粒体吞噬），在功能上调节应激激活的受损线粒体的选择性清除[11]支持线粒体质量控制缺陷可能是PD发病机制的核心机制这一观点。PINK1是一种线粒体丝氨酸/苏氨酸激酶，在正常生理条件下维持在低水平。线粒体损伤后，PINK1在受损线粒体上迅速稳定，导致胞质Parkin移位至受损线粒体[11–13]。PINK1通过在Ser65磷酸化激活Parkin。一旦激活，E3泛素连接酶Parkin通过泛素化多个线粒体蛋白，选择性标记受损线粒体以进行线粒体吞噬清除[14,15]。最近，一些研究小组发现PINK1也磷酸化Ser65（pUb）的泛素第65系列)泛素的PINK1依赖性磷酸化是Parkin移位和激活启动有丝分裂所必需的[16–18]。此外，pUb第65系列已被认为与线粒体应激、年龄和疾病有关[19]并作为自噬受体识别的特定信号[20,21]。因此，pUb的积累第65系列是线粒体应激/损伤的标志。除了在有丝分裂中的作用外，越来越多的证据表明PINK1和Parkin对各种损伤都具有神经保护作用，例如氧化应激和与PD-相关的毒素，尽管其潜在机制仍不清楚[22,23].

鉴于其在线粒体内稳态和神经保护中的关键作用粉红色1表达受到监管一直在进行深入调查。虽然PINK1在翻译后水平上的调控已经被广泛研究[24]PINK1在转录或翻译水平上的调控机制尚不清楚。microRNAs（miRNAs）作为蛋白质编码基因的关键调节因子，越来越受到人们的关注[25,26]。小的非编码miRNA，约22个核苷酸，通过Drosha、核糖核酸酶III型（Drosha）和Dicer 1、核糖核酸酶III型复合物（DICER1）的顺序裂解从初级转录物中生成[27]。miRNAs通过与同源信使RNA（mRNAs）结合来调节其靶基因的表达，从而导致翻译抑制[27]。到目前为止，一些miRNAs被确定为PD-相关基因的调节器，例如SNCA公司,LRRK2型、和DJ-1型[28–31]。然而，miRNAs对人类PINK1转录后的调控尚不明确。

在这里，我们发现了miR-27a/b通过靶向其3′UTR对PINK1的一种新的调节机制。我们证明miR-27a和miR-27b抑制PINK1的稳定，从而阻止受损线粒体的自噬降解。

结果

PINK1的表达受miRNAs调控

粉红色1mRNA（NM_032409）有一个长的3′UTR，约840个核苷酸，这增加了其表达可能受到miRNA调控的可能性，miRNA通常以3′UTR-序列为靶点。成熟的miRNAs通过并入由精氨酸（AGO）和其他几个伙伴组成的RNA诱导沉默复合物（RISC）与靶mRNAs结合[32]。为了确定PINK1的表达是否受到miRNAs的调节，我们首先评估了人类粉红色1在HeLa细胞中使用AGO-特异性RNA免疫沉淀法，mRNA与RISC复合物相关（图1a个). AGO2-结合的miRNA/mRNA复合物首先用AGO特异性抗体拉下。非特异性IgG作为阴性对照。粉红色1然后用qRT-PCR分析mRNA水平。抗AGO抗体的下拉导致粉红色1mRNA水平与对照IgG相比，而AGO2公司siRNA敲除显著减少粉红色1抗AGO抗体降低mRNA水平（图1亿,c（c）). 接下来我们测试了是否通过DICER1标准敲除会影响PINK1蛋白水平。正如预期，DICER1标准敲除降低了HeLa细胞中miRNA的水平（附加文件1). 与阴性对照相比，DICER1标准siRNA敲除显著增加HeLa细胞中PINK1蛋白水平（图1天,e（电子）). 总之，我们的数据表明人类PINK1的表达受miRNAs调控。

图1
图1

miRNA对PINK1的调节。一AGO-特异性RNA免疫沉淀分析示意图。b条,c（c） 粉红色1mRNA与miRNA/RISC复合物相关。HeLa细胞转染50 nM AGO2 siRNA或阴性对照。转染48小时后，用2A8抗AGO2抗体或非特异性IgG抗体从细胞裂解液中提取AGO2-结合mRNA。粉红色1然后用qRT-PCR测定mRNA水平。抗AGO2的siRNA作为AGO-特异性RNA免疫沉淀分析的质量控制。粉红色1mRNA水平以第1组的百分比进行量化(n个 = 6，双向方差分析）。d日,e（电子）击倒DICER1标准PINK1蛋白水平增加。用50nM转染HeLa细胞DICER1标准siRNA（DICER1 KD）或阴性对照（Ctl）。转染后48小时，收集细胞进行Western blot。箭头表示全长PINK1带，星号表示非特定带。将每个蛋白质水平归一化为相应的GAPDH水平，并量化为对照的百分比(n个 = 4,t吨-测试）。数值为平均值 ± SEM（n.s.=不显著**第页 < 0.01***第页 < 0.001)

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miR-27a/b通过直接靶向PINK1 mRNA的3′UTR抑制PINK1的表达

为了确定直接调节PINK1表达的潜在miRNAs，我们首先搜索在人类3′UTR中具有假定结合位点的miRNAs粉红色1如前所述，利用几种miRNA-靶点预测算法进行mRNA表达[33]。在几个候选序列中，我们重点关注miR-27a和miR-27b（以下简称miR-27a/b），因为1）miR-27b/b通常由几种算法预测，在人类3′UTR中具有种子匹配序列粉红色1mRNA（图2a个和其他文件2a） ，2）miR-27a/b在人中脑序列号中表达（附加文件2a）[34–36]，3）miR-27a/b在人3′UTR中有多个推测的结合位点粉红色1低结合自由能mRNA（附加文件2b）[37]。值得注意的是，miR-27a/b的3′UTR的两个假定结合位点粉红色1mRNA在灵长类动物（如人类、黑猩猩和猴子）中保存良好，但在啮齿动物（如大鼠和小鼠）中不存在（附加文件三)，增加了miR-27a/b对PINK1表达进行灵长类特异性调节的可能性。

图2
图2

miR-27a/b抑制人类PINK1的表达。一人类3′UTR中miR-27a/b保守靶点示意图粉红色1mRNA。种子序列用红色表示。星号（*）表示保守核苷酸。b条荧光素酶报告质粒示意图。报告构建体包含人的全长3′UTR粉红色1下游野生型（WT）或突变型（Mut）种子匹配位点的mRNA雷尼利亚荧光素酶基因。c（c）miR-27a/b的过度表达降低了HeLa细胞中的荧光素酶活性。用miR-27a/b或阴性对照（Ctl）转染细胞，并按指示转染报告体。转染后48小时，测量荧光素酶活性(n个 = 4，单向方差分析）。雷尼利亚荧光素酶活性标准化为相应的萤火虫荧光素酶活性。d日-克miR-27a/b的过度表达降低了HeLa（D-E）和M17细胞（F-G）中PINK1蛋白的水平。用miR-27a/b或阴性对照（Ctl）转染细胞。转染后48小时，收集细胞进行Western blot(n个 = 4,t吨-测试）。将PINK1蛋白水平标准化为相应的GAPDH水平，并定量为对照的百分比。数据显示为控制百分比。数值为平均值 ± SEM（n.s.=不重要**第页 < 0.01***第页 < 0.001)

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为了确定miR-27a/b是否通过靶向其3′UTR直接抑制PINK1的表达，我们使用包含人类全部3′UTRs的报告构建物进行了荧光素酶分析粉红色1荧光素酶mRNA下游（图2亿). miR-27a/b显著抑制HeLa细胞中荧光素酶的表达（图2厘米). 与野生型相比，种子匹配位点1或位点2的突变显著增加了荧光素酶活性（图2厘米). 此外，两个种子配对位点（Mut 1和2）的联合突变完全消除了miR-27a/b介导的荧光素酶活性降低，表明两个种子匹配位点都具有功能（图2厘米). miR转染组之间miR-27a和miR-27b的表达水平没有差异（附加文件4). 为了确定miR-27a/b是否影响PINK1蛋白水平，我们首先将合成的miR-27a、miR-27b或阴性对照转染到人类HeLa细胞（附加文件5a） ●●●●。miR-27a/b的过度表达显著降低了HeLa细胞中PINK1蛋白的水平（图。二维,e（电子）). miR-27a和miR-27b的联合使用并没有进一步降低HeLa细胞中PINK1的水平，这表明miR-27a和miR-28b都靶向HeLa 3′UTR的同一位点粉红色1mRNA（附加文件6). 为了评估miR-27a/b在另一种细胞类型中的作用，我们测试了M17细胞。miR-27a/b还抑制了人类多巴胺能样M17细胞中PINK1的表达（图第2页,克).

接下来，我们检查内源性miR-27a/b是否调节PINK1的表达。为了抑制miR-27a/b功能，我们使用了基于锁定核酸（LNA）的抗miR，即与靶miRNAs互补的抗核酸单链反义寡核苷酸[38]。由于miR-27a和miR-27b成熟序列的高度相似性，单个抗-miR（表示为抗-miR-27a/b）同时抑制miR-27a和miR-27 b（图3a年和其他文件5b） ●●●●。内源性miR-27a/b的抑制显著增加了WT报告体的荧光素酶活性粉红色13′UTR，而两个种子匹配位点的联合突变阻断了抗miR-27a/b介导的HeLa细胞荧光素酶活性诱导（图3亿). 此外，内源性miR-27a/b的抑制显著增加了HeLa细胞和M17细胞中PINK1蛋白的水平（图3立方厘米-（f）). 总的来说，这些数据表明miR-27a/b通过直接靶向其mRNA的3′UTR来抑制人类PINK1的表达。

图3
图3

内源性miR-27a/b功能的抑制增加了人类PINK1的表达。一miR-27a/b和抗miR-27b/b序列比对示意图。星号（*）表示保守核苷酸。b条抑制内源性miR-27a/b功能可增加HeLa细胞中的荧光素酶活性。用含有人全长3′UTR的报告体转染细胞粉红色1下游野生型（WT）或突变型（Mut）种子匹配位点的mRNA雷尼利亚萤光素酶基因。转染后48小时，检测荧光素酶活性(n个 = 4,t吨-测试）。c（c）-（f）抑制内源性miR-27a/b可增加HeLa（C-D）和M17细胞（E-F）中PINK1蛋白的水平。用150 nM抗miR-27a/b或抗对照（抗-Ctl）转染细胞。转染后48小时，收集细胞进行Western blot。PINK1蛋白水平归一化为相应的GAPDH水平，并量化为对照组的百分比(n个 = 4,t吨-测试）。数据显示为控制的百分比。数值为平均值 ± SEM（n.s.=不重要**第页 < 0.01***第页 < 0.00)

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PINK1翻译对于线粒体损伤后PINK1的积累是必不可少的

PINK1蛋白在健康线粒体中被线粒体蛋白酶快速、组成性地降解，而线粒体损伤使PINK1积聚在受损线粒体的外膜上[39]。然而，还没有很好地确定转录和/或翻译步骤粉红色1可能有助于线粒体损伤后PINK1蛋白的积累。鉴于PINK1蛋白的基础水平较低，并且PINK1蛋白在线粒体损伤后迅速积累，我们假设PINK1mRNA的新合成以及翻译后的稳定可能有助于PINK1在线粒体损伤时的积累。因此，我们首先检查了PINK1 mRNA水平是否因线粒体损伤而改变。PINK1 mRNA水平不受羰基氰化物间氯苯腙（CCCP，线粒体解偶联剂）或寡霉素（ATP合酶抑制剂）和抗霉素（线粒体呼吸链复合物抑制剂III）联合诱导HeLa细胞线粒体损伤的影响（图4a类). 值得注意的是，用环己酰亚胺（CHX）阻断翻译完全消除了CCCP对PINK1蛋白的积累（图4b个,c（c）). 综上所述，这些数据表明PINK1翻译对线粒体损伤后PINK1的积累至关重要。

图4
图4

PINK1翻译对于线粒体损伤后PINK1的积累至关重要。一 粉红色1线粒体损伤未改变mRNA水平。HeLa细胞与10μM CCCP或10μM寡霉素和4μM抗霉素联合培养2 h，然后，粉红色1用qRT-PCR测定mRNA水平。粉红色1mRNA水平标准化为相应的GAPDH公司并量化为控制百分比(n个 = 8,t吨-测试）。b条,c（c）CCCP处理后PINK1的积累与翻译有关。HeLa细胞首先与100μM环己酰亚胺（CHX）预培养2 h，然后清洗。细胞与10μM CCCP（含或不含CHX）进一步孵育2小时(n个 = 4，双向方差分析）。数值为平均值 ± SEM（n.s.=不重要***第页 < 0.001)

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miR-27a/b抑制线粒体损伤后PINK1的积累

由于miR-27a/b在翻译水平上抑制PINK1的表达，我们接下来研究了miR-27a/b是否影响线粒体损伤时PINK1的积累。与阴性对照组相比，经CCCP治疗后，miR-27a/b介导的PINK1抑制显著减少了PINK1的积累（图5a级,b条)与阴性对照组相比，miR-27a/b的抑制进一步增加了PINK1的积累（图5厘米,d日). 此外，在寡霉素和抗霉素联合治疗时，miR-27a/b对PINK1的积累也有类似的影响（图5a级-d日). 总之，我们的数据表明，线粒体损伤后PINK1的积累受到miR-27a和miR-27b表达水平的强烈调节。

图5
图5

miR-27a/b抑制线粒体损伤后PINK1的积累。一,b条miR-27a/b的过度表达抑制了线粒体损伤时PINK1的积累。转染后48 h，用10μM CCCP或10μM寡霉素和4μM抗霉素联合处理HeLa细胞2 h(n个 = 4，双向方差分析）。c（c）,d日CCCP处理后，内源性miR-27a/b的抑制增加了PINK1的积累。(n个 = 4，双向方差分析）。将PINK1水平标准化为相应的GAPDH水平，并量化为对照的百分比。数值为平均值 ± SEM（n.s.=不重要*第页 < 0.05, **第页 < 0.01***第页 < 0.001)

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miR-27a/b防止线粒体损伤时磷酸-泛素的积累

最近的研究表明，PINK1在Ser65（pUb）磷酸化泛素第65系列)线粒体损伤[16–18]。PINK1泛素磷酸化在Parkin的活化和线粒体易位中起着关键作用[16–18]。我们还观察到pUb第65系列CCCP显著增加了pUb的水平，PINK1的过度表达进一步增加了pU的表达第65系列CCCP在HeLa细胞中的积累（图第6页). 然而，PINK1的过度表达并不影响pUb第65系列未经CCCP处理的基础条件下的水平（图第6页)这表明PINK1的泛素激酶活性在线粒体损伤时被特异性激活。

图6
图6

miR-27a/b防止pUb第65系列线粒体损伤后的积累。一,b条PINK1过度表达增加pUb第65系列仅当与CCCP孵育时，HeLa细胞中的积累。转染后48小时，细胞与10μM CCCP孵育2小时，pUb第65页水平通过Western blot测定(n个 = 3，双向方差分析）。c（c）,d日miR-27a/b的过度表达抑制了pUb第65系列CCCP在HeLa细胞中的积累(n个 = 4、双向方差分析）。e（电子）,（f）抑制内源性miR-27a/b增加pUb第65系列CCCP在HeLa细胞中的积累(n个 = 4，双向方差分析）。PINK1水平归一化为相应的GAPDH水平，并量化为对照组的百分比。数值为平均值 ± SEM（n.s.=不重要**第页 < 0.01***第页 < 0.001)

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与这些数据一致，miR-27a/b的过度表达抑制了pUb的积累第65系列CCCP治疗后与阴性对照组比较（图第6页c,d日)而miR-27a/b的抑制进一步增加了pUb第65系列与阴性对照组相比，CCCP存在时的水平（图第六版,（f）). 相反，pUb第65系列在没有CCCP治疗的基础条件下，miR-27a/b的过度表达或抑制都不会影响其水平（图第6页c-（f）). 综上所述，我们的数据表明miR-27a/b可以阻止pUb的积累第65系列抑制线粒体损伤粉红色1表达式。

miR-27a/b在线粒体损伤时防止Parkin易位到线粒体

细胞溶质Parkin依赖PINK1向受损线粒体的易位是有丝分裂的先决条件[11]。为了确定miR-27a/b是否能阻止Parkin在线粒体损伤时的移位，我们将miR-27b/b或阴性对照转染到稳定表达Parkin的HeLa细胞。CCCP诱导线粒体损伤2 h后，从总细胞裂解物中分离线粒体部分，然后用Western blot分析（图第7页). 与阴性对照组相比，在CCCP治疗后，miR-27a/b强烈抑制Parkin向线粒体的移位以及LC3（LC3-II）活性形式的积累，LC3是一种自噬标记物（图第7页,b条).

图7
图7

miR-27a/b可防止线粒体损伤时Parkin易位至线粒体。一,b条转染后48 h，HeLa细胞与10μM CCCP孵育2 h。分离线粒体富集组分后，通过Western blot检测Parkin易位和LC3-II。将每个蛋白质水平归一化为相应的线粒体负荷控制（SOD2）水平，并量化为控制百分比(n个 = 3，双向方差分析）。通过监测p38胞质和VDAC1线粒体标记物来评估线粒体部分的纯度。PN；核后，C；细胞质，M；线粒体（A）。c（c）,d日转染48小时后，通过GFP、线粒体标记物（TOM20）抗体和核染料（Hoechst）观察到稳定表达GFP-Parkin的HeLa细胞。比例尺对应10μm。Parkin易位被量化为细胞质与核GFP信号的比率，所得比率被标准化为对照。数据收集自4个独立重复（n > 1000个单元格），并显示为控件的百分比。数值为平均值 ± 扫描电镜(*第页 < 0.05, **第页 < 0.01***第页 < 0.001)

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为了证实miR-27a/b对Parkin易位影响的生化分析，我们还通过高含量成像定量了Parkin的易位。转染阴性对照或miR-27a/b后，用CCCP处理表达GFP-Parkin的HeLa细胞2小时，用核染料染色并成像。如前所述，通过评估细胞质和核GFP信号的比率来测量Parkin易位[40]。与阴性对照组相比，miR-27a/b过表达显著降低了与线粒体标记TOM20共定位的Parkin水平（图第7页c,d日). 综上所述，我们的数据表明miR-27a/b通过抑制PINK1的表达阻止了有丝分裂的诱导。

miR-27a/b抑制受损线粒体的溶酶体降解

受损线粒体通过PINK1和Parkin的组合选择性标记，然后输送至溶酶体进行水解降解[11]。因此，我们接下来使用线粒体靶向Keima（mtKeima）检测miR-27a/b是否抑制受损线粒体向溶酶体的传递[41]。Keima是一种源自珊瑚的荧光蛋白，对溶酶体蛋白酶具有抵抗力，并随着pH值的变化而改变颜色。mtKeima被设计成定位于线粒体，并在中性自噬体与酸性溶酶体融合后改变其颜色[41]。用阴性对照、PINK1 siRNA或miRNAs转染后，用CCCP处理表达mtKeima的HeLa细胞12小时并成像。如前所述，通过评估酸性和神经Keima信号的比率来测量受损线粒体的溶酶体递送[41]。作为检测的阳性对照，我们首先测试了PINK1敲除的效果。PINK1基因敲除显著降低了受损线粒体的溶酶体传递，验证了我们的分析性能（附加文件7a、 b）。miR-27a/b过度表达显著降低了受损线粒体的溶酶体传递（图第8页a,b条). 通过监测线粒体内膜蛋白COX2的降解，进一步评估受损线粒体的自噬清除率。与阴性对照miR相比，miR-27a/b抑制了线粒体损伤时COX2的降解（图8厘米,d日). 这两种独立的分析表明，miR-27a/b通过溶酶体抑制受损线粒体的自噬降解。

图8
图8

miR-27a/b通过溶酶体抑制线粒体损伤后的线粒体降解。一,b条miR-27a/b抑制受损线粒体向溶酶体的转运。转染48 h后，用CCCP或DMSO处理稳定表达mtKeima的HeLa细胞12 h。使用440/10nm（中性）和548/20nm（酸性）激发滤光片依次扫描细胞。比例尺对应100μm。酸性基团的信号强度除以中性基团的强度。数据是从12个独立的重复数据中收集的，以对照组（n > 300个细胞，双向方差分析）。c（c）,d日miR-27a/b抑制线粒体损伤时COX2的降解。转染后48 h，用10μM CCCP或DMSO处理HeLa细胞16 h。通过Western blot监测线粒体内膜蛋白COX2的水平来评估受损线粒体的降解(n个 = 4，双向方差分析）。数值为平均值 ± SEM（n.s.=不重要*第页 < 0.05, ***第页 < 0.001)

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慢性有丝分裂流条件下miR-27a/b的诱导

为了确定miR-27a/b和有丝分裂之间是否存在调节性相互作用，我们接下来检查了线粒体损伤后不同时间点miR-27b/b水平的变化。有趣的是，在慢性有丝分裂流条件下，HeLa细胞中miR-27a/b的水平显著增加（图第九章,b条). miR-27a和miR-27b由miR-23a产生 ~ 第27页 ~ 染色体19p13和miR-23b处的24–2簇 ~ 27亿 ~ 染色体9q22处分别为24–1簇（附加文件8a） ●●●●。miR-23a的成熟miRNAs ~ 第27页 ~ 已知24–2簇来自单个初级转录本[42]。miR-23b的miRNAs ~ 27亿 ~ 24-1簇独立转录，但受同一启动子调控[43]。因此，miRNAs在这些簇中的表达有望一起调节。与miR-27a/b相同，在慢性有丝分裂流条件下，miR-23a/b的水平也增加（附加文件8b、 c）。然而，这些簇中未包含的其他几种miRNA的水平没有变化（附加文件8d） ●●●●。这些数据表明，在慢性有丝分裂流下miRNA表达的变化并不是影响所有miRNA的一般非特异性现象。总之，miR-27a/b是有丝分裂的内源性抑制剂，在慢性有丝分裂流量下可能起到负反馈环的作用（图第9页c).

图9
图9

在慢性有丝分裂流条件下，miR-27a/b水平升高。一,b条HeLa细胞与二甲基亚砜、10μM CCCP或10μM寡霉素和4μM抗霉素的组合培养。miR-27a/b水平通过qRT-PCR测量并归一化为相应的U6型水平。数据显示为相对于DMSO控件的折叠变化。数值为平均值 ± 扫描电镜(t吨-测试**第页 < 0.01***第页 < 0.001).c（c）miR-27a/b在有丝分裂中的作用。慢性有丝分裂流时，miR-27a/b水平升高，miR-28a/b作为负反馈回路，关闭过多的有丝分裂流量。在诱导miR-27a/b表达后，PINK1 mRNA的翻译被miR-27b/b抑制。因此，线粒体中PINK1-蛋白的水平降低，从而抑制溶酶体对受损线粒体的自噬降解(左侧面板). 相反，当miR-27a/b介导的PINK1抑制被低水平的miR-27b/b解除时，PINK1-翻译和受损线粒体的溶酶体清除增加(右侧面板)

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讨论

线粒体在多种细胞功能中发挥关键作用，如能量生成、钙稳态和凋亡[44]。线粒体功能障碍被认为是多种疾病的关键因素，包括代谢性疾病和神经退行性疾病[44,45]。因此，维持线粒体内环境稳定对细胞功能和健康至关重要。在真核细胞中，线粒体的稳态是由线粒体质量控制系统维持的，线粒体质量控制是一个由分裂与融合、有丝分裂、转运和生物发生协调的动态过程[46].

PINK1在线粒体质量控制中起着关键作用，特别是在诱导有丝分裂中[39]。虽然已经广泛研究了PINK1在线粒体损伤后的翻译后稳定作用，但我们对PINK1在转录或翻译水平上的表达调控，特别是通过miRNAs的表达调控的了解仍然非常有限。在这里，我们证明miR-27a/b通过直接靶向其mRNA的3′UTR，通过翻译抑制负性调节人类PINK1。值得注意的是，我们的数据表明PINK1翻译对于线粒体损伤后PINK1-蛋白的积累至关重要。我们进一步证明，miR-27a/b对PINK1的翻译抑制抑制了溶酶体对受损线粒体的自噬清除。

我们的结果表明，在基础条件下，内源性PINK1水平受到miR-27a/b表达水平的积极调节。在基础条件下，内源性miR-27a/b的抑制显著增加了PINK1蛋白水平。这些数据表明，内源性miR-27a/b在维持PINK1蛋白水平低于有丝分裂诱导所需的阈值方面起着关键作用，因此可能保护细胞在基础条件下免受线粒体的不利损失。线粒体损伤后，miR-27a/b通过直接调节PINK1的表达来调节线粒体内流，表明miR-27b/b作为线粒体途径的门控者发挥作用。有趣的是，在慢性有丝分裂流条件下，miR-27a/b的表达显著增加。鉴于线粒体在细胞内稳态和能量代谢中的关键作用，线粒体的持续丢失将对细胞产生毒性。我们的数据表明，miR-27a/b可能在慢性线粒体自噬流量条件下发挥负反馈回路的作用，以保护细胞免受线粒体耗竭的影响。确定miR-27a/b的表达在基础条件和线粒体应激条件下是如何调节的，将为PINK1和有丝分裂的调控机制提供进一步的见解。

miRNAs作为许多细胞过程的关键调节因子，正受到越来越多的关注。到目前为止，只有少数miRNAs被证明可以调节有丝分裂。例如，miR-137通过靶向FUNC1和NIX抑制有丝分裂[47]。miR-320a通过靶向VDAC1促进有丝分裂[48]。miR-351和miR-125a也被认为调节有丝分裂[49]。这些研究表明，不同的miRNAs在多个水平上积极调节有丝分裂。在这项研究中，我们报道内源性miR-27a/b在PINK1表达中起关键作用，从而在有丝分裂中起关键性作用。因此，我们的研究有助于理解有丝分裂的调控机制，尤其是通过miRNAs。PINK1缺失与果蝇属提示PINK1在线粒体质量控制中的作用可能在进化上是保守的[50,51]。虽然PINK1的功能在进化过程中可能是保守的，但我们的研究表明miR-27a/b可能对PINK1和有丝分裂进行灵长类特异性调节。miR-27a和miR-27b由miR-23a产生 ~ 第27页 ~ 24–2和miR-23b ~ 27亿 ~ 分别为24–2簇。这些同源簇还产生miR-23a、miR-23b和miR-24。有趣的是，已知它们都能调节自噬相关基因。例如，miR-23a、miR-23b和miR-24抑制AMBRA1[52]，ATG12[53,54]和ATG4A[55]分别是。尽管ATG4A在线粒体自噬中的作用尚不清楚，但AMBRA1和ATG12正向调节线粒体自噬[56–58]。因此，我们很容易推测，这些簇中的miRNAs可能会协调其功能，以有效调节有丝分裂。

PINK1在人脑的神经元中广泛表达[59,60]。之前的几项研究表明miR-27a/b在人类中脑中表达[34–36]。因为我们证明内源性miR-27a/b调节人类多巴胺能样M17细胞中PINK1的表达，我们的研究提出了miR-27b/b可能调节人类中脑多巴胺能神经元中PINK1的表达的可能性。尽管PINK1在神经元有丝分裂中的作用存在争议[61]PINK1在线粒体运输、脊椎形态发生和神经元易受兴奋性毒性影响等方面也起着关键作用[23]。因此，需要进一步研究以确定miR-27a/b在人脑多巴胺能神经元中的作用。

最近的miRNA分析研究发现，帕金森病患者大脑受影响区域中有几种miRNA失调[35,36,62]。然而，这些研究之间存在显著差异，可能是由于方法上的差异以及样本人群、疾病分期和检查的脑分区的异质性。此外，这些研究中相对较小的样本量使得很难得出结论，即miR-27a/b和其他miRNAs在miR-23a中的表达是否存在 ~ 27个 ~ 24–2和miR-23b ~ 27亿 ~ 帕金森病患者的大脑中存在24-2簇失调。需要在PD不同阶段对不同脑细胞类型中miR-27a/b的表达进行更仔细的检查，以进一步了解miR-27b/b在PD发病机制中的假定作用。

结论

PINK1在基因上与帕金森病（PD）相关，在维持线粒体内环境稳定中起着关键作用。在本研究中，我们通过miR-27a和miR-27b在翻译水平确定了PINK1的一种新的调控机制。我们的研究强调，PINK1的蛋白质翻译步骤对线粒体损伤后PINK1的积累至关重要。因此，线粒体损伤后PINK1和线粒体吞噬通量的积累受到miR-27a和miR-27b表达水平的强烈调节。我们的结果代表了我们对miRNAs对PINK1表达和有丝分裂的翻译控制的理解的一个重大进展。

方法

细胞培养

人宫颈HeLa和多巴胺能样M17细胞在Dulbecco改良的Eagle’s培养基（DMEM，Invitrogen，11965084）或Opti-MEM I（Invitrogen，31985070）中生长，其中含有10%胎牛血清（FBS，Invit罗gen，16000044）和1%青霉素/链霉素，37°C，加湿5%CO2培养箱。合成miR-27a/b和阴性对照miR（目录#M-03-D）来自Insight Genomics。抗miR-27a/b（4101393–001）和抗阴性对照（199006–001）来自Exiqon。AGO2（E-004639-00-0005）、DICER1 siRNA（M-003483-00-0005。PINK1 siRNA（5′-GACGCTGTCCTCGTTATGAA-3′）来自于Qiagen。

定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）

根据制造商指南，使用TRIzol®试剂（Invitrogen）提取总RNA，并使用mRNA的高容量cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems）或miRNA的Mir-X™miRNA第一链合成试剂盒（Clontech）进行逆转录，Mir-27a/b除外。使用默认的热循环程序，使用Power SYBR Green PCR Master Mix、ABI 7500和ABI 7900（Applied Biosystems）进行定量PCR。粉红色1用PINK1正向引物：GGAGGAGTATCTGAGGCAG和反向引物：AACCCGGTGCTCTTTGTCAC测定mRNA水平。如前所述测量miR-27a/b水平[63]。所有其他miRNAs均使用成熟序列和通用反向引物。GAPDH公司和6号机组分别用作mRNA和miRNA的标准化对照。

AGO-特异性RNA免疫沉淀分析

如前所述进行RNA免疫沉淀分析[64]。简单地说，HeLa细胞转染50 nM AGO2 siRNA或阴性对照。转染48小时后，用2A8抗AGO2抗体从细胞裂解液中提取AGO2-结合mRNA。然后，使用TRIzol®试剂提取RNA，并通过qRT-PCR测量PINK1 mRNA水平。

荧光素酶检测

人类的整个3′UTR粉红色1mRNA（NM_0324091841-2660）被克隆到psiCHECK中TM（TM）-XhoI/NotI站点下游的2个矢量雷尼利亚荧光素酶。磅/平方英寸检查TM（TM）-2载体还包含用于正常化的组成性表达的萤火虫荧光素酶基因雷尼利亚荧光素酶活性。使用KOD-Plus-突变试剂盒（TOYOBO）在种子匹配位点引入突变。HeLa细胞以2.4的密度进行电镀 × 104转染前一天96-well板中每孔的细胞数。如图所示，用40 nM的miR-27a/b或阴性对照或150 nM的抗miR-27b/b或反对照以及40 ng荧光素酶报告载体转染细胞。转染后48小时，使用双球荧光素酶测定系统（Promega）测量荧光素素酶活性。

线粒体分离

如图所示，转染48小时后，用10μM CCCP处理细胞2小时，然后按照前面所述制备线粒体部分[65].

高含量成像和免疫荧光染色

为了量化Parkin易位，将40 nM miRNA转染到384孔成像板中稳定表达GFP-Parkin的HeLa细胞。转染后48 h，用10μM CCCP处理细胞2 h。然后将细胞固定在4%多聚甲醛中，用Hoechst 33342（Invitrogen）染色，并在BD Pathway 855系统上成像（Becton Dickinson Biosciences）。Parkin易位分析如前所述[40]。分析了4个独立转染孔，每个孔的总数为 > 每种条件1000个细胞。在BD通路上成像后，用线粒体标记物、线粒体外膜20同源物（酵母）转定位酶（Tom20）、抗Tom20抗体（Proteintech，11802-1-AP）对平板进行染色。使用配备ApoTome成像系统（蔡司）的蔡司AxioObserver，使用40倍平面彩色物镜拍摄共焦荧光图像。

为了分析线粒体降解，如前所述，对受损线粒体向溶酶体的递送进行可视化和量化[41]进行了一些修改。简单地说，40nM miRNA转染在384孔成像板中稳定表达线粒体靶向Keima（mtKeima）的HeLa细胞中。转染后48小时，用4μM CCCP处理细胞12小时。在BD Pathway系统中添加Hoechst 33342后，对细胞进行实时成像。在激光自动对焦后，通过2x2蒙太奇（无间隙）进行采集。中性和酸性Keima分别使用440/10nm和548/20nm激发滤波器。发射通过595 nm长通二色滤光片过滤。570nm和645/75nm发射滤光片分别用于中性和酸性Keima。使用内置的AttoVision V1.6软件处理原始图像。感兴趣区域（ROI）定义为细胞核和细胞质，在应用着色算法后，使用内置的“RING-2输出”分割Hoechst通道。细胞质中酸性基团的信号强度除以中性基团的强度。每个条件下分析12个孔，每个孔至少300个细胞。PINK1 siRNA被用作两种分析的阳性对照。

蛋白质印迹分析

如前所述进行蛋白质印迹[66]。在TBS/T（含0.125%吐温-20的Tris缓冲盐水）中用4%的非脂肪干乳封闭所有膜，pUb除外第65系列在TBS/T中用4%牛血清白蛋白（Jackson ImmunoResearch，001-000-173）封闭。在封闭缓冲液中用抗Dicer（Cell Signaling Technology，5362）、抗PINK1（Novus Biologicals，BC100-494）、抗SOD2（Abcam，ab13533）、抗VDAC1（Abcan，ab14734）、抗p38（Cell信号技术，9212）、，抗COX2（Abcam，ab110258）或抗GAPDH抗体（Santa Cruz，sc-25778）。pUb（磅）第65系列-如前所述，产生了特异性抗体并对其进行了表征[19].

统计分析

使用双尾Student’s进行统计分析t吨-测试两组的比较。根据Tukey的pot-hoc分析所示的比较变量，使用单向方差分析或双向方差分析测试（GraphPad Prism 5）对两个以上的多组进行比较。

缩写

AGO，Argonaute；羰基氰化物间氯苯腙；COX2，细胞色素c氧化酶2；骰子，骰子1，核糖核酸酶III型；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；绿色荧光蛋白；LRRK2，富含亮氨酸重复激酶2；miR-27a，microRNA-27a；miR-27b，microRNA-27b；miRNA，microRNA；ORF，开放式阅读框；聚丙烯酰胺凝胶电泳；帕金森病；PINK1、PTEN诱导的推定激酶1；定量实时聚合酶链反应；SNCA，突触核蛋白α；TOM20，线粒体外膜20同系物转定位酶（酵母）；UTR，非翻译区；VDAC1，电压相关阴离子通道1

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下载参考资料

致谢

我们感谢宫崎Atsushi Miyawaki（日本里根脑科学研究所）分享线粒体靶向Keima构建物。

基金

这项工作在一定程度上得到了梅奥诊所基金会（W.S）、万豪家庭基金会（WM）、郭士纳家庭职业发展奖（WM，神经科学重点研究团队奖（W.S.）、迈克尔·福克斯帕金森病研究基金会（W.S）、线粒体医学基金会（W.S.），NIH授予AG016574（J.K.）、AG005681（J.K）、AG028383（P.T.N）、NS085830（P.T.N:）和NS085070（W.S:）。F.C.F.是美国帕金森病基金会（APDA）的奖学金获得者。

支持数据的可用性

本文及其附加文件中包含支持本文结论的数据集。

作者的贡献

JK（Jaekwang Kim）和J.K.（Jungsu Kim）设计研究；JK（Jaekwang Kim）、FCF、PTN、WS和JK（Jungsu Kim）撰写了论文；JK（Jaekwang Kim）、FCF、KCB、RH、WW、CK、PTN、WS和JK（Jungsu Kim）进行了研究；JK（Jaekwang Kim）、WW和FCF分析了数据。所有作者阅读并批准了最终手稿。

作者信息

当前地址：CK，美国加利福尼亚大学格莱斯顿神经疾病研究所，旧金山94158，chaeyoung.kim@glastone.ucsf.edu; 路易斯安那州立大学新奥尔良健康科学中心研究生院KCB，krystalbelmonte@gmail.com。

竞争性利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

出版同意书

不适用。

伦理批准和同意参与

不适用。

作者信息

作者和附属机构

  1. 美国佛罗里达州杰克逊维尔圣巴勃罗南路4500号梅奥临床医学院神经科学系，邮编32224

    Jaekwang Kim、Fabienne C.Fiesel、Krystal C.Belmonte、Roman Hudec、Chaeyoung Kim和Wolfdieter Springer&Jungsu Kim

  2. 肯塔基大学病理学系，肯塔基州列克星敦，40536，美国

    Wang Xia Wang和Peter T.Nelson

  3. 美国佛罗里达州杰克逊维尔梅奥研究生院疾病神经生物学项目，32224

    Wolfdieter Springer和Jungsu Kim

作者
  1. Jaekwang Kim先生
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  2. 法比安·菲泽尔
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  3. Krystal C.Belmonte公司
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  4. 罗曼·胡达克
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  5. 王霞王霞
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  6. Chaeyoung Kim先生
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  7. 彼得·纳尔逊
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  8. 沃尔夫迪特·斯普林格
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  9. 金正洙（Jungsu Kim）
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通讯作者

与的通信Jaekwang Kim先生或金正洙（Jungsu Kim）.

其他文件

附加文件1：

的击倒DICER1标准miRNA水平降低。HeLa细胞转染50 nM的DICER1标准siRNA（DICER1 KD）或阴性对照（Ctl）。转染后48小时，通过qRT-PCR分析代表性miRNA水平，并将其量化为对照组的百分比(n个 = 2). 数值为平均值 ± 扫描电镜（PDF 18 kb）

附加文件2：

人类PINK1候选miRNA的计算预测。一人中脑中表达的miRNAs与人3′UTR推测结合位点的计算预测粉红色1mRNA。我们首先搜索了在人类3′UTR中具有假定结合位点的miRNAs粉红色1mRNA通过使用几种miRNA-目标预测算法，如miRanda[67]，米尔沃克[68]，RNA杂交[37]和Targetscan[69]。在不同算法预测的49个miRNA中，已知7个miRNA在人类中脑表达[34]。miR-27a/b预计在人类3′UTR中有2个假定的结合位点粉红色1mRNA，而所有其他miRNAs预计有1个假定的结合位点。b条人3′UTR中miR-27a/b及其结合位点的计算结合预测粉红色1mRNA。结合自由能由RNAhybrid算法确定。（PDF 68 kb）

附加文件3：

一的3′UTR序列比较粉红色1来自不同物种的mRNA。使用ClustalW程序对3′UTR序列进行多重比对粉红色1来自人类（NM_032409）、黑猩猩（XM_001164912）、猴子（XM_001096957）、大鼠（NM_001106694）和小鼠（NM_026880）的mRNA。miR-27a/b的种子匹配位点以红色突出显示。b条一个3′UTR序列的系统发育树粉红色1来自不同物种的mRNA。全长3′UTR序列的邻接树粉红色1用ClustalW程序生成mRNA。（PDF 27 kb）

附加文件4：

miR-27a的水平(一)和miR-27b(b条)荧光素酶分析。HeLa细胞转染miR-27a/b或阴性对照（Ctl）以及X轴所示的报告构建物。转染48 h后，用qRT-PCR检测miR-27a/b水平。将每个级别标准化为相应的6号机组水平。数据显示为相对于控制miR的折叠变化(n个 = 5，单向方差分析）。数值为平均值 ± SEM（不另作说明。 = 不重要）。（PDF 29 kb）

附加文件5：

过度表达后miR-27a/b的水平(一)和抑制(b条)转染40 nM的阴性对照（Ctl）或miR-27a/b（A）或150 nM的反对照（anti-Ctl或anti-miR-27a/b（b）。转染48小时后，通过qRT-PCR测定miR-27a/b水平。将每个级别标准化为相应的6号机组水平。数据显示为相对于控件的折叠变化(n个 = 4). 数值为平均值 ± SEM（不另作说明。 = 不重要***第页 < 0.001，单向方差分析（A）或t吨-测试（B））。（PDF 28 kb）

附加文件6：

与单个miRNA相比，miR-27a和miR-27b的组合不会进一步抑制PINK1的表达。用80 nM阴性对照（Ctl）转染HeLa细胞，40 nM Ctl转染40 nM miR-27a（miR-27a），40 nM-Ctl转染40 nM-miR-27b（miR-28b），或40 nM miR-27a转染40 nM miR-28a（miR 27a/b）。转染48小时后，通过Western blot检测PINK1水平，并将其归一化为相应的GAPDH水平。数据以控制百分比显示(n个 = 4、单因素方差分析）。数值为平均值 ± 扫描电镜(***第页 < 0.001). （PDF 42 kb）

附加文件7：

PINK1的敲除阻止受损线粒体传递到溶酶体。用阴性对照（si-Ctl）或PINK1 siRNA转染后48 h，用4μM CCCP或DMSO处理稳定表达mtKeima的HeLa细胞12 h。使用440/10 nm（中性）和548/20 nm（酸性）激发滤光片依次扫描细胞。比例尺对应于100μm。酸性基团的信号强度除以中性基团的强度(一). 数据是从12个独立的重复数据中收集的，以对照组（n > 300个细胞，双向方差分析）(b条). 数值为平均值 ± SEM（n.s.=不重要***第页 < 0.001). （PDF 291 kb）

附加文件8：

一miR-23a示意图 ~ 第27页 ~ 24–2和miR-23b ~ 27亿 ~ 24–1个集群。b条,c（c）线粒体损伤后miR-23a/b的水平。HeLa细胞与二甲基亚砜、10μM CCCP或10μM寡霉素和4μM抗霉素的组合培养。miR-23a/b水平通过qRT-PCR测量并归一化为相应的6号机组水平。数据显示为相对于DMSO控制的折叠变化。d日用qRT-PCR测定线粒体损伤后miR-103、miR-221和miR-7a的水平，并将其归一化为相应的6号机组水平。数值为平均值 ± 扫描电镜(t吨-测试***第页 < 0.001). （PDF 41 kb）

权利和权限

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Kim，J.、Fiesel，F.C.、Belmonte，K.C。等人。miR-27a和miR-27b通过靶向PTEN诱导的假定激酶1（PINK1）调节受损线粒体的自噬清除。摩尔神经变性 11, 55 (2016). https://doi.org/10.1186/s13024-016-0121-4

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关键词

分子神经退行性疾病

国际标准编号：1750-1326