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研究文章

病毒抑制HIV+患者结肠上皮紧密连接复合体表达的近距离逐渐减少

  • 夏洛特·钟，

    附属美国俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学院药理学系

    ⨯
  • 斯蒂芬妮·奥尔登，

    附属美国俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学院医学系

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  • 尼古拉斯·T·芬德堡，

    附属美国俄亥俄州哥伦布俄亥俄州立大学医学院健康与康复科学学院医学实验室科学部

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  • 傅平福，

    附属美国俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学院流行病学和生物统计系

    ⨯
  • 艾伦·D·莱文

    alan.levine@case.edu

    附属公司美国俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学院药理学系，美国俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学院医学系，美国俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学院病理学系、分子生物学系、微生物学系、儿科系和凯斯综合癌症中心

    ⨯

摘要

有效的抗逆转录病毒治疗（ART）可显著减少AIDS相关并发症，但与未感染的对照组相比，长期接受ART治疗的HIV感染患者的预期寿命仍然缩短，因为非艾滋病相关疾病的风险增加。许多人认为，这些并发症是由肠道微生物产物移位引起的，这些微生物产物刺激全身炎症，这是该人群持续存在的肠道细胞旁通透性增加的结果。同时发生的肠道免疫缺陷和结构屏障恶化被认为是驱动微生物易位的原因，据报道，在恒河猴未经治疗的致病性SIV感染中，有肠上皮破裂的直接证据。为了评估和描述病毒抑制HIV感染患者的上皮细胞损伤程度，我们分析了肠道活检组织中细胞和分子水平的上皮细胞变化。HIV肠道中的肠上皮大体完整，肠上皮细胞的相对丰度和堆积没有减少。我们没有发现肠上皮紧密连接（TJ）的结构和亚细胞定位变化的证据，但在HIV+队列中观察到结肠而非回肠末端TJ组分的转录水平显著降低。HIV+患者降结肠中TJ蛋白的减少证实了这一结果。在HIV+队列中，结肠TJ转录水平沿近远轴逐渐降低。相反，在健康对照组中，相同TJ转录物的表达水平从近端到远端保持不变或逐渐增加。非TJ肠上皮细胞特异性mRNAs揭示了HIV相关转录改变的不同模式，支持HIV结肠中肠上皮转录调控的整体变化。这些发现表明，持续性肠上皮失调（包括TJ表达减少）是ART治疗的HIV感染患者结肠通透性和微生物移位增加的机制，也是非艾滋病相关并发症的可能免疫致病因素。

作者摘要

虽然艾滋病病毒感染患者的抗逆转录病毒治疗在抑制病毒复制和防止进展为艾滋病方面非常有效，但由于非艾滋病相关疾病的风险增加，接受治疗的患者的预期寿命仍然较短。最近的数据表明，这些并发症与慢性全身炎症有关，并且假设细菌产物破坏肠道屏障可能导致炎症。众所周知，艾滋病毒会导致持续的肠粘膜免疫缺陷，但在接受抗逆转录病毒治疗的患者群体中，缺乏肠上皮结构受损的证据。在这里，我们描述了导致该人群肠道通透性增加的肠上皮损伤。我们发现，虽然结肠上皮层在显微镜下完好无损，但细胞间紧密连接（TJ）在转录和翻译水平下调。我们进一步观察到，TJ转录物沿着近端到远端的HIV肠道逐渐减少。非TJ上皮转录物水平的同时变化表明HIV肠道中的上皮细胞转录失调。我们的数据提供了证据，证明TJ阻断是增加抗逆转录病毒治疗的HIV患者结肠通透性的一种新机制，从而可能导致全身炎症和相关并发症。

引用：Chung CY，Alden SL，Funderburg NT，Fu P，Levine AD（2014），病毒抑制HIV+患者结肠上皮紧密连接复合体表达的近距离渐进性减少。公共科学图书馆·病理学10（6）：e1004198。https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004198

编辑：Daniel C.Douek，美国疫苗研究中心

收到：2013年11月24日；认可的：2014年5月6日；出版：2014年6月26日

版权：©2014 Chung等人。这是一篇根据知识共享署名许可协议，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源得到认可。

基金：这项工作得到了美国国立卫生研究院（AI 076174 to ADL；T32 GM007250，TL1 TR000441，T32 GM-008803 supported CYC）、凯斯西储大学艾滋病研究中心（AI 036219）、皮肤病研究中心（P30 AR-039750）、视觉科学研究中心核心（P30-EY11373）、，和牙科医学院（P01 DE-019759）。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

介绍

慢性全身炎症，特征是活化B细胞和T细胞的频率增加[1]循环促炎细胞因子和趋化因子水平升高[2]以及更快的免疫细胞周转[3]是HIV/SIV感染的标志，比血浆病毒载量更能预测疾病进展[4],[5]越来越多的证据表明，这种全身性炎症在包括心血管疾病在内的非艾滋病相关共病中起作用[1],[6]–[8]、肝脏疾病[2],[9]–[11]和神经认知能力下降[3],[12]，导致接受长期抗逆转录病毒疗法（ART）治疗的患者预期寿命缩短和过早衰老[4],[5],[13],[14]此外，慢性HIV感染者的血浆微生物产物水平升高，如脂多糖（LPS）和细菌16s rDNA，并与免疫激活标记物相关[15]–[17]，意味着微生物移位导致的循环微生物产物是HIV相关全身炎症的主要原因[18]在炎症性肠病等其他疾病过程中观察到循环微生物产物与全身炎症之间的关联[19],[20]腹腔镜手术后[21],[22]此外，干细胞治疗的调节方案会导致胃肠道损伤，从而促进微生物产物从肠腔转移到体循环，最终刺激免疫系统并加重移植物-与-宿主病[23],[24].克拉特等。强调SIV-幼稚猪尾猕猴肠道上皮结构损伤、局部和全身微生物移位以及全身炎症之间的关系[25]表明微生物移位和全身炎症是在没有慢性病毒感染的情况下胃肠道损伤的直接后果。

胃肠道是HIV感染的主要靶点，因为黏膜免疫系统含有人体大部分T细胞[26]此外，超过90%的肠道CD4+T细胞是CCR5+[27]提供大量优先被HIV耗尽的靶细胞。与传播途径无关，在HIV或SIV感染的几周内，肠道固有层CD4+T细胞迅速严重耗竭，并持续到疾病的慢性期[27]–[29]Th17和Th22亚群优先耗竭[30],[31]在HIV感染期间，粘膜CD8+T细胞显著积聚[32],[33]; 这两种效应都会显著改变粘膜免疫稳态。与早期粘膜CD4+T细胞丢失相一致，基因表达谱揭示了原发性HIV和SIV感染中的肠屏障功能障碍，例如与上皮维持和消化功能相关的基因下调[34],[35].精英控制者肠粘膜保护和再生活性基因上调[34]证实肠粘膜完整性在限制全身炎症和控制疾病进展方面可能发挥关键作用。

长期以来，在患有晚期疾病的HIV患者中发现的肠屏障功能障碍包括病原菌阴性腹泻和吸收不良的表现[36]通过测量口服低聚糖在尿液中的排泄量，间接评估肠道通透性，表明无论治疗状态如何，有症状的艾滋病患者和一些无症状的慢性艾滋病患者的小肠通透性增加[37],[38]值得注意的是，小肠通透性增加与肠道结构变化无关[37]、和，通过在体外十二指肠活检的阻抗谱和通量分析被认为是由于漏通量机制[39]，指紧密连接（TJ）下调导致的肠屏障缺陷。我们最近的临床报告显示，HIV感染患者的小肠和结肠通透性增加，但ART并没有纠正这一现象，进一步表明肠道屏障功能障碍是ART治疗患者的一种持续病理生理变化[40]我们目前的研究使用人类肠道活检，扩展了非人灵长类动物SIV感染肠道损伤的证据[41]并探索ART治疗的HIV+患者肠道通透性增加的分子机制。我们假设，HIV相关的肠上皮细胞失调将导致TJ下调，导致ART治疗患者持续的肠屏障功能障碍，导致微生物移位和全身炎症。

材料和方法

道德声明

大学医院机构审查委员会（IRB）审查了以下提交文件：

主要研究者：Alan D Levine博士。

方案名称：HIV感染时肠道屏障功能丧失

UHCMC IRB编号：06-07-31

提交类型：持续审查

审查类型：全委员会

委员会审查日期：2014年8月4日

因此，UHCMC IRB已确定，关于个人的权利和福利、用于获得知情同意的方法的适当性以及调查的风险和潜在医疗利益，根据《联邦法规汇编》第45卷第46节和《联邦法规汇编》第21卷第50节和第56节颁布的联邦人体受试者保护条例，当前提交的材料是可接受的。本研究的有效期为2015年7月4日

患者招募

接受常规结肠镜检筛查的受试者来自俄亥俄州克利夫兰市大学医院病例医学中心消化健康研究所和特殊免疫科，排除任何已知或疑似胃肠疾病。在获得书面知情同意后，从31名HIV患者（中位年龄51岁，四分位间距[IQR]50-55岁）和35名健康对照组（中位年纪56岁，IQR 50-61岁）中进行了八次夹点活检，其中回肠末端、升结肠、横结肠和降结肠各两次。在结肠镜检查后，立即将外周血收集到含有EDTA的试管中，以获取血浆样本，并将其储存在−80°C下，直到进行分析。除了三名同时接受慢性腹泻评估的HIV+受试者（其中未发现明显的回肠或结肠末端组织病理学检查结果）外，在其他HIV+患者和所有对照受试者的结肠镜检查准备方案之前，没有腹泻报告。尽管有CD4计数和病毒载量，HIV+患者仍被登记，并且所有患者都接受了ART治疗。对照组没有进行专门的艾滋病毒检测，但没有艾滋病毒感染史的报告。所有研究方案均由大学医院病例医疗中心的机构审查委员会批准。

核染色法测定细胞相对丰度

将升结肠、横结肠和降结肠的福尔马林固定、石蜡包埋、5µm活检切片去石蜡化、再水化，并用DAPI（AbCam）将其安装在氟碳固定介质中。对五名HIV+患者和五名健康对照者的每个供者的两次活检进行了分析。使用连接到Retiga EXI相机（Q成像）的20×物镜在徕卡DMI 6000 B倒置显微镜上获得单个图像，并通过拼接生成每个截面的合成图像。建立了排除背景的阈值强度，以专门分析核染色。人工识别上皮细胞核和固有层细胞核，然后使用变形成像软件（分子设备）计算它们所占总面积的测量值。内置细胞核计数应用模块用于通过将细胞核宽度设置为3-8µm来确定上皮细胞数量。相对上皮细胞丰度（与固有层细胞相比）由上皮细胞核面积与固有层细胞核面积之比决定。内壁屏障覆盖率定义为完整上皮/内腔边界相对于固有层细胞丰度的长度，指定为边界长度与固有层细胞核面积的比值。上皮细胞堆积密度计算为每100µm完整管腔边缘的上皮细胞数。

共焦显微镜

用10%的正常山羊血清封住升结肠、横结肠和降结肠的副甲醛固定、冷冻、5µm活检切片，用兔抗闭塞素或抗ZO1抗体孵育，并用鸡或山羊Alexa Fluor 488-共轭抗兔二级抗体（Invitrogen Life Technologies）检测。切片安装在经DAPI（AbCam）染色的荧光场安装介质中，并使用Perkin Elmer Ultraview VoX共焦显微镜进行可视化，使用与徕卡DMI 6000 B倒置显微镜相连的浸油100倍放大物镜。正面使用Volocity 6.2（Perkin Elmer）获得横向Z堆叠图像（0.3µm厚）。应用阈值消除非特异性染色后，使用Imaris 3.0（Bitplane Scientific Software）对紧密连接进行三维重建并进行分析。对于从总共三名HIV+患者和三名健康对照中获得的每个活检，每个位置两次活检，对肠表面平均7个视场和隐窝平均5个视场进行成像和分析。分析每个视野下闭塞素或ZO-1染色的平均荧光强度。

实时qPCR

将储存在−80°C下的速冻活检标本用打球器（Retsch）以30 Hz/s的频率均匀化3分钟，以确保完全均匀化。使用PureLink RNA Mini Kit（Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA）提取总RNA，并使用Nanodrop 2000（Thermo Fisher Scientific，Wilmington，DE）进行量化。使用SuperScript II逆转录酶（Invitrogen Life Technologies）从1µg总RNA转录cDNA。使用CFX96实时PCR检测系统（Bio-Read Laboratories），通过SybrGreen实时PCR测定人类β-防御素3（hBD-3）、E-cadherin和紧密连接蛋白闭塞素、闭塞带1（ZO-1）、克劳丁-2和克劳丁-4的转录水平。基于geNormPlus分析（Biogazelle）对八种常用的家政转录物进行遗传稳定性评估后，确定了β-actin和真核生物翻译延伸因子1-alpha 1（eef1A1），并将其用作参考。所用底漆概述如下表1.通过qBasePlus（Biogazelle）分析确定目标基因的校准归一化相对量（CNRQ）[42].

缩略图
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表1。用于实时qPCR的引物。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004198.t001

免疫印迹法

在60µl SDS-RIPA缓冲液（50 mM Tris pH 8.0，150 mM NaCl，0.3%SDS，1%Triton X，1 mM EDTA，1∶100蛋白酶抑制剂）中，使用打球器（Retsch）以30 Hz/s的频率从snap冷冻的降结肠活检中提取总蛋白3分钟，然后在4°C下持续搅拌2小时。蛋白质通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（Invitrogen Life Technologies）分离，并电转移到硝化纤维素膜（Invit罗gen Life-Technologies）上。在用5%的非脂肪乳溶液封闭后，用兔抗3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、细胞角蛋白-18、闭塞素（AbCam）、克劳丁-2和鼠抗克劳丁-4（Invitrogen Life Technologies）和β-肌动蛋白（AbCam）抗体对膜进行探测。在与HRP缀合的山羊抗兔（Thermo Fisher Scientific）或抗小鼠（AbCam）二级抗体孵育后，使用West Pico Supersignal（Pierce）通过增强化学发光观察信号。使用Hyblot CL放射自显影胶片（Denville Scientific）检测所有膜的化学发光。

密度分析

使用ImageJ（美国国立卫生研究院）通过密度测定法对每条带中的蛋白质数量进行量化。对稀释系列进行电泳，以确定每个目标蛋白的最佳装载量，以确保条带在检测的线性范围内。调整装载量后，对产生暴露不足或过度暴露条带的提取物进行重新电泳，以获得准确定量的条带。在所有凝胶上电泳一个用于使凝胶之间的强度变化正常化的凝胶间对照样品。将每个靶蛋白闭塞素、克劳丁-2和克劳丁-4的密度测定强度标准化为每个提取物中细胞角蛋白-18的强度，以确定上皮特异性TJ蛋白水平。对13名HIV+患者和13名健康对照者的样本进行了分析。

可溶性炎症标记物的测定

通过1610 g EDTA处理的全血离心10分钟制备血浆，然后在−80°C下冷冻，直到进行分析。使用Quantikine试剂盒（研发系统）测量可溶性CD14（sCD14）水平。样品在冰上解冻，分两批分析，减去背景值，并报告平均值。

LPS测量

用无内毒素的水将血浆样品稀释至10%，然后加热至85°C 15分钟以使血浆蛋白变性。根据制造商的方案，使用市售鲎卵母细胞裂解物测定法（QCL-1000，Lonza）对LPS的血浆水平进行量化。样品分析一式三份；减去背景，并报告平均值。

统计分析

为了评估组织学样本，使用混合效应模型进行统计分析，该模型考虑了来自同一个人的重复测量，并使用非结构化协方差结构进行推断。使用SAS（统计分析系统，9.2版）进行分析。所有其他分析均使用Prism 5.0（GraphPad软件）进行。相对细胞丰度、回肠末端和结肠中的转录水平以及下降结肠中的蛋白质水平使用图基方法构建的盒须图表示，其中异常值被视为不同的数据点。通过Mann-Whitney U检验对所有数据点（包括异常值）的mRNA、蛋白质水平和血浆sCD14水平进行统计分析。分析TJ转录水平与肠道位置（近端到远端），使用Kruskal-Wallis检验（单向方差分析的非参数版本）对结果进行分析，并对多重比较进行测试后调整，以评估线性趋势。计算免疫激活标记物的Spearman等级相关性与结肠TJ转录水平。对于通过多次比较分析的样本，使用Benjamini和Hochberg的方法进行错误发现率（FDR）分析[43]，采用SAS程序PROC MULTTEST进行。报告FDR调整后的P值。所有测试均为双侧测试，小于0.07的p值被视为显著。

接入号码

我们从Entrez Gene和UniProtKB/Swiss-Prot提供了文本中提及的所有基因和蛋白质的登录号，如下所示：ZO-1（基因ID:7082；UniProtKB AC:Q07157，E-Caddherin（基因ID:999；UniProtKB AC:P12830）、GAPDH（基因ID:2597；UniProt KB AC:P04406）、细胞角蛋白-18（基因ID:3875；UniProt-KB AC:P05783）、hBD-3（基因ID:1414325；UniProt/KB AC:P81534）、eef1A1（基因ID:1915；UniProttKB AC:P68104）、β-肌动蛋白（基因ID:00；UniProtKB AC:P60709）。

结果

研究人群

我们对HIV+人群肠道屏障完整性的临床研究，其中我们测量了口服低聚糖的尿排泄量[40]显示小肠和结肠的通透性增加。这些结果表明，小肠通透性增加是上皮损伤的结果，而结肠细胞旁通透性增大，但没有上皮损伤，表明完整上皮细胞之间的屏障功能丧失。重要的是，ART治疗的HIV+患者的肠道通透性增加未得到纠正。为了研究ART治疗患者肠道通透性持续增加的机制，我们从31名接受ART治疗的HIV+患者和35名健康对照者中获取了肠道夹点活检和血浆样本，这些患者在大学医院病例医学中心消化健康研究所接受结肠镜检查。对照组和HIV+组的年龄范围相似。在这两个队列中，男性的参与人数都多于女性，艾滋病毒+队列中男性的比例更高。HIV+受试者的感染时间中位数为13.6年，在活检前中位数为6.5年，外周血CD4+T细胞的中位数最低值为176个细胞/微升。活检时，HIV+队列的病毒载量和CD4+T细胞计数中位数分别为48拷贝/ml和569个细胞/µl。除四名HIV+患者外，其余患者均未检测到病毒载量。所有研究的HIV+患者在进入研究前接受抗逆转录病毒治疗的时间中位数为11.2年，不间断治疗的时间中位数为4.1年。所有患者在活检时至少服用了三种抗逆转录病毒药物，包括至少两种逆转录酶抑制剂以及蛋白酶抑制剂和整合酶抑制剂的组合。队列的人口统计学和临床参数总结如下表2对21名HIV+患者和21名健康对照者的血浆免疫激活标记物sCD14和LPS水平进行了分析，作为微生物易位的指标。由于每个研究对象获得的小活检数量有限，我们仅限于对每个受试者获得的样本进行单分子或组织学分析，同时对三名HIV+受试者和七名对照受试者的活检进行定量PCR和免疫印迹。每个队列中的受试者被随机分配进行各种分析。图1详细说明了我们队列中的活检和血浆样本在每种分析方法中的分类。

缩略图
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图1。队列图，说明肠道活检和血浆样本分配给每种分析方法。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004198.g001

缩略图
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表2。研究队列的人口统计学和临床参数。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004198.t002

HIV感染者肠道上皮细胞相对丰度未降低

肠道由一层单细胞厚上皮组成，覆盖与肠腔的界面，并将外部环境与固有层中过多的免疫细胞分离。为了评估上皮细胞的整体损失是结肠通透性增加的潜在机制，我们比较了HIV+患者和健康对照组肠道活检样本中上皮细胞相对于固有层细胞的丰度(图2). HIV+肠道中的上皮细胞大体完整且连续，管腔表面或隐窝中没有局部上皮细胞丢失、隐窝分叉、中性粒细胞诱导的损伤、扁平上皮或溃疡(图2A). HIV+肠道中上皮细胞的相对丰度由上皮细胞核与固有层细胞核的比率反映，升结肠、横结肠和降结肠中上皮细胞没有变化(图2B). 同样，考虑到上皮-肠腔边界完整的程度作为屏障覆盖的衡量标准，HIV肠道上皮的相对长度在所有三个结肠部位都没有改变(图2B). 根据每100µm上皮中上皮细胞的数量评估，HIV感染人群的相对上皮细胞丰度和组织长度没有损失，通过发现HIV上皮中的细胞密度或堆积没有变化，这一证据得到了证实和扩展(图2C).

缩略图
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图2。HIV+患者肠道活检中上皮细胞的相对丰度没有降低。

固定石蜡包埋肠道活检切片用DAPI染色并成像。（A）健康对照组（左面板）和HIV+患者（右面板）活检切片的代表性图像显示为蓝色细胞核染色。将上皮（EPI）细胞的丰度（由上皮细胞核占据的面积（箭头）或上皮腔边界的长度（长度）（白线，插图）表示）与固有层（LP）细胞的丰度（由LP细胞核占据的面积（箭头）表示）进行比较。（B）上皮细胞相对丰度表示为EPI/LP细胞核面积或长度/LP细胞核面积之比，以及（C）在升结肠、横结肠和降结肠中测定上皮细胞堆积密度，以每100µm上皮-腔边界的上皮细胞核数表示，并在健康对照组和HIV+个体之间进行比较。使用Tukey的方法构建了方框和胡须图，其中黑点识别异常值(n个 = 两组均为5）。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004198.g002

这些结果直接表明，相对于固有层细胞，上皮细胞的丰度没有变化，而上皮细胞的绝对数量没有变化。此前的一份报告显示，在延长ART治疗后，HIV+肠道粘膜中CD4+T细胞恢复，CD8+T细胞增加，两者均以绝对数计算[32]使我们能够得出结论，艾滋病毒感染者结肠中肠上皮细胞的绝对数量没有减少。HIV+肠道上皮中上皮细胞的堆积没有变化，也表明HIV肠道的通透性在细胞水平上没有表现出来，这表明在分子水平上，ART治疗的HIV+患者结肠通透性增加的另一种机制。

HIV感染者肠道上皮紧密连接成分的结构和亚细胞定位无微观变化

由于我们的临床研究中使用了非吸收性糖探针，结果表明细胞旁通透性（细胞外，上皮细胞之间的细胞间隙内）增加，而溶质通过跨细胞途径流动[44]细胞旁肠屏障功能主要由位于顶部的跨膜紧密连接（TJs）介导，TJs密封相邻上皮细胞之间的细胞间隙。结肠肠道细胞旁通透性增加的一个潜在分子机制是细胞间TJ的破坏。在一个完整的上皮细胞层中，单个上皮细胞之间的空间被由TJ和下附着物连接组成的顶端连接复合体所封闭，通过TJ是细胞旁转运途径的速率限制步骤，并用于整个跨上皮溶质转运[45]TJ是一种由跨膜蛋白组成的多蛋白复合物，包括克劳丁家族成员和形成膜内TJ链的TJ相关奇迹蛋白，以及细胞内支架蛋白，如ZO-1，将绞合形成蛋白连接到细胞骨架，对TJ的组装和调节很重要[45]组织特异性表达控制TJ复合物中封闭蛋白和通道形成蛋白的结合，是不同屏障特性和选择性的主要决定因素[46],[47].

为了检测肠上皮中TJ复合体的亚细胞定位和组织，我们通过高倍（100×）共聚焦显微镜研究了TJ组分闭塞素和ZO-1在HIV+肠道中的分布。TJ位于外侧上皮细胞膜的顶端，靠近管腔表面，远离基底外侧核和固有层，闭塞素和ZO-1在管腔边界上均表现为明显的点状或线状结构(图3A). 查看时面对面，TJ与细胞内结合周肌动球蛋白环组装成环状结构，在对照结肠组织的隐窝中形成“鸡丝状”外观(图3B). 在健康对照人群中，完整的TJ分布在整个结肠的上行、横向和下行段。在HIV+肠道中，肠表面和结肠隐窝中的闭塞素和ZO-1分布没有明显变化(图3A和3B)，表明在ART治疗的HIV+人群中，上皮TJ在细胞内对侧质膜的定位得以维持，并且TJ在结构上是完整的，在上皮细胞之间排列。

缩略图
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图3。在HIV结肠中，紧密连接蛋白clodin和ZO-1的亚细胞定位没有改变。

对HIV+患者和健康对照组的升结肠、横结肠和降结肠的固定冰冻活检切片进行闭塞素或ZO-1（绿色）染色，并用DAPI（蓝色）进行复染。管腔表面的代表性图像（A）在地窖里（B）图中显示了升结肠、横结肠和降结肠。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004198.g003

结肠活检也检查了TJ的组成。测定了闭锁素和ZO-1的丰度，并用染色结肠升、横结肠和降结肠切片的平均荧光强度表示。平均荧光强度如所示表3和4在所检查的所有三个结肠部位的肠表面或隐窝，HIV+样本中的闭塞素强度没有显著差异。同样，肠道表面的ZO-1丰度也没有显著差异。在隐窝中，在横向HIV+结肠中观察到ZO-1强度显著增加。

缩略图
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表3。结肠表面上皮切片的闭塞素和ZO-1染色的平均荧光强度。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004198.t003

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表4。结肠隐窝上皮切片中闭塞素和ZO-1染色的平均荧光强度。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004198.t004

HIV感染者结肠紧密连接蛋白而非回肠末端紧密连接蛋白转录下调

为了研究HIV+患者肠上皮紧密连接复合体的表达是否在转录水平上受到调节，通过实时定量PCR测定了肠道活检中一组TJ蛋白的mRNA浓度(图4). mRNA水平使用qBasePLUS软件进行量化，该软件将转录水平表示为校准的标准化相对量，根据β-actin和eef1A1的内源性水平作为对照进行计算，并根据geNorm分析进行选择。

缩略图
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图4。HIV+患者结肠紧密连接转录物减少，而非回肠末端。

在分离的总RNA中测定ZO-1、闭塞素、克劳丁-2和克劳丁-4转录物的校准归一化相对量（CNRQ）（A）结肠的(n个 = 9代表HIV+，n个 = 健康对照组为13）和（B）回肠末端(n个 = 10代表HIV+，n个 = 健康对照组8例）HIV+个体和健康对照组的活检。水平归一化为β-actin和eef1α1表达。使用Tukey的方法构建了盒子和胡须图，其中黑点识别异常值。对所有数据点进行统计分析，包括异常值（艾滋病毒+和健康对照组之间的*p<0.05，**p<0.01）。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004198.g004

虽然使用显微免疫荧光法在我们的系统中无法检测到TJ结构和亚细胞定位的变化，但结肠中ZO-1（p<0.01）和闭塞素（p<0.05）mRNA的表达显著降低(图4A)与健康对照受试者相比，在HIV+个体中观察到。与健康对照组的表达水平相比，HIV+受试者结肠中的claudin-2（一种阳离子选择性通道形成蛋白）的转录表达水平也显著降低（p<0.01）。同样，另一个claudin家族成员claudin-4的HIV+患者结肠mRNA表达显著下降（p<0.01）(图4A)，其主要作为具有有争议的阴离子通道形成活性的密封蛋白发挥作用。TJ mRNA的减少程度从claudin-4的1.4倍到claudin-2的2.7倍不等。我们提出，mRNA表达的这些适度变化，在广泛的组织范围内标准化，解释了为什么通过共焦显微镜仅检查有限的视野无法检测到蛋白表达的局部变化。令人惊讶的是，与健康对照组相比，所研究的所有四种TJ mRNA在HIV+患者回肠末端的表达水平没有改变(图4B)，提示胃肠道中的TJ转录物存在HIV-相关组织特异性下调，仅在结肠中可见，在回肠末端无。仅结肠中TJ mRNA的减少与我们的临床研究一致，该研究揭示了HIV相关的结肠细胞旁通透性增加和小肠组织损伤[40].

紧密连接mRNA在HIV+结肠中沿近远轴的表达持续下降

由于小肠和结肠活检是在胃肠道的四个不同位置进行的，即回肠末端、升结肠、横结肠和降结肠，我们有独特的定位来研究HIV阳性人群结肠上皮TJ mRNA表达的减少是否与解剖位置有关(图5). 使用Kruskal-Wallis分析和线性趋势的测试后调整，ZO-1基因表达在健康对照人群中从近端到远端的转录水平显示出显著的直接线性增加（p = 0.045). 这种表达模式在HIV+人群中显著逆转，ZO-1转录水平在表达和肠道位置之间表现出显著的反向趋势（p = 0.049) (图5A). 通过比较每个特定肠道部位的ZO-1转录水平，我们观察到与健康对照人群相比，在胃肠道更远端的部分，即横向（p = 0.05）和降结肠（p<0.01），这与HIV+人群中ZO-1 mRNA表达持续下降的概念一致(图5A).

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图5。HIV+患者紧密连接转录水平从近端结肠到远端逐渐降低。

从HIV+个体（红色方框）和健康对照组（蓝色圆圈）的回肠末端以及升结肠、横结肠和降结肠的活检中分离出总RNA。CNRQ的（A）ZO-1，（B）闭塞素，（C）第2条，以及（D）比较每个位置的claudin-4转录本。进行了Kruskal-Wallis检验，这是单向方差分析的非参数版本，HIV+（HIV）和对照（HC）队列的p值显示在每个面板的左上角，然后对2在适当的时候，分别使用两个队列中每个转录本跨位置线性趋势的后验来确定p值。线性回归表示（对于HIV+n个 = 在所有结肠部位和n个 = 回肠末端10个；用于健康控制n个 = 8用于末端回肠，n个 = 7表示升结肠，以及n个 = 横结肠和降结肠为9；#HIV+与健康对照组之间p<0.08，*p≤0.05，**p<0.01）。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004198.g005

与ZO-1相比，在健康对照人群中，闭塞素、克劳丁-2和克劳丁-4的转录水平从近端到远端肠道保持相对稳定(图5B–5D). 虽然我们没有观察到HIV+人群远端结肠的闭塞素表达减少的显著线性趋势，但与ZO-1相似，我们确实发现在HIV+队列中，闭塞素转录水平仅在远端，即横结肠和降结肠显著降低（p<0.05；图5B). 与HIV+人群中的ZO-1表达一致，从回肠末端到结肠降段，claudin-2和claudin-4 mRNA表达呈显著的线性下降趋势（p = 0.044和p = 0.059;图5C和5D). 单独检查每个结肠部位，发现横结肠和降结肠中claudin-2的表达显著降低（p<0.05；图5C). 克劳丁-4也有类似的模式(图5D)在HIV+人群中，claudin-4在横结肠中的转录表达显著降低（p<0.05），在降结肠中呈下降趋势（p<0.08），而在回肠末端和升结肠中claudin-2和-4转录水平保持不变(图5C和5D). 总的来说，HIV感染与肠道TJ复合体的解剖表达谱的显著改变有关，表现为mRNA表达的近远端下降梯度。

消除男性比例差异的潜在影响与对照组和艾滋病病毒+组中的女性受试者，我们重新分析了仅代表绝大多数艾滋病病毒+志愿者的男性受试者的肠上皮紧密连接转录物的表达。HIV+男性结肠中再次观察到所有四种TJ mRNA水平的显著下降(图S1A)而回肠末端的转录水平没有改变(图S1B)，复制对整个HIV+和健康对照组的观察结果。在检查男性受试者肠道近远轴的TJ表达水平后，我们再次确认了我们关于HIV相关肠道TJ复合物转录表达谱改变的结论，这反映在向远端HIV+肠道的转录水平逐渐降低。我们发现，在健康男性中，随着ZO-1和claudin-2的位置从近端到远端的变化，mRNA水平增加，而在HIV+男性中则相反。对于闭塞素和克劳丁-4，健康男性从回肠末端到降结肠的转录水平相对稳定，而在HIV+男性中，克劳丁-4向结肠末端逐渐降低。在HIV+男性的降结肠中，ZO-1、clodin、claudin-2和claudin-4的中位转录水平都降低了1.5至2.9倍（数据未显示）。

我们还认识到，艾滋病毒是一种高度异质性的疾病。虽然我们所有的患者都在接受抗逆转录病毒治疗，但其中一些患者确实表现出可检测到的病毒载量，这可能会影响肠道通透性或胃肠功能。由于只有四名患者表现出可检测的病毒载量，本研究无法将完全病毒抑制组与这四名受试者进行比较，但我们可以通过将可检测病毒载量从分析中删除来消除其对TJ转录表达的影响。在病毒抑制的HIV+受试者的结肠中，观察到所有四种TJ mRNA水平的显著性降低(图S2A)而回肠末端的转录水平没有改变(图S2B)，复制整个HIV+队列的观察结果。在检查HIV完全抑制个体结肠近远轴的TJ表达水平时，我们发现升结肠中TJ mRNA表达进一步降低，这在整个HIV+队列中没有发现（ZO-1为1.8倍；闭塞素为1.7倍；克劳丁-2为2.3倍；克劳汀-4为1.6倍）。

HIV+患者下降结肠紧密连接蛋白表达降低

为了验证艾滋病毒相关的TJ转录水平下降，我们测量了远端结肠中TJ组分闭塞素、克劳丁-2和克劳丁-4的蛋白水平，该位置显示HIV患者转录水平下降最大。对病毒抑制的HIV+个体和健康对照者的降结肠中的总蛋白裂解物进行免疫印迹(图6A)然后进行密度分析。使用GAPDH和β-肌动蛋白验证样品的等负荷。为了准确量化每个谱带的密度，样品被电泳两次，如果需要改变加载量，以获得在线性检测范围内的谱带强度。为了专门检测上皮细胞中的TJ蛋白水平，将每个靶蛋白的水平标准化为上皮细胞特异性细胞角蛋白-18蛋白，这是一种在单层内上皮组织中表达的主要细胞质中间丝蛋白[48]闭塞素、克劳丁-2和克劳丁-4的正常蛋白水平均显示，在病毒抑制的HIV+队列中，降结肠中的蛋白质水平显著降低3.1至3.2倍(图6B)与对照组的水平相比，与观察到的HIV+肠道远端结肠中闭塞素、克劳丁-2和克劳丁-4转录水平的降低相一致。正如我们对TJ mRNA所描述的，在整个HIV+队列以及男性HIV+受试者中，occludin、claudin-2和claudin-4的蛋白表达水平中位数在HIV+降结肠中类似地降低了2.6至3倍(图S3和S4系列). 消除有限数量的HIV+腹泻患者并没有改变这些结果（数据未显示）。

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图6。病毒抑制的HIV+患者下降结肠中紧密连接蛋白水平降低。

从HIV+个体和健康对照的下行结肠活检中提取的总蛋白裂解物进行occludin、claudin-2、claudin-4、细胞角蛋白-18、GAPDH和β-肌动蛋白的免疫印迹。（A）显示了一个具有代表性的印迹，H表示HIV+样本，C表示健康对照样本，N表示组间正常化对照样本。（B）通过密度分析对闭塞素、克劳丁-2和克劳丁-4线性密度范围内的特异条带进行定量，并在病毒抑制的HIV+个体和健康对照组之间进行比较。靶蛋白水平根据细胞角蛋白-18蛋白水平进行标准化。使用Tukey的方法构建了盒子和胡须图，其中黑点识别异常值。对所有数据点进行统计分析，包括异常值（对于HIV+n个 = 10代表所有蛋白质；用于健康控制n个 = 13代表闭塞素和克劳丁-4，n个 = 12用于claudin-2；#p<0.07，*p<0.05）。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004198.g006

HIV感染中紧密连接mRNA下调是肠上皮细胞转录调控整体变化的结果

为了研究在ART治疗的HIV+人群中观察到的转录修饰是否对TJ成分具有特异性，我们测量了不属于TJ复合体的两种上皮细胞特异性蛋白的转录水平，即人类β-防御素-3（hBD-3）和E-cadherin，沿着近端到远端肠道。hBD-3是一种可诱导的广谱抗菌肽，由结肠肠上皮细胞产生，作为一种先天免疫效应器来保护肠道病原体[49]E-钙粘蛋白是粘附连接介导细胞间粘附的跨膜蛋白成分[50].

非TJ细胞成分分析显示HIV相关转录改变的不同模式(图7). 与观察到的TJ转录物类似，hBD-3的转录在HIV+患者的结肠中显示出显著的下调（p<0.05），但在特定结肠位置对hBD-3转录的检测显示出不同的模式(图7A). 在健康对照人群中，沿着升结肠、横结肠和降结肠的转录相对稳定，而在HIV+人群中，尽管仅在远端降结肠中观察到hBD-3转录显著下调（p<0.05），hBD-3转录水平与解剖位置之间没有显著的线性趋势(图7A). 另一方面，E-cadherin在HIV+结肠中的转录上调（p<0.01），与未感染结肠中的水平相比，与研究的其他转录物形成鲜明对比(图7B). 在健康对照组和各肠道部位的HIV+人群之间进行比较，我们观察到横向（p<0.05）和下降（p<0.05）HIV+结肠E-cadherin转录水平显著上调。在回肠末端和升结肠，E-cadherin转录水平没有变化。E-cadherin转录水平不随健康或HIV+肠道中的位置而变化。(图7B). 当仅对男性供体或病毒抑制人群进行单独检查时，结肠中hBD-3和E-cadherin转录水平的结果相同(图S5和S6系列).

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图7。人类β防御素-3和E-cadherin的表达在近端到远端HIV+肠道之间存在差异。

从肠道活检中分离出总RNA（A）人β防御素-3(n个 = 艾滋病毒+感染11例，n个 = 12用于控制）和（B）E-钙粘蛋白(n个 = 9代表HIV+，n个 = 在HIV+个体和健康对照组（上部面板）的结肠中测量。使用Tukey的方法构建了盒子和胡须图，其中黑点识别异常值。对所有数据点进行统计分析，包括异常值。还比较了HIV+个体（红色方框）和健康对照组（蓝色圆圈）在每个位置的转录水平：回肠末端、升结肠、横结肠和降结肠（下表）。Kruskal-Wallis检验是单向方差分析的非参数版本，分别对HIV+（HIV）和对照（HC）队列中的每个转录本进行检验，p值显示在每个面板的左上角。线性回归显示为一种表示（hBD3：对于HIV+n个 = 横结肠为8，以及n个 = 升结肠和降结肠为9；用于健康控制n个 = 升结肠为6，以及n个 = 横结肠和降结肠7例；E-cadherin：用于HIV+n个 = 9用于末端回肠和升结肠，n个 = 横结肠为7，以及n个 = 降结肠8例；用于健康控制n个 = 9用于末端回肠和降结肠，以及n个 = 升结肠和横结肠为7；#HIV+与健康对照组之间p<0.06、*p<0.05和**p<0.01）。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004198.g007

微生物易位和免疫激活与结肠TJ转录表达降低相关

此前有报道称，经抗逆转录病毒治疗和未经治疗的HIV+患者的循环中微生物细胞壁成分LPS水平均升高[15]–[17]我们假设肠内TJ表达的减少介导了易位管腔微生物产物的可及性。为了证实在我们的HIV+队列中，指示LPS暴露的炎症介质升高，我们测量了可溶性CD14（sCD14）的血浆水平，这是一种LPS共受体，促进其与Toll-like受体-4结合，并从活化的单核细胞中脱落。与健康对照组相比，HIV+患者样本中sCD14水平升高(图8A). 此外，在HIV+和健康对照组受试者的降结肠中，LPS或sCD14水平与克劳丁转录物表达之间呈显著负相关（r = −0.79，便士 = 第4条0.059 vs.sCD14；和r = −0.76，便士 = 0.073（第2条vs.LPS）；图8B和8C)证明了末端结肠中TJ基因表达与HIV感染中免疫激活之间的直接联系。

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图8。微生物易位和系统免疫激活标记物水平与结肠TJ转录水平呈负相关。

（A）将来自HIV+患者和健康对照者的血浆样品解冻并用ELISA分析，以测量可溶性CD14（sCD14）的水平。用条形表示四分位范围，表示中间值(n个 = 两组均为21；#p<0.07）。血浆水平（B）免疫激活标记sCD14和（C）在HIV+和健康对照组受试者的降结肠中，微生物产物LPS分别与claudin-4和claudin-2的转录水平呈负相关。斯皮尔曼秩检验用于确定相关性。黑线表示线性回归估计。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004198.g008

讨论

肠道微生物易位源于大量肠道共生菌，是慢性全身炎症的主要驱动因素，不仅可以预测致病性HIV疾病的进展和对ART的不良反应，而且更重要的是，可能介导非艾滋病发病的免疫发病机制，包括心血管、肝脏和神经认知疾病，这些疾病缩短了长期接受抗逆转录病毒治疗的艾滋病毒感染者的预期寿命[51],[52]微生物易位升高归因于肠粘膜免疫缺陷和上皮屏障破坏的同时作用，这一假说在致病性SIV感染中得到了证实[41]在ART-naive HIV感染人群中，肠上皮结构受损[53],[54]，我们现在提供了第一个病毒抑制的HIV+患者肠道屏障破坏的直接分子证据，证实了我们的临床数据，证明ART治疗人群的肠道通透性持续增加[40]肠上皮破坏仅限于结肠，在分子水平上表现为通过转录控制下调TJ成分ZO-1、闭塞素、克劳丁-2和克劳丁-4。结肠上皮大体上保持完整，上皮细胞的堆积和相对丰度得以维持。此外，我们观察到，与在健康肠道中观察到的相对平坦或增加的梯度相反，TJ表达沿着HIV+结肠的近端到远端轴逐渐下降。最后，非TJ上皮特异性基因转录模式的同时改变表明，HIV+肠道中的紧密连接下调是通过修改转录调控导致整体肠上皮破坏的一部分。

在HIV和SIV感染期间，肠粘膜中CD4+T细胞的急剧快速耗竭导致推测肠道固有层免疫成分的损伤可能导致微生物产物向体循环的移位增加[18]的确，粘膜免疫缺陷始于HIV或SIV感染的早期阶段，其特征是在感染后几天内CD4+T细胞深度选择性耗竭[55]产生IL-22和IL-17的T细胞优先丢失[31],[56]中性粒细胞募集和巨噬细胞吞噬功能受损[41]和局部粘膜炎症[52],[57],[58]最近的文献表明，粘膜免疫缺陷和结构上皮恶化同时驱动微生物易位和HIV进展[59]肠上皮细胞凋亡在SIV感染早期发生，继发于与肠上皮细胞相关的SIV辅受体GPR15/Bob的相互作用[60]在人类中，上皮失调始于原发性HIV感染，并持续到慢性阶段，与上皮维持、生长和分化以及代谢和消化功能相关的基因下调[34],[61]我们的研究结果虽然强调了慢性HIV感染中TJ mRNA和蛋白表达的显著下降，但揭示了肠上皮细胞转录调控的更广泛变化，即使在病毒血症控制的情况下也是如此。我们的研究结果与慢性HIV感染中的整体上皮失调的概念相一致，而不是TJ中的特定紊乱，导致上皮屏障在分子水平上的结构恶化。

在非人类灵长类动物模型中，已证明上皮屏障破坏有助于SIV发病。对整个结肠组织的全面调查显示，慢性（非艾滋病和艾滋病）、未经治疗的SIV感染恒河猴的上皮屏障破坏，从多灶性结肠上皮破坏到上皮丢失和明显溃疡不等[41]。上皮细胞的这种破坏与就地脂多糖对固有层的浸润与局部免疫激活[41]我们的结果表明，在内镜和光镜水平上，肠上皮完整，HIV+结肠上皮屏障覆盖率没有降低，这与最近一项显示微生物易位的研究更为一致就地几乎没有人类肠上皮破裂的形态学证据[54]这些报告共同表明了人类和灵长类动物肠道屏障丧失的不同机制。然而，我们承认，通过有限数量的活检样本对结肠粘膜进行随机取样，限制了对人类的研究。我们的研究可能遗漏了临床医生看不到的上皮屏障丧失或溃疡的离散部位。因此，除了上皮TJ下调外，我们不排除上皮屏障在细胞水平上的破坏对HIV相关微生物易位的可能贡献。

虽然HIV感染期间整体肠上皮细胞功能受损，但在本报告中，我们关注的是HIV+肠上皮中TJ表达的减少，因为它促进了微生物产物向固有层的移位，并在全身范围内延长在体外有证据表明TJ下调是生殖器和肠粘膜上皮对直接接触HIV-1的反应[62]相反，史密斯等人。 [54]据报道，在慢性HIV感染期间，回肠和直肠中的claudin-2蛋白水平升高。类似地，Epple等人。 [53]HIV感染者十二指肠粘膜屏障缺陷，包括甘露醇通透性增加、claudin-1降低和claudin-2蛋白表达增加。这些早期结果来自未经治疗的病毒血症患者。除了claudin-2，我们的发现是互补的，并扩展了目前对具有有效病毒抑制的患者中HIV相关TJ破坏的理解。当Epple等人。结果表明，抗逆转录病毒治疗患者的小肠十二指肠粘膜屏障改变被逆转，我们系统地探讨了TJ沿结肠长度的中断，强调了TJ在结肠最远端下降部分的转录和翻译水平上的最大下调。小肠和大肠对HIV感染和ART反应的这些明显差异突出了前者的细胞凋亡和后者的细胞旁通透性的作用[25],[40],[60]这表明HIV沿着消化道损伤具有独特的病理学特征，并且必须始终通过研究人群的样本量和异质性来调节。

如上所述，我们之前的临床研究表明，在病毒抑制的HIV感染者中，小肠通透性增加主要是上皮细胞损伤的结果。与这些临床结果一致，在本报告中，我们发现TJ复合物仅在结肠下调，而不是小肠下调。在前抗逆转录病毒时代，晚期HIV疾病与小肠结构缺陷相关，包括绒毛萎缩和隐窝增生[63]最近，多项研究表明，疾病进展、易位引起的循环微生物产物和血浆肠脂肪酸结合蛋白（I-FABP）水平之间存在相关性[64]–[66]，是小肠上皮细胞凋亡的标志物[67]这些结果共同强调了凋亡导致上皮细胞损伤作为小肠屏障完整性丧失的主要机制的重要性。

我们还提供了与各种上皮特异性转录物的表达模式扰动有关的结果，这些转录物沿着HIV和健康肠道的近远轴，从回肠末端到降结肠。例如，在健康人群中观察到的ZO-1的远端增加模式与沿着正常结肠的基因表达图谱的发现相一致，该图谱确定了近端到远端片段差异表达的转录物，其中一个子集显示了表达水平的逐渐单调变化，特点是向远端结肠增加[68]另一个被鉴定的亚群包括具有两分近端的转录本与远端结肠表达模式。我们假设，这种沿着肠道纵轴的基因表达谱是由胚胎发育规划的，并通过与外部环境的相互作用而建立。小肠和大肠是消化道中不同的器官，分别具有消化和吸收营养物质以及重新吸收水和电解质的独特功能。结肠内连续的解剖区域也具有不同的功能，与负责粪便暂时储存的远端相比，近端部分相对更参与粪便内容物的固化[69]的确，这种功能差异反映并决定于回肠末端、近端和远端结肠在胚胎起源、形态和增殖能力方面的各种内在差异[70]与管腔内容物的相互作用，取决于饮食和微生物群，进一步改变上皮细胞，其程度取决于结肠转运时间，显示在近端结肠最慢[71]此外，管腔微生物群在数量和多样性上沿结肠长度移动[72]，结肠粘膜-粘膜-腔界面的化蛋白组分析显示，在宿主-巨噬细胞相互作用中存在显著的解剖区域相关差异[73]这种变异具有病理学后果，经典的结直肠癌“双结肠概念”描述了近端结肠和远端结肠肿瘤在临床、分子和流行病学特征上的显著差异[74]最新数据显示，不同结肠亚群肠道肿瘤中CpG岛甲基化子表型、微卫星不稳定性、LINE-1甲基化以及BRAF、KRAS和PIK3CA突变的频率逐渐增加[75].

我们承认，我们观察到的HIV-相关肠道TJ下调和基因表达模式改变可能是肠道环境和肠上皮细胞之间复杂相互作用的结果。虽然我们无法通过有限的样本量完全解决异质性的所有来源，但我们试图尽量减少可识别混杂因素的潜在影响，同时承认我们的方法涉及大量的多重比较，从而降低了我们的统计能力。而女性肠道转录物表达模式可能存在微小差异与男性[69]，我们的结论在我们队列中年龄匹配的男性受试者中得到了维持，消除了年龄和性别作为观察到的HIV相关变化的混杂因素。使用类似的策略，我们能够消除可检测到的病毒载量作为潜在的混淆因素。结肠切除术后沿结肠粘膜的基因表达谱被调整，以对应新的（近端或远端）位置[69]提供证据表明，结肠近远轴转录物表达水平对病理生理扰动或侮辱具有响应性。鉴于特定微生物组分对维持肠道结构屏障以及局部和系统免疫的重要性[76]、与HIV感染相关的管腔微生物组的改变（失调）[52],[77],[78]在结肠亚单位特异性方式下，会影响局部上皮功能和转录活性，导致HIV+和健康结肠之间近端到远端TJ成分表达模式的差异。重要的是要认识到管腔和粘膜相关肠道细菌代表两个不同的群体，粘膜相关群体表现出局部异质性[72],[79]对粪便微生物组的研究表明，HIV肠道中微生物组的多样性增加，组成发生改变，这种变化在接受抗逆转录病毒治疗的患者中持续存在[78],[80]同样，在经抗逆转录病毒治疗的艾滋病毒感染患者中也观察到了益生元粘蛋白粘附微生物群[81]，为系统研究HIV肠道纵轴的微生态失调铺平了道路，这可能直接影响肠道上皮细胞的代谢和功能。此外，与之前未描述的一组病毒相关的肠道病毒组在致病性SIV感染中的扩张[77]增加了病毒参与HIV进展和肠道病理学的可能性。

HIV相关的肠道失调也可能对固有层T细胞群产生影响。HIV感染者粪便中的总细菌负荷与十二指肠T细胞活化呈负相关，而肠杆菌目和细菌纲与十二指肠CD4+T细胞丢失有关[80].通过犬尿氨酸途径分解色氨酸的肠道细菌的富集[81]可能抑制Th17细胞的分化，Th17细胞是一种对维持粘膜免疫很重要的T细胞亚群，在HIV固有层中已被耗尽。我们实验室的最新数据表明，T细胞活化可以调节肠上皮屏障通透性，提示固有层T细胞对肠上皮TJ调节的可能贡献。

在ART时代，非艾滋病相关并发症现在是一个主要的临床焦点和关注点。系统性炎症可能是由肠腔循环微生物产物引发的，可能是导致HIV发病的一个因素。我们证明免疫激活标记物和TJ转录水平之间存在负相关，并且HIV结肠中TJ表达降低的近远端梯度为控制良好、经ART治疗的HIV感染患者肠道通透性增加提供了必要的机制，导致微生物移位和全身炎症。

支持信息

图S1。

男性HIV+患者结肠紧密连接转录物减少，而非回肠末端。在分离的总RNA中测定ZO-1、闭塞素、克劳丁-2和克劳丁-4转录物的校准归一化相对量（CNRQ）（A）结肠的(n个 = HIV+为8，n个 = 健康对照组为7）和（B）回肠末端(n个 = HIV+为8，n个 = 健康对照组6例）男性HIV+患者和健康对照组的活检。水平归一化为β-actin和eef1α1表达。使用Tukey的方法构建了盒子和胡须图，其中黑点识别异常值。对所有数据点进行统计分析，包括异常值（艾滋病毒+和健康对照组之间的*p<0.05，**p<0.01）。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004198.s001

（畅通节能法）

图S2。

病毒抑制的HIV+患者结肠紧密连接转录物减少，而非回肠末端。在分离的总RNA中测定ZO-1、闭塞素、克劳丁-2和克劳丁-4转录物的校准归一化相对量（CNRQ）（A）结肠的(n个 = HIV+为8，n个 = 健康对照组为13）和（B）回肠末端(n个 = 7代表HIV+，n个 = 8用于健康对照）病毒抑制的HIV+个体和健康对照的活检。水平归一化为β-actin和eef1α1表达。使用Tukey的方法构建了盒子和胡须图，其中黑点识别异常值。对所有数据点进行统计分析，包括异常值（HIV+和健康对照组之间*p<0.05，**p<0.01）。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004198.s002

（畅通节能法）

图S3。

HIV+患者降结肠紧密连接蛋白水平降低。从HIV+患者和健康对照者的降结肠活检中提取的总蛋白裂解物进行免疫印迹，以检测闭塞素、克劳丁-2、克劳丁-4、细胞角蛋白-18、GAPDH和β-肌动蛋白。通过密度分析对闭塞素、克劳丁-2和克劳丁-4线性密度范围内的特定条带进行定量，并在HIV+个体（包括可检测病毒载量的个体）和健康对照组之间进行比较。靶蛋白水平根据细胞角蛋白-18蛋白水平进行标准化。使用Tukey的方法构建了盒子和胡须图，其中黑点识别异常值。对所有数据点进行统计分析，包括异常值(n个 = 两组均为13人，但n个 = 第2条中健康对照组为12；#p≤0.07）。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004198.s003

（畅通节能法）

图S4。

男性HIV+患者下降结肠中紧密连接蛋白水平降低。从男性HIV+患者和健康对照者的降结肠活检中提取的总蛋白裂解物进行免疫印迹，以检测闭塞素、克劳丁-2、克劳丁-4、细胞角蛋白-18、GAPDH和β-肌动蛋白。通过密度分析对闭塞素、克劳丁-2和克劳丁-4线性密度范围内的特定条带进行定量，并在男性HIV+个体和健康对照组之间进行比较。靶蛋白水平根据细胞角蛋白-18蛋白水平进行标准化。使用Tukey的方法构建了盒子和胡须图，其中黑点识别异常值。对所有数据点进行统计分析，包括异常值(n个 = 艾滋病毒+感染11例，n个 = 健康对照组为7；#p<0.09）。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004198.s004

（畅通节能法）

图S5。

人类β防御素-3和E-cadherin在HIV+男性结肠中的表达存在差异。从肠道活检中分离出总RNA（A）人β防御素-3(n个 = 9代表HIV+，n个 = 健康对照组为7）和（B）E-钙粘蛋白(n个 = HIV+为8，n个 = 7用于健康对照）在男性HIV+个体和健康对照的结肠中进行测量。使用Tukey的方法构建了盒子和胡须图，其中黑点识别异常值。对所有数据点进行统计分析，包括异常值。（**p<0.01，在HIV+和健康对照组之间）。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004198.s005

（畅通节能法）

图S6。

人类β防御素-3和E-cadherin在病毒抑制的HIV+患者结肠中的表达存在差异。从肠道活检中分离出总RNA（A）人β防御素-3(n个 = 9代表HIV+，n个 = 健康对照组为12）和（B）E-钙粘蛋白(n个 = HIV+为8，n个 = 健康对照组为13），在病毒抑制的HIV+个体和健康对照组的结肠中进行测量。使用Tukey的方法构建了盒子和胡须图，其中黑点识别异常值。对所有数据点进行了统计分析，包括异常值（在HIV+和健康对照组之间，*p<0.05）。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004198.s006

（畅通节能法）

致谢

我们要感谢克利夫兰特别免疫科和大学医院消化健康研究所的医生和人员，特别是米歇尔·加拉赫、贝思·贝德纳奇克和温迪·布洛克，以及温迪·刘博士在患者招募方面的帮助。我们还要感谢Richard Jurevic博士、Scott Howell博士、Alex Huang博士、Kevin Cooper博士和Maria Hatzoglou博士的持续合作和支持，感谢Jeff Meisch博士和Tejpal Gill博士的有益讨论和技术支持。我们感谢克利夫兰免疫发病联盟（BBC/CLIC）的宝贵讨论和建议。我们感谢所有参与研究的志愿者。

作者贡献

构思并设计了实验：CYC ADL。执行实验：CYC SLA NTF。分析数据：CYC-PF。撰写论文：CYC ADL。

工具书类

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