动物
所有小鼠具有相同的遗传背景(C57BL/6J)。根据我们研究机构的《实验动物护理和使用指南》,将小鼠分组放置在通风笼中,无浓缩结构,置于特定的无致病性环境中。几种菌株Btg2型负极/负极使用CRISPR/Cas9系统通过电穿孔产生小鼠[34]在大阪大学医学研究生院实验动物科学研究所工作。简言之,购买了以下试剂:Cas9mRNA、T7-NLS-hCas9-polyA(RIKEN BRC#RDB113130)和引导RNA(gRNA)。设计gRNA序列(5′-ACATGCTCCCGGAGATCGCC-3′)(http://crispr.mit.edu/)用于预测小鼠基因组中的独特靶点。CRISPR/Cas9介导的DNA切割的特异性由靶向染色体小鼠的单导向RNA(sgRNA)的20碱基序列所赋予Btg2型基因组序列。CCG三核苷酸,即原间隔区邻接基序(PAM),由Cas9识别,位于小鼠起始密码子下游16个碱基Btg2型基因组序列。通过解冻冷冻胚胎制备原核期小鼠胚胎(日本CLEA公司)。对于电穿孔,在1 解冻后h放入40个 μl无血清培养基(Opti-MEM,Thermo Fisher Scientific,USA),含400 ng/μl Cas9 mRNA和200 ng/μl gRNA,然后用5 mm间隙电极(CUY505P5或CUY520P5 Nepa Gene,日本千叶)在NEPA21超级电泳器中进行电穿孔。在引入Cas9和gRNA后,小鼠胚胎被转移到用七氟醚麻醉的雌性替代物的输卵管中(Mylan Pfizer Japan Inc.)。我们获得了Btg2型−/−11 bp缺失的小鼠Btg2型基因组序列。用以下引物PCR确认基因型:正向:5′-CTCCCCCGAGTGGTTATGAAAG-3′,反向:5′-TCAAGGTTCAGGCG-3′。当用6%丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR产物时,检测到两种产物:220 bp,表示Btg2型删除,和231 bp,表示野生型。野生型和野生型PCR产物的Sanger测序Btg2型−/−使用相同的一组引物(日本GENEWIZ、日本斋玉)对小鼠进行试验。为了排除非目标效应,杂合Btg2型+/−将小鼠回交六代至野生型C57BL/6J小鼠。
BCAS手术
BCAS的手术程序如前所述[4]. 简单地说,小鼠习惯于在手术室自由进食和饮水3-5次 手术前26天 °C,12小时/12小时光/暗循环。9-11周龄野生型小鼠和Btg2型−/−室友(体重,22–28 g) 接受BCAS或假手术。手术前,小鼠腹腔内注射三种麻醉药的组合:0.3 mg/kg盐酸美托咪定(日本曾耀县,日本福岛),4.0 mg/kg咪唑安定(日本东京阿斯特拉斯)和5.0 mg/kg酒石酸布托啡诺(日本岐阜明治精工制药公司)。对于假手术小鼠,暴露颈总动脉(CAA)并小心地将其从鞘中取出。对于BCAS治疗的小鼠,一个内径为0.18毫米的微线圈(日本静冈Samini)被连接到CAA的两侧。手术后3.0 腹腔注射盐酸美托咪定拮抗剂盐酸阿替帕米唑(日本曾亚库Kogyo)mg/kg,以促进安全苏醒。为了在手术后保持体温,37岁时用加热垫加热小鼠 °C。
行为测试
评估Btg2型删除BCAS模型的行为,我们进行了旷野和Morris水迷宫测试。手术后一个月,进行旷野试验:将小鼠置于一个立体塑料盒(30×30×30)中 厘米三,宽×长×高),允许自由漫游15次 术后一个半月,如前所述,进行Morris水迷宫测试以测试空间学习和记忆[35,36]. 试验在一个充满调节至环境温度的水的圆形水池中进行。对于隐藏平台训练,将透明平台浸没1.5 水位以下cm。游泳池位于一个有许多外部线索的测试室中。在第1天,进行了一个准备阶段,给小鼠90只 s为无平台自由泳,随后进行两次有平台训练试验(1次)。从第2天到第5天,每天进行四次训练试验(两次训练)。在每次试验中,将小鼠从四个伪随机分配的起点释放,并允许其游泳90 s.试验间隔约为10 分钟,间歇时间为2 h.登上平台后,允许小鼠在那里停留10天 然后将其放置在带有加热灯的保温笼中,直到下一次试验开始。如果一只老鼠找不到平台,它会被引导到平台上,并允许在平台上休息10分钟 s.进行探针测试24 最后一次隐蔽平台训练后h。在探针测试中,移除了隐藏的平台,并从相反的象限释放了老鼠,允许其自由游泳60次 s.在同一天最后一次探针测试后进行的可见平台测试中,平台被提升至水面以上。这些小鼠进行了三次持续90分钟的试验 s.所有实验均在每天大致相同的时间进行。在旷野和莫里斯水迷宫测试中,使用头顶摄像机跟踪小鼠的运动,并使用ANY迷宫软件(日本东京室町Kikai)对视频进行分析。
组织收集和制备
手术后7周,用异氟醚(日本大阪富士华高纯化学公司)麻醉小鼠,并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)加完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒经心灌注(瑞士巴塞尔罗氏诊断公司)。灌注后,大脑从颅骨中取出并沿矢状面分割。右半球分为皮层、海马区和其他区域,冷冻在液氮中,储存在−80 °C直到生化分析。左半球用4%多聚甲醛/PBS固定过夜,并包埋在石蜡中进行组织学分析。为了进行生化分析,组织在BioPulverizer(BioSpec Products,Bartlesville,OK,USA)中粉碎,该BioSpeg Products在干冰上预冷,然后储存在−80 °C。
定量实时PCR
使用RNeasy Lipid Tissue Mini试剂盒(荷兰芬洛QIAGEN)从粉碎样品中纯化总RNA,在无核酸水中洗脱,并储存在−80 摄氏度。使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix和gDNA去除剂(日本大阪东京)进行反转录。使用Luna Universal qPCR Master Mix(美国马萨诸塞州伊普斯威奇新英格兰生物实验室)在i1000热循环器上进行实时PCR,以检测Btg2型,Btg1型,Btg3型,Btg4型,Tob1(Tob1),Tob2(Tob2),Gfap公司,Cd11b号,特雷2,数据12,45加元,抄送68,80层/四层,抄送14、和β-肌动蛋白使用了以下引物:Btg2型,正向CGGGAAGAACCGACATGC和反向5′-GCCACTGAAAACCTTGAGTC-3′;Btg1型,正向5′-CACACATAGAGCGAGATCG-3′,反向5′-TGCGATACAACGGTAACCTG-3′;Btg3型,正向5′-AAGAAGAAATTGCGGCTGTT-3′和反向5′-CATCGGGATCACTCTGAAC-3′;Btg4型,正向5′-TTCAAGGGCAGGCTTTTAG-3′,反向5′-ACCTCATAGGATCGACCATA-3′;Tob1(Tob1),正向5′-ATGCAGCTTGAAATCCAAGTAG-3′和反向5′-AGGATACCTGCCCTTCATT-3′;Tob2(Tob2),正向5′-GCTGAGAGCGGCTTTCTGAGAAA-3′,反向5′-ACCACAGGGTCTACCTCC-3′;Gfap公司,正向5′-CGGAGACGCATCACCTCTG-3′和反向5′-AGGGAGTGAGGAGTCATCG-3′;Cd11b号,正向5′-GCATGTCAAGAAGAGAGAGATA-3′,反向5′-CTAAGCAGGTCATAAG-3′;特雷2,正向5′-TGCTGGCAAAGGAAAGGTG-3′,反向5′-GTGTGGGCTGGGAGAGAGG-3′;数据12,正向5′-GTTGACTCTGCTGATTGCCT-3′和反向5′-CCTTCCGCTGTCCCTTGA-3′;45加元,正向5′-GCCAAAACATATTACAT-3′和反向5′-TTAGGCGTTTCTGGAATC-3′;抄送68正向5′-CAATTCAGGGTGAAGA-3′和反向引物5′-TTGGCATTTCCACAGAGA-3’;80层/四层,正向5′-ATGGACAAACCAACTTTCAAGGC-3′,反向5′-GCAGACTGAGTTAGGACCAA-3′;抄送14,正向5′-CTCGTCCTTAAGCGGCTTAC-3′和反向5′-GTGCGGAGGTTCAAGATGTT-3′;和β-肌动蛋白,正向5′-AGTTGACGTTGACATCCGTTA-3′和反向5′-GCCAGAGAGTAATCTCCTTC-3′(Integrated DNA Technologies,Coralville,IA,USA)。所有引物序列均来自PrimerBank(https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank网站)除了那些80层/四层和抄送14[37],特雷2和数据12[38]、和Cd11b号和45加元[39]. 使用iCycler-iQ软件(Bio-Rad)量化和分析相对表达水平。使用ΔΔCt方法计算相对mRNA水平β-肌动蛋白作为每个特定基因扩增反应的内部控制。
ELISA检测
假手术/BCAS处理野生型和Btg2型−/−如前所述,通过ELISA测定小鼠大脑[38]. 简而言之,使用Polytron均质机(瑞士吕宋Kinematica)在冰镇RIPA裂解缓冲液(10 ml/g湿重;MilliporeSigma,马萨诸塞州伯灵顿,美国)含有0.1%SDS和完整蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏)。10万离心后克对于1 4时为小时 °C,上清液用适当的抗体组进行校准和ELISA分析。与辣根过氧化物酶(HRP)连接的Avidin-D(Vector Laboratories,加利福尼亚州伯林盖姆,美国)或抗兔IgG(H+L)、HRP结合物(美国威斯康星州麦迪逊,普罗米加)和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺底物(美国密苏里州圣路易斯,西格玛-奥尔德里奇)孵育后,在iMark平板阅读器(Bio-Rad)上进行比色定量。使用蛋白质测定BCA试剂盒(Fujifilm Wako Pure Chemical)进行每个样品中的蛋白质浓度。
组织学准备
用切片机(SM2000R,Leica Microsystems,Wetzlar,德国)将石蜡包埋的脑样品切片至5μm厚。包括海马区在内的四个非相邻切片被安装在MAS(Matsunami粘合载玻片)涂层玻璃载玻片上(日本大阪Matsunamic glass Ind.)。在组织学检查之前,将这些组织样本保存在室温下。
Klüver–Barrera染色
65岁时,将嵌入石蜡的部分脱蜡、水合并浸入Luxol Fast Blue溶液(日本东京Muto Chemical)中 °C过夜。切片在室温下冷却,在95%乙醇中冲洗,用0.1%碳酸锂处理,用70%乙醇冲洗,用含有10%乙酸的0.1%甲酚紫醋酸酯(复合化学)复染,并用Entellan New(Merck Millipore)进行安装。切片在BZ-X810显微镜上进行分析(日本大阪Keyence)。利用白质区(视束和胼胝体)的图像,将白质病变的严重程度分为四个等级,如Wakita等人所述[40]:正常(0级),神经纤维紊乱(1级),形成明显液泡(2级),有髓鞘纤维消失(3级)。评分由三个人以盲法进行。
免疫组织化学
对于免疫组织化学,脑切片脱蜡,水合,用0.1%Triton-X/PBS处理,用3%H处理2O(运行)2内源性过氧化物酶失活溶液。使用1%BSA/PBS封闭后,在4 °C过夜:兔抗GFAP多克隆(#1 IS524,安捷伦,圣克拉拉,加利福尼亚州,美国,1:1稀释),兔抗Iba1多克隆(#019-19741,富士胶片Wako Pure Chemicals,1:100稀释),大鼠抗Mac2单克隆(#CL8942AP,CEDARLANE,加拿大伯灵顿,1:1000稀释)。在PBS中清洗三次后,用辣根过氧化物酶(HRP)结合二级抗体(#W401B,山羊抗兔IgG,美国威斯康星州Promega,或#AP136P,山羊抗鼠IgG;Merck Millipore)处理切片,在1%BSA/PBS中稀释1:2500,2次 室温下h。在PBS中清洗三次后,用过氧化物酶底物Impact DAB(Vector Laboratories)处理HRP标记的载玻片。染色切片在BZ-X810显微镜上观察。为了进行免疫荧光观察,在室温下用抗兔IgG Alexa Fluor 488(#A11008,Thermo Fisher Scientific,OR,USA)或抗鼠IgG Alexa Fluxo 546(#A11081,Thermo-Fisher科学)在1%BSA/PBS中稀释1:100培养切片。荧光标记的切片用DAPI(Vector Laboratories)安装在VECTASHIELD安装介质中,并在LSM700共焦激光显微镜上观察(德国Oberkochen Zeiss)。
细胞培养和BrdU掺入分析
如前所述进行混合胶质细胞培养[41,42]. 简单地说,从17.5–19.5野生型和Btg2型−/−小鼠胚胎。20–25岁 体外培养第天(DIV),在DMEM/F-12中培养的胶质细胞与10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素以0.5×10的密度接种5在12孔培养板中的圆盖玻璃上的细胞/孔。对于炎症刺激,用100 ng/ml脂多糖(LPS)(Fujifilm Wako Pure Chemical),10 U/mlγ干扰素(IFNγ)(研发系统,明尼阿波利斯,明尼苏达州,美国)或100 ng/ml LPS加10 U/ml IFNγ,如前所述[43]. 48岁之后 h、 细胞与10个 μM 5-溴-2′-脱氧尿苷(BrdU)(BrdU-免疫组织化学试剂盒,#ab125306,Abcam,Cambridge,UK)24 h,同时暴露于炎症刺激或控制条件下。为了检测掺入BrdU的细胞,用10%H处理固定细胞2O(运行)2/MeOH与胰蛋白酶溶液和变性溶液反应,并与检测抗体(BrdU免疫组织化学试剂盒,Abcam)孵育。用Alexa Fluor 568-共轭抗羊IgG(#ab175713,Abcam)孵育后,用DAPI将细胞安装在VECTASHIELD安装培养基中。在LSM700显微镜上进行细胞学观察。
为了鉴定含有BrdU的混合胶质细胞中的星形胶质细胞和小胶质细胞,我们使用抗BrdU抗体和抗GFAP/抗Iba1抗体进行双重免疫染色。用0.3%Triton-X/PBS处理后,在0.01 M Tris-EDTA(pH 9.0). 用1%BSA/PBS封闭1天后 h、 将固定细胞与抗BrdU单克隆抗体(#66241-1-lg,ProteinTech,稀释1:300)和抗GFAP多克隆抗体(#IS524,Agilent,稀释1:1)或抗Iba1多克隆抗体在4℃孵育过夜 摄氏度。接下来,将样本培养2个 在室温下,用二级抗体、抗鼠IgG Alexa Fluor 546偶联物和抗兔IgG Alexa Flu 488偶联物(分别为#A11003和#A11008,Thermo Fisher Scientific,稀释比例为1:100)在室温下放置h。标本用DAPI安装在VECTASHIELD中,并在BZ-X810显微镜下观察。
统计分析
所有统计分析均使用JMP Pro软件(14.2版,SAS Institute,Cary,USA)进行。在动物实验中,通过(1)调整性别的线性回归模型,然后进行Tukey的HSD测试(当包括两性时),或(2)单向方差分析,然后进行Dukey–Kramer测试或Dunnett的多重比较测试(当只包括一种性别时),分析每个基因型是否具有BCAS的影响。Morris水迷宫测试结果采用重复测量单因素方差分析(ANOVA)和Tukey–Kramer测试进行分析。对于BTG/TOB家族的基因表达分析,Student’st吨-试验用于比较两种基因型。在细胞实验中,通过单向方差分析(ANOVA)和Tukey–Kramer检验分析基因型对治疗前后的影响。我们使用标准平均误差(SEM)作为图中按性别划分的调整值。三,4、和5和补充数字1,2、和三和图中非调整值的标准偏差(SD)。2,7、和8和补充数字4和5.第页-小于0.05的值被认为是显著的。个人效应Btg2型用二元或三元方差分析(补充表1).