摘要
人类诱导多能干细胞（hiPSCs）具有研究其他难以获得的细胞类型的潜力。关键在于hiPSC定向分化为功能性细胞系。这与神经疾病的研究特别相关，例如帕金森氏病（PD），其中中脑多巴胺能神经元在疾病进展过程中退化，但在死后才能获得。在这里，我们报道了一项关于人类多巴胺能神经元随时间生理成熟的详细研究体外试验。我们首先将hiPSC细胞系生成并分化为中脑多巴胺能神经元，并通过演示多巴胺的合成、释放和再摄取来进行综合表征，以确认多巴胺能功能。神经元培养物包括酪氨酸羟化酶（TH）和G蛋白激活的内向整流钾通道2（Kir3.2，以下简称GIRK2）阳性的细胞，它们代表易患PD的黑质致密部（SNc）神经元A9群。结合钙成像和电生理学，我们首次观察到慢自主起搏（<10 Hz）的成熟和成熟SNc多巴胺能神经元典型的自发突触活动。hiPSC衍生的神经元在神经元过程中表现出依赖于肌醇三磷酸（IP3）受体的细胞内钙从内质网释放，如钙波从树突顶端和远端以及胞体中传播。最后，神经元对多巴胺神经元特异性毒素1-甲基-4-苯基吡啶鎓（MPP+）敏感，该毒素降低线粒体膜电位并改变线粒体形态。成熟的hiPSC衍生多巴胺能神经元提供了一个以前无法访问的脆弱SNc多巴胺能神经的神经生理学定义模型，以弥合临床PD和动物模型之间的差距。
引用：Hartfield EM、Yamasaki-Mann M、Ribeiro Fernandes HJ、Vowles J、James WS、Cowley SA等（2014）《人类iPS衍生多巴胺能神经元的生理特性》。公共科学图书馆·综合9（2）：e87388。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0087388
编辑：Patrick Lewis，伦敦大学学院神经病学研究所，英国
收到：2013年8月2日；认可的：2013年12月24日；出版：2014年2月21日
版权：©2014 Hartfield等人。这是一篇根据知识共享署名许可协议，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源得到认可。
基金：这项工作得到了英国帕金森氏症协会（Parkinson’s UK）和牛津詹姆斯·马丁干细胞基金会（The Oxford James Martin Stem Cell Facility）颁发的纪念碑信托发现奖（Monument Trust Discovery Award）的支持。MYM持有詹姆斯·马丁研究奖学金，SC持有威康信托职业再进入奖学金（WT082260/Z/07/Z）。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。
竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。
介绍
中脑多巴胺能神经元可分为黑质致密部（SNc）和腹侧被盖区（VTA）。这些区域的神经元可以通过由SNc中的L型钙通道和VTA中的钠通道驱动的起搏活动来区分[1],[2]SNc神经元通常在成年啮齿动物大脑的急性切片中进行研究，具有缓慢的自发尖峰频率（2–5 Hz），伴随着亚阈值振荡[3],[4]这种特征性的放电模式使得它们在混合神经元群中很容易被识别。mDA神经元很大，有无髓鞘的轴突，每个细胞可以产生数千个突触。对大鼠黑质纹状体神经元的研究表明，累计轴突长度可达70厘米，单个SNc神经元支配多达6%的纹状体[5],[6]这种细胞受到广泛的生物能量需求，包括维持膜电位和传播动作电位，使这些细胞处于高度代谢应激状态。然而，在神经退行性疾病帕金森病（PD）中，这些特征性生理特性在多大程度上导致SNc多巴胺能神经元的选择性脆弱性尚不清楚。因此，人类SNc多巴胺能神经元的代表性神经生理学模型将有助于研究PD的分子过程。
一系列表达多潜能因子（OCT4、SOX2、KLF4、c-Myc、NANOG和LIN28）的重编程技术的出现，使得从体细胞中生成人诱导多潜能干细胞（hiPSC）成为可能[7],[8]我们利用这项技术，从正常人皮肤成纤维细胞（NHDFs）中重新编程iPSC。iPSC线的特征化在技术上具有挑战性，且耗时。在这里，我们改进了一些iPSC表征的原始方法，并应用了两种高通量的iPSC系表征方法：用于核型分析的单核苷酸多态性（SNP）分析（Illumina CytoSNP-12-v2.0阵列）和用于多能性的转录组学分析（PluriTest）。与传统的核型分析方法（荧光法现场中期扩散的杂交）和多能性（免疫抑制小鼠中的畸胎瘤形成）。
hiPSCs的优点是可以由携带疾病相关突变的患者产生，因此，将这些细胞分化为特定的细胞类型将允许在正确的细胞环境中研究疾病。几项研究利用了帕金森氏病（PD）患者的多能干细胞，并开始显示分化多巴胺能（DA）神经元的疾病特异性表型[9]–[13]然而，尚不清楚这些分化的DA神经元是否准确地模拟了易患PD的SNc中脑DA神经元的神经生理学。
在这里，我们报道了一项关于人类多巴胺能神经元培养物成熟后生理学的详细研究体外试验。我们首先对分化的mDA神经元进行了全面表征，通过多巴胺的合成、释放和再摄取来证明DA的功能。我们结合电生理学和钙成像来监测成熟中脑多巴胺能神经元在<10 Hz时自发缓慢起搏和突触活动的成熟度。神经细胞培养物包括酪氨酸羟化酶（TH）和G蛋白激活内向整流钾通道2（Kir3.2，以下简称GIRK2）阳性的细胞，代表PD中黑质神经元脆弱的A9群体。这些神经元为脆弱的SNc人多巴胺能神经元提供了一个高质量的模型，并弥补了临床帕金森病与多巴胺能系统动物模型之间的差距。
材料和方法
道德声明
用于重编程至多能性的正常人类皮肤成纤维细胞购自Lonza，Lonza.提供了以下道德声明：“这些细胞是在获得知情同意或合法授权的研究应用许可后，从捐赠的人体组织中分离出来的。”从这些成纤维细胞中提取的人类hiPS细胞系作为一个大型项目的对照系（伦理委员会：英国伯克希尔州中南部NRES委员会，健康研究局，专门批准了这部分研究-REC 10/H0505/71）。
hiPSC品系的产生与培养
iPS-NHDF-1和iPS-NHDFs-2源自NHDFs（Lonza；CC-2511）。重组质粒从Addgene获得（17220:pMXs-hc-MYC，17219:pMXs-hKLF4，17218:pMXs-hSOX2，17217:pMX-hOCT3/4，13354:pMXX-Nanog）[14]并使用Plat-GP逆转录病毒包装细胞系进行包装。成纤维细胞在第0天和第1天被5µg/ml聚brene和棘球感染（1200×g，16°C下45分钟）。将它们转移到丝裂霉素C灭活的小鼠胚胎饲养细胞（MEFs；远发的瑞士小鼠[15],[16]在牛津病理科建立并维护），在第4天使用0.1%明胶涂层板。从第5天起，细胞在补充了50µg/ml抗坏血酸和0.5µM丙戊酸的KnockOut™血清替代培养基（Life Technologies）中培养。每隔一天更换培养基（50%），并从第10天起用MEF条件培养基替换。
在第28天采集显示iPSC形态的菌落，每5-7天通过手工切割转移到MEF上。在分化之前，iPSC株系在传代当天适应无饲料条件，在mTeSR™1（StemCell Technologies）中的Matrigel涂层板（BD-Matrigel hESC-合格矩阵）上添加Rock抑制剂Y27632（10µM；Calbiochem）。
基因组完整性评估
基因组完整性通过Illumina Human CytoSNP-12v2.1芯片阵列（约300000个标记）进行评估，并使用KaryoStudio软件（Illuminia）进行分析。如前所述，iPSC系还接受了中期染色体扩散的M-FISH分析[17]对每个iPSC系的多个中期（>30）进行评估。
多功能测试
使用RNeasy试剂盒（Qiagen）从iPS-NHDF-、iPS-NHDFS-2和iPS-DF19.9.11TH中提取RNA，用于Illumina HT12v4转录组阵列分析。然后将数据文件上传到网址：www.pluritest.org如前所述，对多能性进行评分[18].
类胚体的产生
在添加Y27632（10µM）的mTeSR™-1培养基中，用TryplE分离无饲养层iPSC并接种到Aggrewell培养板中（每个EB 10000个细胞；干细胞技术）。4天后收获EB（每日mTeSR-1培养基变化75%），并根据需要进行分化。
分化为3个胚层
通过在多巴胺能分化培养基（如下所述）中涂敷明胶的盖玻片上培养，将类胚体定向至神经外胚层。在EB培养基中分化中胚层细胞（KO-DMEM补充2 mM谷氨酸、1%非必需氨基酸、55µM 2-巯基乙醇、0.5 mM抗坏血酸、100 U/ml青霉素/100µg/ml链霉素和胎牛血清（10%[v/v]；HyClone）。内胚层分化为中胚层，但没有抗坏血酸。
中脑多巴胺能神经元的分化
除非另有说明，否则所有材料均来自生命科技。简单地说，在神经诱导培养基1（补充有L-谷氨酰胺[2 mM]、N2补充物、牛血清白蛋白[1 mg/ml]、Y27632[10µM；Tocris]、SB431542[10μM，Tocris]、noggin[200 ng/ml]和抗生素/抗真菌[1%v/v]）中，将EB镀到Geltrex涂层板上。4天后，将培养基更换为神经诱导培养基2（作为NI1，不含SB431542和noggin，添加音速刺猬[SHH C24II]，200 ng/ml；研发系统），并培养6天。然后向培养基中额外添加成纤维细胞生长因子-8a（FGF8a，100 ng/ml；R&D Systems）、肝素（5µg/ml；Sigma）、抗坏血酸（200µM；Sigmi）和脑源性神经营养因子（BDNF，20 ng/ml），并根据神经玫瑰花结结构的外观维持7-14天。人工传代神经前体细胞并将其移植到最终分化培养基中的聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白涂层板上（DMEM/F12补充L-谷氨酰胺[2 mM]、N2补充、BDNF[20µg/ml]、胶质源性神经营养因子[GDNF，20µg/ml]、N6，2′-O-二丁基腺苷3′，5′-环一磷酸钠盐[dCAMP，0.5 mM；Sigma]，层粘连蛋白[1µg/ml]和抗生素/抗真菌药（1%[v/v]）。在进行实验程序之前，神经元在该培养基中再成熟2-6周（培养总时间为4-10周）。从神经化开始（EB期）开始培养的总时间为4-10周。
RT-PCR分析
使用Trizol（Life Technologies）从细胞中提取RNA，并使用RNeasy试剂盒（QIAGEN）纯化。根据制造商的说明，使用Superscript III（生命技术）进行逆转录。聚合酶链反应（PCR）建立如下：cDNA（25 ng）、AmpliTaq Gold 10x缓冲液（Applied Biosystems）、MgCl2（1.5 mM）、正向和反向引物（各1µM）、dNTP混合物（0.5 mM；Life Technologies）和1 U Taq聚合酶（AmpliTaq Gold，Applied Biosystems）。引物序列详见表S1.
免疫细胞化学
在免疫染色之前，细胞固定在4%多聚甲醛中，并在0.1%Triton-X100中渗透，但多巴胺染色的情况除外，其中细胞按照以下方案固定：细胞在“预固定溶液”（0.1 M二甲氨基甲酸钠和1%焦亚硫酸钠[w/v]，pH 6.2）中清洗，然后固定在3%[v/v]中戊二醛溶液（pH 7.5）15分钟。然后在“修复后溶液”中清洗盖玻片3次（0.05 M tris和0.85%[w/v]焦亚硫酸钠，pH 7.5）。在遵循常规免疫染色方案之前，在0.1 M硼氢化钠中进行还原步骤10分钟。简言之，盖玻片在10%山羊或驴血清中封闭1小时，然后在4°C下与一级抗体孵育过夜。抗体使用如下：α-肌动蛋白肌动蛋白（Sigma）、FOXA2（1∶250；研发系统）、Tuj1（1∶500；Covance）、TH（1∶500:Millipore）、α-突触核蛋白（1∶500m；BD biosciences）、LRRK2（1：1000；Epitomics）、Tau（1∶700，Peter Davies赠送的礼物）、多巴胺（1：500，Abcam）、SV2B（1：200，Synaptic systems）、IP三/BM（牛津大学Stuart Conway博士慷慨赠送）、DAT（1∶500；Alpha Diagnostics）、GIRK2（1∶200；Abcam）、VMAT2（1：500，Chemicon）、葡萄糖醛酸酶（1∶1000，Abcam。二级抗体（Alexa fluor，Life Technologies）在安装和分析之前在室温下培养1小时。图像是在徕卡SP5共焦显微镜上拍摄的。为了量化，从至少3个独立的差异中对多个随机场（每个盖玻片5-10个）进行成像。
Western Blot分析
对使用RIPA缓冲液提取的全细胞裂解液（tris[50 mM，pH8]，氯化钠[150 mM]，十二烷基硫酸钠[SDS；0.1%w/v]，脱氧胆酸钠[0.5%w/v]andnonidet-P40[1%w/v]）进行蛋白质印迹。装载前，样品变性。使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实现蛋白质分离，并转移到PVDF膜上。抗体使用如下：TH（1∶500；Millipore）、Dopa脱羧酶（1∶1000；Millipore）、DAT（1：1000；Thermoscific）。
高效液相色谱法（HPLC）
使用HPLC和电化学检测分析多巴胺含量。分化神经元在0.1 M高氯酸中采集。通过自动取样器（Jasco）过滤裂解液并将其注入HPLC系统，在250 mm Microsorb C18反相柱上分离单胺类，并使用LC-4B电化学检测器（十进制SDC，Antec）进行检测。流动相由甲醇（13%v/v）、NaH组成2人事军官4（120 mM）、EDTA（0.8 mM）和辛烷磺酸钠（3.2 mM），pH值为3.27。流速固定为1 ml/min，多巴胺含量通过比较样品与标准溶液来确定。相应的多巴胺含量归一化为蛋白质。
DAT函数
功能性多巴胺活性转运体（DAT）活性通过培养分化培养物和三H-DA（10 nM，GE Healthcare）。简单地说，在添加三H-DA在有或无mazindol（10µM，Sigma）的情况下。对于每个实验孔，在去除之前的所需时间内添加1 ml 3H-DA混合物。通过加入冰冷的PBS，然后在氢氧化钠（1M）中裂解来停止摄取。保留一小份样品用于蛋白质分析，同时用5 ml闪烁液（OptiPhase SuperMix，Perkin-Elmer）稀释剩余样品，并使用闪烁计数器（Beckman Coulter）进行定量。
全细胞膜片钳记录
在32°C下对6–10周分化的神经元进行电生理实验。使用Axon Instruments Multiclamp 700B放大器获得细胞内记录，并在10-20 kHz下数字化（Digidata 1440A）。胞外溶液如下（mM）：129 NaCl，5 KCl，2 CaCl2，1氯化镁2，30葡萄糖，25 HEPES，pH 7.4。用120 mM K D-葡萄糖酸盐、25 mM KCl、4 mM MgATP、2 mM NaGTP、4 mM-磷酸化-肌酐、10 mM EGTA、1 mM CaCl2和10 mM HEPES（pH 7.4，KCl在25°C时）填充全细胞贴片电极（4–7 MΩ）。将生物素（0.1%）添加到移液管溶液中，以标记记录的神经元，以便稍后进行细胞化学表征。在−70 mV的实验条件下测量的自发突触后电流是mEPSC的叠加。使用IgorPRO（Wavemetrics）和自定义脚本进行进一步的分析和统计。
钙2+成像
在补充有10 mM HEPES的HBSS中，用Fluo 4-AM（5µM，Life Technologies）给神经元加载60分钟。使用尼康TE 2000倒置显微镜和EMCCD相机（Evolve 128，Photometrics）以100 s的帧速率成像荧光发射（510–600 nm）进行荧光显微镜检查−137°C时。荧光测量值表示为比率（ΔF/Fo个)荧光（ΔF）相对于刺激前静止荧光（F）的平均变化o个). F的平均值o个通过在刺激前对几次扫描/帧进行平均获得。
线粒体膜电位（ΔΨ）的测量
用20 nM四甲基罗丹明甲酯（TMRM，Life Technologies）在37°C下加载细胞30分钟，测量线粒体ΔΨ。使用上述配备物镜（20x，N.A.0.75和40x，N.A.1.30）的倒置显微镜拍摄图像。测量TMRM激发（560 nm）和发射（590-650 nm）。添加羰基氰化物对三氟甲氧基苯腙（CCCP（10µM；Life Technologies）以降低膜电位。
结果
hiPSC的产生和表征
NHDFs通过逆转录病毒载体重新编程华侨城4号,hSOX2型,hKLF4型,hc-MYC公司和毫微克，在增强子分子的存在下。重新编程产生了6个形态上可接受的克隆，其中iPSC系NHDF-1、-2和-6传代良好，并被选择用于基因组完整性评估。免疫细胞化学检测，这些菌落对多能性标记TRA抗原、人Nanog、Oct4、SSEA-4和TRA-1-60呈阳性(图1A). 它们还表达内源性多能性基因的转录物，并且外源性重编程基因被沉默，正如半定量RT-PCR检测到的那样（）。
使用两种不同的方法评估基因组完整性：M-FISH和Illumina CytoSNP-12-v2.0阵列(图1B). M-FISH对>30个中期的分析表明，iPS-NHDF-1和-2的核型正常。然而，iPS-NHDF-6似乎存在克隆易位（t[X:2]）。HumanCytoSNP-12 BeadChip包含近300000个遗传标记，因此与M-FISH相比，它可以非常详细地解析基因组的完整性。CytoSNP阵列分析显示iPS-NHDF-6中的明显易位也是2号染色体短臂部分的扩增（由图1B)以及X染色体短臂末端的缺失（红色）（另请参见表S2). 简而言之，这两种方法都可以检测到遗传损伤，但都没有提供完整的信息。两种方法均将iPS-NHDF-1和-2归类为核型正常，因此用于进一步分析和下游实验。
接下来，我们试图评估这些细胞系的多能性，并从在体外分化为代表3个胚层的细胞类型。Aggrewells中分化为类胚体的细胞(图1C，左侧面板)通过血统特异性标记的表达评估，它们能够定向分化为所有三个种系：Tuj1（神经外胚层）、α-肌聚肌动蛋白（中胚层）和FoxA2（内胚层）(图1C).
最近，基于对多能干细胞转录组数据的分析，并将其与来自多种细胞和组织类型的全基因组图谱的大型参考集进行比较，开发出了一种更定量的多能干性评估[18]因此，我们在图1D)根据本分析，与之前描述的iPSC系列iPS-DF19.9.11TH（在中称为“C”[控制]图1D)[19]iPS-NHDF-1和-2以及iPS-DF19.9.11TH均被视为完全重新编程且具有多功能(图1D). PluriTest测量“多能性评分”（多能性基因的表达，高分与高多能性相关；iPS-NHDF-1:25.27，iPS-NHDF-2:29.51和iPS-DH19.9.11TH:31.73）和“新颖性”得分（非多潜能干细胞基因的表达，因此该得分与多潜能性呈负相关：iPS-NHDF-1:1.23，iPS-NHDFS-2:1.18和iPS-DH19.9.11TH:1.46）。
Illumina HT12v4转录组阵列结果已保存在基因表达总览（GEO）中，登录号为GSE43903。SNP数据集已保存在GEO中，登记号为GSE43902。这些都包含在超级系列GSE43904中。
中脑多巴胺能神经元的分化
在Rock抑制剂（Y27632）存在的情况下，通过将EB第一次电镀到组织培养板上（第0天），hiPSC被引导分化为mDA神经元(图2A). 我们之前观察到Y27632显著增加了来自人类胚胎干细胞（hESCs；图S2)因此，在整个分化过程中，使用Y27632补充培养基。中脑DA神经元分化是通过结合先前公布的方案发展而来的。通过双重SMAD抑制策略启动神经模式[20]使用形态发生声波刺猬（SHH）和成纤维细胞生长因子-8a对腹侧mDA命运进行规范[21]（FGF8a）(图2A). 通过抗坏血酸、BDNF、GDNF和cAMP实现神经元成熟[20]–[22]在分化的不同阶段进行RT-PCR(图2B)并表明内源性多能性基因华侨城4号和SOX2标准分化神经元表达下调。同时，神经祖细胞基因(内斯廷和PAX6)在玫瑰花结期前体细胞中上调，因此成功启动了神经模式。使用一组基因，我们观察了中脑多巴胺能神经元典型的分化神经元培养物中的基因表达。中脑转录因子发动机(EN1公司),FOXA2公司、钙结合蛋白、，PITX3接口和NURR1号机组在分化的神经元中表达。对分化的神经元进行了广泛的免疫细胞化学分析，发现了大量酪氨酸羟化酶（TH）表达细胞(图2C). 此外，分化神经元簇表达FOXA2，表明这些是腹侧中脑衍生神经元。在我们的分化培养物中对FOXA2+细胞进行了量化，我们发现约30%的TH+细胞表达该蛋白。(图S3). 此外，还检测到PITX3和NURR1蛋白，并进行了预期的核定位(图2D).
通过细胞计数量化分化效率(图2E). 两种细胞系分化为神经元的效率相似（NHDF1:39.59%±3.56；NHDF2:41.73%±2.023，以总细胞的百分比表示）。类似地，两种细胞株都产生了同等水平的TH+细胞（NHDF1:19.12%±2.05；NHDF2:21.5%±1.53，占总细胞的百分比）。大约一半的分化神经元是TH+（NHDF1:50.35%±3.4；NHDF2:52.54%±1.53）。因此，获得了较高比例的多巴胺能神经元。
此外，多巴胺能基因真实航向和运输终端交货随着分化的进行，表达量增加。特别值得注意的是GIRK2基因和蛋白的表达，它们与TH表达细胞共定位(图2F). 这表明分化的人群中含有典型的黑质致密部（SNc）A9多巴胺能神经元，这些神经元在帕金森病中很脆弱[23]神经元培养物的定量分析表明，32.5%的细胞表达GIRK2，53.5%的TH+神经元表达GIRK1，因此大量人群具有A9表型(图S3). 进一步分析表明，成熟TH+神经元也表达囊泡单胺转运体2（VMAT2），参与单胺在突触囊泡中的隔离(图2F).
替代拼接地图外显子10处于精细的发育控制之下，可以作为人类神经元发育成熟的指标[24]未分化hiPSCs只表达较短的外显子10−亚型，而分化神经元表达外显子10+与成人死后大脑神经元相似的亚型(图2G).
我们检测了与PD病理相关的几种蛋白的表达，包括富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2）和α-突触核蛋白。此外，tau蛋白和葡萄糖脑苷酶（GBA）也在分化的神经元中表达(图S5). 总的来说，hiPSC衍生的成熟多巴胺能神经元表达了广泛的PD相关蛋白，以准确地模拟优先神经元的脆弱性。
分化多巴胺能神经元具有功能
在证明分化的神经元培养物表达成熟mDA神经元典型的基因和蛋白质后，我们接下来研究了这些细胞的多巴胺能功能。随着分化的进行，检测到参与多巴胺合成的酶（TH、氨基酸脱羧酶[AADC]和DAT）(图3A).
多巴胺和TH共同标记的大簇细胞，表明这些细胞正在合成多巴胺(图3B). 为了证实这一点，进行了高效液相色谱（HPLC）(图3C). 在两种分化细胞系中均检测到多巴胺。用多巴胺前体L-3,4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA）孵育神经元，可显著增加多巴胺水平，表明AADC活性较高。此外，在培养基中检测到多巴胺（NHDF1:5.6±0.33 pmol/ml和NHDF2:8.73±0.90 pmol/ml；数据未显示）。使用三选择性DAT抑制剂mazindol可阻断H-DA摄取(图3D). 因此，这些成熟的多巴胺能神经元分化培养物能够合成、释放和吸收多巴胺。
分化神经元成熟过程中的生理特性
检测hiPSC衍生神经元培养物随时间的电生理成熟度在体外在神经元培养成熟时观察到的一个明显变化是，在400 ms去极化电流步长期间，他们能够重复激发动作电位（每个测得的时间点n>6）。成熟早期没有神经元(图4A)可以产生不止一个动作电位。去极化电流步骤中的尖峰频率持续增加，直到10周的成熟（没有进一步测量的时间点）。随着时间的推移，神经元获得了激发一系列动作电位的能力(图4A). 尽管在成熟的神经元培养物中可以看到细胞间的变异性（数据未显示），但去极化电流阶跃的峰值频率继续增加。重要的是，我们成功地从成熟的多巴胺能神经元中记录到，这些神经元获得了最大频率的动作电位放电，并显示出自主慢起搏活动<10 Hz(图4B; 第0天诱导分化后10周；n＞6个神经元）。此外，这些神经元培养物显示出自发的突触活动(图4C).
为了确定我们样本中是否存在TH+神经元，对选择的全细胞补丁神经元进行了事后分析。我们观察到约22%的生物胞素标记的神经元是TH+(图S4)这与我们的神经元培养物中TH+神经元总数的量化密切相关(图2E).
钙2+神经元成熟过程中的信号传递
钙2+在神经生理学中起着至关重要的作用，体内平衡失调与神经退行性疾病密切相关[25],[26]在帕金森氏病的啮齿动物模型中，L型钙的关键作用2+SNc-DA神经元细胞功能中的通道已被确定[27]，其中Ca2+通过激活L型钙进入2+通道有助于调节中脑神经元自主起搏的慢振荡电位[3].
鉴于钙的关键作用2+帕金森氏病的信号，我们接下来记录了自发钙的变化2+神经元成熟过程中的信号。负载Fluo-4-AM的神经元表现出缓慢而微弱的钙2+成熟早期的瞬变(图5,4周分化），之后Ca2+信号变得越来越清晰、越来越大(图5,6周后）。在这个阶段，这些自发的钙2+信号(图58周；视频S1)很可能依赖钙2+通过质膜流入。在啮齿动物模型中，SNc-DA神经元显示Ca2+躯体和过程中的振荡[3].自发振荡Ca2+信号(图5，10周；视频S1)在我们的人体模型系统中，还观察到了细胞体和神经元突起，这些突起被细胞外钙的急性清除所消除2+强烈表明这些信号是通过质膜启动的，很可能是通过依赖于电压的Ca2+通道(图5，8周）。
细胞内钙库中钙的释放
在神经元成熟的早期阶段，我们观察到自发Ca2+细胞内钙诱发的信号2+商店(图5,6周）。内质网（ER）是最大的细胞内钙2+储存并表达肌醇1,4,5-三磷酸（IP3）受体Ca2+-释放通道（IP3R）。第二信使IP3与IP3R的结合导致Ca的释放2+内质网的离子。这诱发了钙2+信号通路与中脑多巴胺能神经元兴奋性的调节有关[28]因此，我们接下来检查了成熟神经元（<8周成熟）中IP3R的表达。图6A显示了IP3R的分布模式。IP3R在TH+多巴胺能神经元（包括神经元过程）中表达。与它们的分布模式一致，IP3的细胞发酵类似物（IP3/BM）的应用诱发Ca2+释放，不仅来自神经元过程，也来自胞体(图6B).图6B上部蒙太奇显示Ca2+波从心尖和远端突起的传播相遇，下部面板显示出较大的钙2+在细胞体中观察到的瞬变。我们还检查了模型系统中溶酶体的分布模式。图6C显示溶酶体被LysoTracker™-红色染色。大量证据表明烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸（NAADP）动员Ca2+主要来自溶酶体[29],[30]与溶酶体阳性溶酶体的分布模式一致，应用NAADP-AM诱导Ca2+信号来源于胞体并通过神经元过程逐渐传播(图6C).
DA神经元线粒体的研究
线粒体功能障碍被认为是散发性和家族性帕金森病发病机制中的一个重要因素，最终导致中脑多巴胺能神经元的凋亡[31]。了解线粒体膜电位动力学尤其重要，因为ATP合成是由线粒体内膜的膜电位驱动的，而线粒体内膜电位与活性氧物种的产生有关（Matsuda Satoru 2013，氧化医学和细胞寿命）。图7A显示线粒体负载四甲基罗丹明甲酯（TMRM）。应用CCCP后线粒体膜电位的定量表明线粒体膜电位立即去极化。此外，我们还成功地在活体人类神经元培养物的单个线粒体水平上成像了膜电位的自发变化(图7A). 神经毒素1-甲基-4-苯基吡啶（MPP）+)由DAT选择性转运，DAT只在多巴胺能神经元中表达[32]来自hiPS细胞的神经元对MPP+的敏感性增加，如线粒体膜电位降低所示(图7B). 此外，MPP+治疗还导致线粒体断裂(图7B)线粒体氧化应激指标[33].
讨论
在这里，我们描述了hiPSC衍生多巴胺能神经元培养物成熟的生理特征。我们产生了一些重新编程的菌落，其中三个被选作严格分析。为了分析基因组完整性，我们将SNP分析与M-FISH进行了比较，以评估这两种方法的相对敏感性，尽管是在小范围内。Illumina CytoSNP分析允许查询整个基因组中的300000个单核苷酸多态性，比M-FISH分辨率高出许多，后者只能检测核型的大体变化。Illumina CytoSNP分析发现iPS-NHDF-6异常，但应注意的是，该方法无法检测到完全平衡的易位。SNP分析已在先前的hiPSC研究中用于分析亚微观基因组变化[34]因此，我们认为SNP分析是评估hiPSC株系的一种简单、准确和高通量的方法。
通过对未分化菌落和在体外分化细胞，结合使用PluriTest进行更多定量转录组分析[18]传统上，评估hiPSC多能性的金标准是根据视觉组织学评估，组织的生成让人想起畸胎瘤中的三个胚层。根据新的转录分析，我们认为这是不必要的。畸胎瘤形成研究耗时、成本高，需要大量动物，不适合产生大量hiPSC系的研究项目。此外，畸胎瘤检测主要是定性的，难以标准化[35]PluriTest使用了一个大型的综合数据库，其中包含来自许多不同hESC和hiPSC株系的全基因组转录谱，以及来自分化细胞类型以及发育和成体组织的数据。该系统还得益于能够区分完全和部分重新编程的细胞，而畸胎瘤检测无法做到这一点[36]基于微阵列的基因表达分析成本相对较低，并且大多数实验室都可以使用，因此，PluriTest为畸胎瘤的形成提供了一种经济、定量的替代方法。
Y27632在干细胞和祖细胞群体中用于预防细胞分离相关的细胞死亡和提高细胞存活率已得到充分证明[37],[38]。我们将这些原理应用于分化过程，发现在分化培养基中添加Y27632可以增加神经祖细胞集落的扩张，从而增加分化神经元的产量。
将NHDF-1和-2定向分化为多巴胺能神经元是成功的，并且在这两种细胞系中都具有类似的高效性，这与以前发表的数据一致[20],[39]为了确定我们不同文化的成熟度，我们研究了地图外显子10。地图剪接以前曾在表达所有6种亚型的hESC衍生神经元中进行过研究，其外显子10更多+tau蛋白在细胞成熟时表达在体外 [40]我们在我们的模型系统中发现外显子10+ 地图在未分化的hiPSC中不表达，但在成熟分化神经元中表达，其表达类似于死后大脑中成年神经元的表达。通过检查地图外显子10+剪接可以区分胎儿和成人神经元的表达模式。以前的报告表明，人胚胎干细胞衍生分化神经元的基因表达谱更像胎儿而非成人状态[41]然而，该研究中神经元在培养基中成熟的时间尚不清楚。从地图剪接数据，以及我们观察到的突触活动随时间的成熟，我们得出结论，我们的hiPSC衍生的神经元培养物包含功能成熟的成体细胞的代表性群体。
基因和蛋白表达分析表明，这些神经元培养物表达中脑多巴胺能神经元的标记，包括SNc A9标记GIRK2，表明该人群中含有PD的脆弱细胞类型[42],[43]对这些神经元的量化显示，超过一半（53.5%）的TH+DA神经元表达GIRK2，因此属于A9表型。确定了神经元亚群，其中发现了FOXA2阳性细胞簇（占总细胞的37%）。在对分化进行量化后，我们发现29.8%的TH+细胞也是FOXA2+，类似于底板衍生的腹侧DA神经元，这与以前的报道相当[21],[44]与PD相关的蛋白的表达，包括Tau、LRRK2、GBA和α-突触核蛋白，表明患者衍生hiPSC有潜力用于分析PD中优先神经元脆弱性的机制。事实上，一些研究已经开始揭示PD衍生hiPSCs的细胞表型[9、11、12、，[45], 42]. 通过证明其合成、释放和摄取多巴胺的能力，支持了与多巴胺稳态相关的蛋白质的表达。许多实验室已经对胚胎干细胞和诱导干细胞分化的人类多巴胺能神经元进行了表征[39],[46]–[48]但我们希望进一步研究多巴胺稳态，并发现分化神经元也通过使用三H-DA是一种仅用于评估从小鼠ESC和hiPSC分化的多巴胺能神经元DAT功能的技术在体外 [49],[50]总之，这些分析将有助于分析人类PD模型中的多巴胺稳态。
我们试图全面描述神经元在培养中成熟时的电生理特性。据报道，其他几种方案可从ESCs和hiPSCs产生功能性多巴胺能神经元[10],[39],[46],[48],[51],[52]在本报告中，我们成功记录了培养成熟的人DA神经元的功能特性。虽然通过记录移植到大鼠体内的人胚胎中脑移植物获得了一些发育数据，但来自人类多巴胺能神经元的数据有限。这些细胞的细胞外记录显示出典型的双相或三相动作电位，持续时间长（2-5 ms）且具有自发活动[53]我们在hiPSC衍生神经元的群体中观察到类似的模式，随着神经元培养的逐渐成熟，它们在啮齿类动物模型中也表现出典型的SNc-DA神经元的起搏放电模式特征(图4B)[54]在我们的培养物中进行的全细胞膜片钳实验表明，随着这些细胞的成熟在体外他们点燃多动作电位火车的能力增强了。这与EPSP的存在相一致，这与从出生后大鼠黑质纹状体神经元获得的数据一致，其中自发爆发活动最初是在低频率下发现的，但随着成熟的进行，平均放电率增加，直到观察到起搏器样活动。大鼠神经元在出生后4周内达到最大成年值，因此这些数据支持在体外培养10周后培养神经元多巴胺能起搏活性的成熟[55]注意，分化4周后，在我们的神经元培养物中观察到成人基因表达模式（MAPT外显子切片，图2G). 然而，成熟的生理行为直到成熟后很久才表现出来（培养6-8周；图4和5).
啮齿动物mDA神经元和计算模型的数据表明，L型钙在其中起着关键作用2+驱动这些细胞起搏活动的通道[56]–[58]最近研究表明，这些通道支持自主起搏活动，但不是必需的[3]尽管这仍有争议。一项对小鼠ES-衍生多巴胺能神经元的研究表明，随着神经元成熟，自发钙振荡的频率和幅度增加[59]我们在人类神经元中观察到类似的成熟模式。虽然在发育时间尺度上（小鼠和人类）存在差异，但我们观察到自发钙的发育模式类似2+信号。此外，在成熟人类神经元的神经元胞体和突起中均观察到自主起搏钙内流，这是SNc多巴胺能神经元的高度特征[3]在这里，我们已经证明hiPSC衍生的DA神经元是可兴奋的，并且它们可以产生钙依赖性动作电位。这些神经元随着时间的推移进行功能发育，在此期间它们表现出自发钙的不同特征2+信号，利用胞外和胞内钙2+商店。许多报告已经证明钙的重要性2+神经退行性疾病的调节。SNc-DA神经元具有自主的起搏活动，这种活动由L型钙支持2+通道[60],[61].钙2+-与腹侧被盖区相比，SNc-DA神经元的依赖性DA合成更大[62]此外，SNc-DA神经元表达较低水平的Ca2+缓冲蛋白，钙结合蛋白。在啮齿类动物模型中观察到的这些特征在对来自hiPS细胞的人类DA神经元的PD病理生理学建模时非常重要。
最后，我们证明这种人类多巴胺能神经元模型可以用于研究MPP+存在下的线粒体稳态。复合物I抑制剂MPP+被广泛用作中脑DA神经元的特异性毒素。将前体MPTP注射到灵长类大脑中，可以重现PD的大多数临床和病理特征，包括中脑DA神经元的选择性和特异性变性[63].MPP（MPP）+通过多巴胺转运体DAT进入细胞。先前的研究表明，MPP+不敏感细胞系，如COS细胞，可以通过DAT的强制表达而变得敏感[64]因此，我们假设在这些实验中影响我的MPP+的细胞表达DAT，因此表达DA神经元。hiPSC以前是由帕金帕金森病患者产生的[10]和PINK1[13]突变以及线粒体代谢和动力学模型的潜力也已被证明[65]通过研究完全功能的人类多巴胺能神经元中的线粒体，我们可能能够阐明它们参与PD的病理过程。
总结
在这里，我们首次对从hiPSC分化的人类多巴胺能神经元的培养物的生理学进行了全面分析。我们已经证明，这些细胞具有以前仅从啮齿类动物切片制备中定义的mDA神经元的生理特征，这使它们成为研究人类神经元生理学的优秀模型系统。现在可以实现将这些重新编程和分化协议应用于患者衍生细胞的潜力。我们相信，通过充分描述这些细胞的生理功能，我们可以为神经发育和疾病建模，特别是PD建立可靠的模型。
支持信息
hiPSC线的进一步表征。A） 重编程完成后内源性多能性基因表达的RT-PCR：Oct、Sox、Klf、Myc和Nanog。每个hiPSC品系（‘C’）的cDNA模板。阴性对照由每个hiPSC株的RNA模板（“R”）组成；无模板（H2O） ；质粒 = pMXS+相关多能性基因的外源版本。HUES2作为阳性对照；还显示了亲代成纤维细胞系NHDF。B） qRT-PCR评估衍生hiPSC系中相对于NHDF+Y的5个外源性转基因沉默（NHDF感染所有5个重编程载体，然后在第5天收获）；还显示了未感染的父母NHDF。C） 使用PowerPlex®16 HS系统进行16个位点的DNA指纹检测，以确认iPS-NHDF-1和iPS-NHDFS-2系源自亲本成纤维细胞NHDF。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0087388.s001
（畅通节能法）
中脑DA神经元培养的进一步量化。A） 使用GIRK2和TH免疫染色进行细胞计数，以量化A9多巴胺能神经元分化。大部分细胞表达GIRK2，但与整个细胞群相比，GIRK2+TH阳性细胞的总数相对较低。然而，超过一半的表达TH的细胞也表达GIRK2，这表明我们分化的中脑DA神经元中有很大一部分属于A9表型。B） 对FOXA2进行了类似的分析，再次发现大部分TH+神经元也为FOXA2阳性。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0087388.s003
（畅通节能法）
致谢
我们感谢牛津大学威康人类遗传学信托中心的高通量基因组学小组生成Illumina基因分型和转录组数据，感谢M.Yusuf和E.Volpi对hiPSC进行M-FISH分析，感谢L.Allcroft对互补基因组学进行DNA指纹分析。我们感谢P.Magill对手稿的批判性分析。
作者贡献
构思并设计了实验：EMH MYM SAC RWM WSJ。执行实验：EMH MYM HJRF JV SAC。分析数据：EMH MYM JV SAC。撰写论文：EMH MYM SAC RWM。
工具书类
- 1Chan CS、Guzman JN、Ilijic E、Mercer JN、Rick C等（2007年）“复兴”保护帕金森氏病小鼠模型中的神经元。《自然》447:1081-1086。
- 2Surmeier DJ（2007），帕金森病中的钙、衰老和神经元脆弱性。柳叶刀神经学6:933-938。
- 三。Guzman JN，Sanchez-Padilla J，Chan CS，Surmeier DJ（2009），黑质多巴胺能神经元的强健起搏。神经科学杂志29:11011-11019。
- 4Nedergaard S、Flatman JA、Engberg I（1993），豚鼠黑质致密部神经元中硝苯地平和omega-conoxin敏感性Ca2+的传导。《生理学杂志》466:727-747。
- 5Bolam JP，Pissadaki EK（2012）生活在边缘，有太多的嘴要养活：为什么多巴胺神经元会死亡。Mov Disord 27:1478–1483。
- 6Matsuda W，Furuta T，Nakamura KC，Hioki H，Fujiyama F，et al.（2009）单侧黑质纹状体多巴胺能神经元在新纹状体中形成广泛分布和高度密集的轴突树突化。《神经科学杂志》29:444–453。
- 7Takahashi K，Tanabe K，Ohnuki M，Narita M，Ichisaka T，et al.（2007）通过特定因子从成人成纤维细胞诱导多能干细胞。手机131:861–372。
- 8Yu J，Vodyanik MA，Smuga-Otto K，Antosiewicz-Bourget J，Frane JL，et al.（2007）从人类体细胞中诱导多能干细胞系。《科学》318:1917-1920。
- 9Cooper O、Seo H、Andrabi S、Guardia-Laguarta C、Graziotto J等（2012）《家族性帕金森病患者iPSC-derived神经细胞线粒体缺陷的药理学补救》。科学与运输医学4（414）。
- 10Jiang H，Ren Y，Yuen EY，Zhong P，Ghaedi M，et al.（2012）Parkin控制来自诱导多能干细胞的人中脑多巴胺能神经元的多巴胺利用。国家通讯社3:668–686。
- 11Nguyen HN、Byers B、Cord B、Shcheglovitov A、Byrne J等（2011）LRRK2突变型iPSC-derived DA神经元对氧化应激的敏感性增加。细胞干细胞8:267–280。
- 12Sanchez-Danes A、Richaud-Patin Y、Carballo-Carbajal I、Jimenez-Delgado S、Caig C等（2012）基于人类iPS的遗传性和散发性帕金森病模型中多巴胺神经元的疾病特异性表型。EMBO分子医学4:380–395。
- 13Seibler P、Graziotto J、Jeong H、Simunovic F、Klein C等（2011年），突变PINK1诱导的多能干细胞衍生的神经元中线粒体Parkin募集受损。神经科学杂志31:5970–5976。
- 14Takahashi K、Tanabe K、Ohnuki M、Narita M、Ichisaka T等（2007年）。通过定义因子从成人成纤维细胞诱导多能干细胞。131: 861–872.
- 15Chia R、Achilli F、Festing MF、Fisher EM（2005）《小鼠远交种的起源和用途》。《Nat genet》37:1181–1186。
- 16Gardner RL（1982）小鼠胚胎胚外内胚层细胞谱系和分化的研究。《胚胎实验形态学杂志》68:175–198。
- 17Moralli D、Yusuf M、Mandegar M、Khoja S、Monaco Z等（2011）人类ES和iPS细胞染色体分析的改良技术。干细胞修订版7:471–477。
- 18Muller FJ、Schuldt BM、Williams R、Mason D、Altun G等（2011）人类细胞多能性的生物信息学分析。自然方法8:315–317。
- 19Yu J，Hu K，Smuga-Otto K，Tian S，Stewart R，等（2009）《无载体和转基因序列的人诱导多能干细胞》。科学324:797-801。
- 20Chambers SM、Fasano CA、Papapetrou EP、Tomishima M、Sadelain M等（2009）通过双重抑制SMAD信号对人类ES和iPS细胞进行高效的神经转换。《国家生物技术》27:275–280。
- 21Cooper O，Hargus G，Deleidi M，Blak A，Osborn T，et al.（2010）将人类ES和帕金森病iPS细胞分化为腹侧中脑多巴胺能神经元需要SHH、FGF8a的高活性形式和维甲酸的特定区域化。分子细胞神经科学45:258–266。
- 22Schneider BL、Seehus CR、Capowski EE、Aebischer P、Zhang SC等（2007）人类神经祖细胞中α-同核蛋白的过度表达导致命运和分化的特定变化。人类分子遗传学16:651-666。
- 23Reyes S，Fu Y，Double K，Thompson L，Kirik D，et al.（2012）黑质和腹侧被盖区多巴胺神经元中GIRK2的表达。《计算机神经学杂志》520:2591–2607。
- 24Hernandez F、Perez M、de Barreda EG、Goni Oliver P、Avila J（2008）Tau作为发育、衰老和神经退行性疾病的分子标志物。货币老化科学1:56–61。
- 25Mattson MP（2007）钙与神经变性。老化细胞6:337-350。
- 26Surmeier DJ、Schumacker PT（2013）《帕金森病中的钙、生物能量学和神经元易损性》。生物化学杂志288:10736–10741。
- 27Surmeier DJ、Guzman JN、Sanchez-Padilla J、Goldberg JA（2011）《帕金森病中氧化应激的起源和治疗策略》。抗氧化剂氧化还原信号14:1289–2301。
- 28Morikawa H，Imani F，Khodakah K，Williams JT（2000）中脑多巴胺神经元的1,4,5-三磷酸肌醇诱发反应。神经科学杂志20:303–314。
- 29Calcraft PJ，Ruas M，Pan Z，Cheng X，Arredouani A，et al.（2009）NAADP通过双通道从酸性细胞器中动员钙。自然459:596–600。
- 30Patel S，Ramakrishnan L，Rahman T，Hamdoun A，Marchant JS，et al.（2011）内溶酶体系统作为NAADP敏感酸性Ca（2+）存储：双核通道的作用。细胞钙50:157–167。
- 31Exner N、Lutz AK、Haass C、Winklhofer KF（2012），《帕金森病的线粒体功能障碍：分子机制和病理生理后果》。EMBO期刊31:3038–3062。
- 32Kitayama S，Shimada S，Xu H，Markham L，Donovan DM，et al.（1992）多巴胺转运体定点突变不同程度地改变底物转运和可卡因结合。美国国家科学院院刊89:7782–7785。
- 33Wu S，Zhou F，Zhang Z，Xing D（2011）线粒体氧化应激通过线粒体裂变融合蛋白的差异调节导致线粒体断裂。FEBS J 278:941–954。
- 34Hussein S、Batada N、Vuoristo S、Ching R、Autio R等（2011），重编程至多能性期间的拷贝数变化和选择。《自然》471:58-62。
- 35Müller F-J、Goldmann J、Löser P、Loring JF（2010）《呼吁标准化用于定义人类多能干细胞系的畸胎瘤分析》。细胞干细胞6:412-414。
- 36Chan EM、Ratanasirintrawoot S、Park I-H、Manos PD、Loh Y-H等（2009年）活细胞成像将真正的人类iPS细胞与部分重编程细胞区分开来。《国家生物技术》27:1033–1037。
- 37Koyanagi M、Takahashi J、Arakawa Y、Doi D、Fukuda H等（2008）抑制Rho/ROCK通路可减少胚胎干细胞衍生神经前体移植过程中的细胞凋亡。神经科学研究杂志86:270-280。
- 38Zhang L，Valdez JM，Zhang B，Wei L，Chang J，et al.（2011）ROCK抑制剂Y-27632抑制分离诱导的小鼠前列腺干/祖细胞凋亡并提高其克隆效率。公共科学图书馆ONE 6:e18271。
- 39Kriks S，Shim JW，Piao J，Ganat YM，Wakeman DR，et al.（2011）人ES细胞衍生的多巴胺神经元有效植入帕金森病动物模型。《自然》480:547-551。
- 40Iovino M、Patani R、Watts C、Chandran S、Spilantini MG（2010）《人类干细胞衍生神经元：研究人类Tau功能和功能障碍的系统》。公共科学图书馆One 5:e13947。
- 41Patani R、Lewis PA、Trabzuni D、Puddifoot CA、Wyllie DJ等（2012年），利用全基因组基因表达和剪接分析研究人类胚胎干细胞衍生神经元对衰老和神经退行性疾病建模的效用。神经化学杂志122:738–751。
- 42Chung CY、Seo H、Sonntag KC、Brooks A、Lin L等（2005）中脑多巴胺能神经元的细胞类型特异性基因表达揭示了参与其脆弱性和保护的分子。《人类分子遗传学》14:1709-1725。
- 43Dauer W，Przedborski S（2003）帕金森病：机制和模型。神经元39:889–909。
- 44Sundberg M、Bogetofte H、Lawson T、Jansson J、Smith G等（2013）《基于hESC-、hiPSC-和非人类灵长类iPSC-源性多巴胺能神经元的分化效率和安全性的帕金森病改良细胞治疗方案》。干细胞31:1548–1562。
- 45Badger JL、Cordero-Lana O、Hartfield EM、Wade-Martins R（2014）《培养皿中的帕金森病——将干细胞用作分子工具》。神经药理学76:88-96。
- 46Cho MS、Lee YE、Kim JY、Chung S、Cho YH等（2008）从人类胚胎干细胞高效大规模生成功能性多巴胺神经元。美国国家科学院院刊105:3392-3397。
- 47Nguyen Ha N、Byers B、Cord B、Shcheglovitov A、Byrne J等（2011）LRRK2突变体iPSC-Derived DA神经元对氧化应激的敏感性增加。细胞干细胞8:267–280。
- 48Perrier AL、Tabar V、Barberi T、Rubio ME、Bruses J等人（2004）从人类胚胎干细胞衍生中脑多巴胺神经元。美国国家科学院院刊101:12543-12548。
- 49Rhee YH，Ko JY，Chang MY，Yi SH，Kim D，et al.（2011）基于蛋白质的人类iPS细胞可有效生成功能性多巴胺神经元，并可治疗帕金森病大鼠模型。临床研究杂志121:2326–2335。
- 50田丽萍，张仕，张英杰，丁建清，陈世德（2012）Lmx1b能促进胚胎干细胞向多巴胺能神经元分化，与帕金森病相关。生物技术快报34:1167-1174。
- 51Byers B、Cord B、Nguyen HN、Schule B、Fenno L等（2011）SNCA三倍体帕金森病患者iPSC-derived DA神经元积累α-突触核蛋白，易受氧化应激影响。公共科学图书馆·综合6:e26159。
- 52Cai J，Yang M，Poremsky E，Kidd S，Schneider JS，et al.（2010）来源于人诱导多能干细胞的多巴胺能神经元存活并整合到6-OHDA诱导的大鼠体内。干细胞发展19:1017–1023。
- 53Strömberg I，van Horne C，Bygdeman M，Weiner N，Gerhardt GA（1991）免疫抑制大鼠脑室内人类中脑异种移植的功能：电生理和神经化学分析。实验神经学112:140–152。
- 54Hahn J、Kullmann PH、Horn JP、Levitan ES（2006）D2自身受体慢性增强多巴胺神经元起搏器活性。神经科学杂志26:5240–5247。
- 55Tepper JM，Trent F，Nakamura S（1990）大鼠黑质纹状体多巴胺能神经元电活动的出生后发育。脑研究开发脑研究54:21–33。
- 56Amini B，Clark JW Jr，Canavier CC（1999）中脑多巴胺能神经元起搏器样和脉冲放电振荡的钙动力学：一项计算研究。《神经生理学杂志》82:2249–2261。
- 57Heyer EJ（1984）在原始分离细胞培养中生长的哺乳动物中脑腹侧神经元的电生理学研究。大脑研究310:142-148。
- 58Kang Y，Kitai ST（1993）大鼠黑质多巴胺能神经元节律性放电下的钙尖峰。神经科学研究18:195-207。
- 59Watmuff B，Pouton CW，Haynes JM（2012），来自小鼠胚胎干细胞的多巴胺能神经元的体外成熟：移植的意义。公共科学图书馆·综合7:e31999。
- 60Surmeier DJ、Guzman JN、Sanchez-Padilla J（2010）《帕金森病中的钙、细胞老化和选择性神经元脆弱性》。细胞钙47:175–182。
- 61Wilson CJ，Callaway JC（2000）黑质多巴胺能神经元的耦合振荡器模型。神经生理学杂志83:3084–3100。
- 62Mosharov EV、Larsen KE、Kanter E、Phillips KA、Wilson K等人（2009）胞质多巴胺、钙和α-突触核蛋白之间的相互作用导致黑质神经元的选择性死亡。神经元62:218–229。
- 63Porras G，Li Q，Bezard E（2012）《灵长类帕金森病建模：MPTP模型》。冷泉港透视医学2:a009308。
- 64Kitayama S、Mitsuhata C、Davis S、Wang JB、Sato T等（1998）MPP+毒性和质膜多巴胺转运体：利用表达野生型和突变型大鼠多巴胺转导体的细胞系进行的研究。生物化学生物物理学报1404：305–313。
- 65Cooper O、Seo H、Andrabi S、Guardia-Laguarta C、Graziotto J等（2012）《家族性帕金森病患者iPSC-Derived神经细胞线粒体缺陷的药理学救援》。《科学与运输医学》4:141-166。
