体内特定的磷酸化位点决定波形蛋白中间丝的组装动力学

中间丝（IFs）由几类蛋白质组成，它们在序列、表达模式和各种组织中的丰度方面表现出显著的多样性(Chou等人，1996年;福斯和克利夫兰，1998年;Goldman等人，1999年;Omary和Ku，1997年;Skalli等人，1992年). 根据目前的知识，这些蛋白质的主要功能是提供对各种机械应力和可能的其他类型应力的保护。此外，干扰素还参与维持细胞形状和提供柔性支架，以维持细胞质、细胞器和其他细胞骨架成分的结构完整性和组织性(Chou等人，1997年;福斯和克利夫兰，1998年;Omary和Ku，1997年).

所有这些蛋白质的一个共同特征是一个卷曲的α-螺旋结构域，它有利于形成高度稳定的聚合物。影响聚合物稳定性和结构的一种方式是组成蛋白质的磷酸化。事实上，磷酸化似乎在调节这些蛋白质的结构和组装方面起着重要作用(埃里克森等人，1992年b; 稻垣祯一，1996年；Ku等人，1996年). 最近的研究表明，IF磷酸化还可能具有其他重要功能，包括调节IF与IF相关蛋白的连接，调节组织特异性结构功能(Foisner等人，1991年;Ku等人，1996年;Liao和Omary，1996年)以及通过应激激活激酶调节IF结构和功能(Caulin等人，2000年;Feng等人，1999年;Giasson和Mushynski，1996年). 其他研究提供了证据，证明IFs参与调节信号传导，而这种调节反过来又由磷酸化控制。例如，有人认为波形蛋白IFs的磷酸化依赖性组装-分解平衡将调节RhoA-结合激酶α的激活状态和靶向(Goto等人，1998年;Sin等人，1998年). 以类似的方式，角蛋白8和18被证明与肿瘤坏死因子介导的信号通路的衰减有关(Caulin等人，2000年; Inada，2001年）。此外，磷酸化调节角蛋白8/18的结合(Ku等人，1998年)和波形蛋白14-3-3(Tzivion等人，2000年)是许多不同信号蛋白的主要调节器(艾特肯，1996年). 最近还发现，Raf-1与波形蛋白有关，因此可以调节波形蛋白细丝的结构(Janosch等人，2000年).

IF蛋白是体外许多激酶的良好底物。这些包括有丝分裂特异性p34cdc2激酶[也被确定为波形蛋白体内激酶(Chou等人，1990年;Chou等人，1991年)]以及许多不同的刺激物特异性激酶，例如PKC的各种亚型(盖斯勒等人，1989年)，PKA(Ando等人，1996年)，钙/钙调蛋白依赖性激酶II（CAMK）(Ando等人，1991年;Tsujimura等人，1994年)，RhoA-结合激酶α(Sin等人，1998年)，c-Jun N末端激酶(Giasson和Mushynski，1996年;He等人，2002年)，p21-活化激酶(Goto等人，2002年)和p38激酶(埃里克森等人，1992年b;Feng等人，1999年; 稻垣祯一，1996年；Ku等人，1996年).

观察到与IFs相关的高组成型蛋白磷酸酶（PP）活性，表明这些蛋白质上有高的磷酸盐周转(埃里克森等人，1992年). 这种活性似乎与两种相间特异性磷酸化有关。一种类型的磷酸化具有组成常数，通常具有低磷到蛋白质的化学计量比，根据生长条件、分化状态等，这可能会暂时升高。另一种磷酸化与任何给定IF蛋白上的磷酸盐的快速组成周转有关，研究表明，PP抑制导致任何给定IF蛋白的磷酸化快速增加(Almazan等人，1993年;埃里克森等人，1992年;埃里克森等人，1992年b;Lee等人，1992年;Ohta等人，1992年).

虽然不同的实验室已经报道，波形蛋白是许多不同激酶的良好体外底物，具有许多不同的靶点(埃里克森等人，1992年b; Inagaki，1996），目前尚不清楚有多少已确定的体外位点与体内相关，但少数已确定的体内位点除外。此外，如此大量潜在体内位点磷酸化的生物学作用尚不清楚。在本研究中，我们试图在波形蛋白上建立所有重要的体内磷酸化位点。此外，我们想确定相间特异性波形蛋白磷酸化的功能意义，特别是它在波形蛋白组装/分解动力学中的作用(Miller等人，1991年;Prahlad等人，1998年;Vikstrom等人，1989年;Yoon等人，1998年). 我们的研究确定了波形蛋白上的大量高周转磷酸化位点，其中PKA和PKC是其中几个位点的潜在调节激酶。这些位点的磷酸化增加有利于解聚状态，由四聚亚基组成。我们表明，两个PKA特异位点（Ser-38，Ser-72）上的磷酸化导致波形蛋白亚基在体内的组装动力学减慢，而通过定点突变阻止这些位点上的磷酸化对亚基并入组装聚合物的速率没有显著影响。综上所述，这些结果表明，体内组装和拆卸的波形蛋白池之间的动态交换依赖于磷酸化，并通过四聚体亚基的交换发生。

为了进行代谢标记并使用1型和2A型蛋白磷酸酶抑制剂calyculin-A（cl-A）进行处理，BHK-21细胞在塑料组织培养培养皿（Falcon）上生长。用于微量注射的细胞生长在玻璃定位器盖玻片上（新泽西州文兰市Bellco glass）。在这两种情况下，所使用的培养基都是添加了10%（体积/体积）小牛血清（Gibco-BRL）的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）。代谢标记[³²P] 如前所述进行正磷酸盐、cl-A治疗和磷酸肽定位(Chou等人，1990年;埃里克森等人，1992年;埃里克森等人，1998年). 为了测定体内磷酸化位点，在四个100×20mm培养皿上用0.5 mCi/ml预先培养BHK-21细胞4小时[³²P] 无磷DMEM中的正磷酸盐与10%胎牛血清（最终磷酸盐浓度约为0.1 mM）。这种预孵育时间会使细胞ATP池饱和。细胞用冰镇PBS清洗一次，并在Laemmli样品缓冲液中溶解(莱姆利，1970年). 通过制备性SDS-PAGE首先在含有6M尿素的7.5%PAGE凝胶上分离体内标记的波形蛋白。然后对波形蛋白带进行电洗脱，并通过SDS-PAGE（7.5%丙烯酰胺）进一步纯化波形蛋白。分离的蛋白质可以被视为用SYPRO Orange（Molecular Probes，Eugene，OR）染色的凝胶上的一条单一带。然后对分离的波形蛋白进行如前所述的胰蛋白酶消化(埃里克森等人，1992年;埃里克森等人，1998年)使用波形蛋白与胰蛋白酶摩尔比为5:1的测序级胰蛋白酶。用于双重标签³²P和³⁵S、 BHK细胞用无met/cys-free RPMI（Sigma）预培养1小时，然后用250μCi/ml标记³⁵S（ICN）持续20小时。随后将培养基改为无磷DMEM培养1小时，并用³²P（Amersham）如上所述。用50 nM cl-A处理标记细胞30分钟。在含有120 mM NaCl、5 mM EGTA、20 mM Hepes、10 mM焦磷酸、0.5%Triton X-100、50 nM cl-A、1 mM苯甲基磺酰基氟化物和10μg/ml亮氨酸肽/安替比林/胃蛋白酶抑制素的缓冲液中溶解细胞，并在10000℃下离心克持续5分钟。收集含有纤维聚合物的颗粒，同时在200000℃下进一步离心上清液克持续30分钟，分离破碎的纤丝和可溶性亚单位。样品在SDS-PAGE上进行，在凝胶和膜之间有和没有四层铝箔的情况下进行放射自显影。差异表示来自³⁵S标记，用于计算样品中波形蛋白的具体含量。

在50 nM cl-A存在下培养细胞30分钟。此处理足以解聚至少50%的总波形蛋白池。然后在分别含有1%Triton X-100、120 mM NaCl、10 mM焦磷酸钠、1 mM苯甲基磺酰氟、1μg/ml抑肽酶和10μg/ml亮氨酸肽和安替比林的缓冲液中对细胞进行裂解。然后在10000下离心细胞5分钟克在Laemmli样品缓冲液中煮沸，使颗粒（部分1）和部分上清液蛋白（部分2）变性。剩余的上清液在200000℃下离心克30分钟后，上清液蛋白（第3部分）在Laemmli样品缓冲液中煮沸变性。这些分离得到的蛋白质分类如下：组分1:IF聚合物；组分2：碎片化IFs和可溶性亚单位的混合物；组分3：可溶性亚基。通过western blotting分析碎片化和可溶性波形蛋白池的增加。为了确定波形蛋白亚基的组成，如前所述，通过在室温下与增加的戊二醛浓度孵育子样品10分钟，使组分3中的波形蛋白交联(Sistonen等人，1994年). 将体内亚单位组成与用蛋白激酶A（PKA）磷酸化细菌表达的人类波形蛋白（见下文）获得的亚单位组成进行比较。在含有20 mM Hepes、60 mM NaCl、2 mM MgCl的缓冲液中，在活化的PKA催化亚基（Sigma）存在下，将纯化的人波形蛋白（1 mg/ml）培养30分钟₂5 mM EGTA和100μM ATP。在这种缓冲液中，波形蛋白完全聚合。PKA磷酸化后，60-80%的丝被解聚为可溶性亚基。通过在200000下离心30分钟来分离溶解的波形蛋白克如前所述，交联后通过SDS-PAGE测定亚基组成。

在含有20 mM Hepes、60 mM NaCl、2 mM MgCl的缓冲液中，在活化PKA存在下，将纯化的人类波形蛋白（1 mg/ml）培养30分钟₂5 mM EGTA和100μM ATP。在钙存在下进行蛋白激酶C（重组人PKCα；钙生物化学）磷酸化²⁺根据制造商的建议，磷脂酰丝氨酸和二酰甘油。钙/钙调素依赖性激酶（CaMK）由霍华德·舒尔曼教授提供。如前所述，将重组CaMKII-α（42 ng）与25μg重组波形蛋白和60 U钙调蛋白（Sigma）在100μl CaMK反应缓冲液中孵育(Holmberg等人，2001年). 与p37激酶（p37）和cdc2激酶（cdc2 K）的磷酸化反应完全如前所述进行(Chou等人，1990年;Chou等人，1991年). 在含有20 mM Hepes（pH 7.2）、1 mM MgCl的缓冲液中，以1单位/15μg波形蛋白浓度将磷酸化波形蛋白与重组α-异型兔肌肉蛋白磷酸酶1（Calbiochem）孵育，从而对PKA-磷酸化细菌表达的人波形蛋白进行磷酸酶处理₂，30 mMβ-巯基乙醇，10%甘油和1 mM MnCl₂，在30°C下保持20分钟。

用7.5%丙烯酰胺SDS-PAGE对体外PKA磷酸化和磷酸酶处理的波形蛋白进行一维电泳分析(莱姆利，1970年)，然后使用柯达X-Omat胶片进行放射自显影。使用闪烁计数器测定凝胶片中波形蛋白的放射性磷酸盐含量。

色氨酸裂解³²如前所述，在体外或体内进行P标记的波形蛋白磷酸化，然后进行二维磷酸肽定位(Chou等人，1990年;埃里克森等人，1992年;Skalli等人，1992年). 如上所述进行放射自显影。

用0.5 mCi/ml预培养BHK细胞4小时³²人事军官₄DMEM中含有0.1 mM磷酸盐。然后用PBS清洗细胞，并在Laemmli样品缓冲液中溶解。根据以下两步制备SDS-PAGE协议纯化体内标记的波形蛋白。标记的波形蛋白首先在30 cm的SDS-PAGE大凝胶上分离，放射性标记的波状蛋白被切除，蛋白质被电洗脱。在含有6 M尿素的30 cm SDS-PAGE凝胶上分离电洗脱材料，定量分离波形蛋白和结蛋白。用50%甲醇/水固定凝胶，根据放射自显影模式切除波形蛋白带，并在37°C下用10μg测序级胰蛋白酶在凝胶中消化全部波形蛋白（约100μg）过夜（德国博林格曼海姆）。用speed-vac干燥所得肽，并将其注入Aquapore RP-300 C-18（Brownlee/Perkin-Elmer，Shelton，Connecticut）微孔柱（流速0.1 ml/ml，abs.215 nm）。柱用洗脱缓冲液A（0.1%三氟乙酸/水）和B（80%乙腈，0.08%三氟醋酸/水）开发，梯度如下：0-15分钟0%B，15-85分钟40%B，85-100分钟60%B，100-110分钟100%B。以1分钟的间隔收集组分，并在滤纸上发现每一组分的小份。根据膜的磷光成像仪模式收集放射性标记部分。通过使用Aquapore OD-300 C8（Brownlee/Perkin-Elmer）微孔柱（流速0.1ml/min）进一步纯化放射性标记的级分，该柱具有与第一次分离相同的缓冲系统：0-10分钟0%B、10-25分钟30%B、25-60分钟50%B、60-90分钟100%B。

Edman手动降解基本上如前所述进行(埃里克森等人，1998年). 全日空航空公司₂-用Applied Biosystems 477A型蛋白质测序仪和Applied biosystem 120A型在线苯硫乙内酰脲氨基酸分析仪对胰蛋白酶肽进行末端氨基酸序列分析。这些样品被应用于一种聚合物涂层和预循环玻璃纤维过滤器。标准循环参数用于所需的循环次数。

人类波形蛋白cDNA，用myc-tag盒连接到C末端速度I位点位于vimentin编码序列的末尾，表示为大肠杆菌并完全按照之前的描述进行纯化(Chou等人，1996年). 将波形蛋白（HBEV）以1 mg/ml的浓度在-80°C的等分样品中储存在5 mM磷酸钠（pH 7.4）微量注射缓冲液中。

通过用丙氨酸替换PKA磷酸化的主要位点Ser-38和Ser-72，获得了人类波形蛋白的突变版本。这是通过使用克隆到M13噬菌体载体的人类波形蛋白cDNA，按照Kunkel描述的定点突变程序完成的(昆克尔，1985年). 这种方法使用含尿嘧啶的单链DNA模板。在此基础上，利用两个引物S38:a-TCCACCGCACCTACCCCCTGGGCGCG；和S72:A——GTGCGCCTGCGGAGC-GCCGTGCCCGGTG。通过双链DNA测序证实了突变。使用巴姆HI和Xho公司限制性内切酶（Gibco-BRL）。通过将突变片段替换为相应的野生型波形蛋白片段，将该～400碱基对片段克隆到pET-7载体中，生成S38:A/S72:A pET-7-myc标记的人类波形蛋白cDNA构建体。

借助配备Narishige NT-88液压微注射微操作器的蔡司倒置相控显微镜，在pH 7.4的5 mM磷酸钠缓冲液中以1 mg/ml的速度将Myc标记的波形蛋白微量注射到BHK成纤维细胞中(Vikstrom等人，1989年). 在微量注射后的不同时间点，细胞在-20°C下用甲醇固定5分钟。使用含有针对myc标签的单克隆抗体9E10的未稀释Tris-buffered（pH 8.0）培养上清液进行间接免疫荧光（American Type culture Collection，Bethesda，MD）。为了进行双重标记，使用了一种针对BHK波形蛋白的多克隆抗血清(Yang等人，1985年)二级抗体为：FITC-标记的驴抗鼠IgG和lissamine-rodamine标记的驴抗兔IgG（Jackson ImmunoResearch Laboratories），所有这些抗体也在PBS中以1:20稀释。重组波形蛋白通过PKA磷酸化，如上所述。通过添加8 M尿素停止反应。在5 mM磷酸钠缓冲液（pH 4）中透析尿素。在此过程中，波形蛋白被复性，但PKA没有恢复其活性。使用LSM 410共焦显微镜（Carl Zeiss，Inc.，Thornwood，NY）进行显微镜观察，该显微镜配备100倍浸油、1.3 NA物镜和氩/氪激光。

特征明确的蛋白磷酸酶抑制剂的可用性使得在体内对IF蛋白进行超磷酸化并表征其特定的磷酸化位点成为可能。为此，我们使用了特定的1型（PP1）和2A型（PP2A）蛋白磷酸酶抑制剂calyculin-A（cl-A），其浓度足以显著下调这两种主要磷酸酶的细胞活性(Eriksson等人，1998年;Li等人，1993年). 先前对BHK-21细胞的研究表明，在这些条件下用cl-A短期治疗不会诱导任何细胞毒性或细胞凋亡的迹象，并且在20 nM时对IFs的影响是可逆的(埃里克森等人，1992年). 蛋白磷酸酶抑制导致快速的剂量和时间依赖性升高³²波形蛋白的P标记(图1A). 此外，这种提高的磷酸化导致干扰素快速分解成颗粒和非颗粒组分(图1B). 为了阐明分解蛋白池与组装聚合物的相对磷化学计量比可能存在的差异，我们对BHK细胞进行了代谢双重标记[³²P] 正磷酸盐和[³⁵S] 蛋氨酸。具体³²然后将P活性测定为³²P（P）/³⁵在PP抑制后，颗粒组分和非颗粒组分的特异性标记显著增加。具体³²与两种丝状组分相比，P标记位于真正可溶的亚单位部分，而粒化波形蛋白组分（丝状和碎片）的标记程度相同(图1C、D). 所有组分似乎都在相同的位置被磷酸化，因为当对从所有三个组分中分离的波形蛋白进行磷酸肽定位时，磷酸肽模式中的组分之间没有明显差异（数据未显示），这表明它们的磷酸化位置是相同的。

为了更好地理解组装的波形蛋白聚合物和分解的亚基之间磷酸化调节平衡的分子动力学，我们测定了在体内和体外波形蛋白过度磷酸化后释放到非成粒蛋白池中的亚基的性质。用50 nM cl-A处理细胞30分钟，并按所述进行裂解（见材料和方法）。在200000℃离心细胞提取物后，释放的亚单位与增加的戊二醛（GA）浓度交联克交联波形蛋白亚基的近似分子量为220kDa，表明非成粒蛋白质的主体是四聚体(图2B). 该结果与波形蛋白与PKA体外磷酸化的结果一致(图2A). 为了进行比较，通过蔗糖梯度离心分离分解的波形蛋白亚基。与交联实验一致，非成粒波形蛋白出现在与四聚体分子量相对应的组分中（数据未显示）。

我们使用从³²在cl-A存在和不存在的情况下培养P标记细胞，以确定波形蛋白的体内磷酸化位点。在从未处理的对照细胞获得的图谱上可以观察到九种标记的磷酸肽，其中一些标记很弱，很难在对照磷酸肽图谱上辨别(图3A). 同样的磷酸肽，具有显著增加的标记，可以在从磷酸酶抑制的细胞获得的波形蛋白磷酸肽图谱上解析(图3B). 结论是，这些磷酸肽在波形蛋白上含有组成性磷酸转换位点。其中五个位点（肽1、肽2、肽3、肽4和肽7）含有～80-90%的标记增加，表明这些肽含有相间特异性高磷酸转换位点。后一个观察结果与之前的研究一致(Chou等人，1990年;Chou等人，1991年).

通过体内制剂测定的磷酸肽图谱与通过体外磷酸化波形蛋白获得的磷酸肽图进行了比较，波形蛋白具有三种相间特异性(图3D-F)或两种有丝分裂波形蛋白激酶(图3G，H). 两种主要的相间特异性磷酸肽与PKA产生的磷酸肽共迁移（肽1和2，图3D). PKC产生的磷酸肽对应于体内图谱上的小位点（肽5、6和8，图3E). 如前所示，有丝分裂波形蛋白激酶p37和cdc2产生的主要磷酸肽(Chou等人，1990年;Chou等人，1991年)对应于主要的有丝分裂特异性肽(图3G，H). 然而，这些激酶产生的磷酸肽也被鉴定为间期图上的小斑点，这可能部分是由于培养物中存在少量非同步细胞。或者，这些肽也可能包含较小的相间特异性位点。例如，PKC还生成与cdc2生成的肽8对应的磷酸肽。此外，还有其他脯氨酸导向激酶可以生成与cdc2激酶获得的磷酸肽模式相对应的磷酸肽。CaMK显示的磷酸肽与肽图上的肽2接近(图3F). 然而，当通过混合样品和人工Edman降解（数据未显示）检查所有这些肽的身份时，结果表明肽2与CaMK生成的肽不同。

对于磷酸肽鉴定，我们使用相当高浓度（50 nM）的PP抑制剂cl-a对BHK-21细胞进行体内标记，以最大限度地标记单个磷酸化位点。当短时间使用时，发现该浓度可抑制>95%的PP1/PP2A活性（数据未显示），而不会产生明显的细胞毒性作用。高纯度³²通过制备的两步SDS-PAGE协议获得P标记的波形蛋白（参见材料和方法）。用Sypro Orange染色的2D凝胶的荧光分析或凝胶的放射自显影分析无法检测到其他污染蛋白质（结果未显示）。然后用胰蛋白酶切割磷酸化的波形蛋白，并在C-18反相微孔HPLC柱上分离得到的磷酸肽。七个主要的放射性标记的级分（级分a-g，图4A)已解决。当这七个组分在C-8反相微孔HPLC柱上进一步纯化时，八个放射性标记肽可以被分解，因为组分C产生两个肽（肽3和肽4，图4B). 在第二次分离时，与标记组分对应的UV峰表明，在所有情况下，组分都相对较好地分解为单个磷酸肽(图4B). 根据疏水性对肽进行编号，并对每个肽进行测序，进行人工Edman降解，并通过MALD-TOF MS进行分析。根据从HPLC分离的磷酸肽测序中获得的信息(表1)，来自MALD-TOF质谱仪上获得的分子量（数据未显示），以及来自手动Edman降解的结果(表1)磷酸肽及其磷酸化位点的身份可以被指定。在许多情况下，质谱分析产生了与天然肽和磷酸化肽相对应的质量，并添加了一个或两个磷酸基团，从而证实了磷酸肽的分配（数据未显示）。在某些情况下，在假定的磷酸丝氨酸位点测序期间观察到脱氢丙氨酸，在这些情况下，这进一步支持磷酸化位点的分配（在测序期间，脱氢丙酸通过磷酸化-Ser的β-消除自发形成）。Edman降解也在基于TLC的磷酸肽图谱上进行(图3). 根据获得的结果与理论胰蛋白酶波形蛋白肽序列相吻合，并结合先前分离的已知波形蛋白磷酸肽的迁移特性的经验，波形蛋白磷肽图上斑点的肽身份可以被赋予相对较高的确定性(表2). 肽1和肽2来自远N末端区域，代表该区域丝氨酸延伸的两种不同的磷酸化变化。在肽图上的磷酸肽（肽5,6,7；表2). 这些结果表明，在远N末端区域有一个非常复杂的磷酸化模式，包括Ser-4、6、7、8和9，一些波形蛋白分子将包含一个带多个磷酸丝氨酸的高电荷N末端。这些地点是PKC的主要目标(图3,表2). 肽3含有两种磷酸丝氨酸，即Ser-71和72。这些网站是PKA的主要目标(图3,表2). 肽4来自C末端区域，包含两个磷酸化位点Thr-457和Ser-458，这两个磷酸化位点是根据第六个Edman循环的无释放和Chou等人的数据分配的(Chou等人，1996年). 这些位点是有丝分裂p37激酶的靶点(Chou等人，1991年;Chou等人，1996年). 肽5在Ser-55上磷酸化，Ser-55是先前确定的cdc2有丝分裂靶点(Chou等人，1990年). 肽6包含两个磷酸化位点，Ser-38和Ser-41。除Ser-71和72外，Ser-38是PKA的主要靶点(图3,表2). 肽7包含一个来自C末端区域的指定磷酸化位点Ser-429（后遗症椎间盘上保留了大量标记，因此Thr-435和/或Ser-437可能是磷酸化靶点）。肽8也来自C末端区域，包含一个磷酸化位点Ser-418。本研究过程中确定的波形蛋白体内磷酸化位点见图5（新发现的体内磷酸化位点用星号表示）。

在确定的波形蛋白磷酸化位点中，两个主要位点（Ser-38、Ser-72）是PKA位点。为了评估这两个磷酸化位点在调节波形蛋白IF组装动力学中的作用，我们构建了myc标记的人类波形蛋白cDNA的突变版本，其中这些丝氨酸残基的密码子被丙氨酸编码的密码子（S38:a/S72:a）取代。等量两种野生型产生的2D胰蛋白酶磷酸肽图谱的比较(图6A)或S38:A/S72：一种突变的波形蛋白(图6B)体外PKA磷酸化后，表明含有Ser-38（肽1）的肽的磷酸化几乎完全丧失，而含有Ser-72（肽2）的肽上的磷酸化水平降低。肽2上的残余磷酸化可能源于Ser-71的磷酸化，已证明Ser-71是PKA的一个次要位点(盖斯勒等人，1989年). 肽5也显示磷酸化显著降低。这种差异很有趣，因为它表明Ser-38和Ser-72的磷酸化使波形蛋白更容易受到肽5（Ser-4、6、7、8和9）上丝氨酸磷酸化的影响。与S38:A/S72:A波形蛋白（每种7.5μg负载在7.5%丙烯酰胺SDS-PAGE上）相比，野生型的特异性PKA诱导的磷酸化分析显示，S38:A/S72:A波形蛋白的磷酸化减少了50-65%(图6C)，野生型波形蛋白的磷酸化总水平从1.6-1.7摩尔/摩尔降低到S38:a/S72:a波形蛋白0.6-0.8摩尔/摩尔（结果为五个实验的值范围）。

体外磷酸化后，野生型和S38:A/S72:A波形蛋白表现出高速（200000）导致颗粒和上清液组分中蛋白质百分比的差异克)激酶反应混合物离心。颗粒蛋白质的量与相应蛋白质中的磷酸盐量成反比。对于野生型蛋白，体外PKA磷酸化后30-40%是可丸化的，而80-85%的PKA-磷酸化S38:A/S72:A波形蛋白是可丸化成丸的（数据未显示）。

为了评估磷酸化对体内IF形成的影响，将野生型、PKA磷酸化野生型和S38:A/S72:A myc标记的波形蛋白微量注射到BHK-21细胞中。使用PKA是因为Ser-38和Ser-S72在磷酸酶抑制细胞的BHK-21细胞中显示出最大的磷酸化增加。使用针对myc-tag的单克隆抗体和多克隆抗波形蛋白，将微量注射蛋白与内源性BHK-21细胞波形蛋白区分开来(Yang等人，1985年). 微量注射后，未磷酸化的野生型波形蛋白立即在细胞质中形成小聚集体（数据未显示）。注射后10分钟内，蛋白质开始形成短的丝状杆(图7A，a)与内源性波形蛋白IF网络紧密结合而延长。标记蛋白在注射后30分钟内完全并入内源性IF网络(图7A，b-c). 当微量注射PKA磷酸化的野生型波形蛋白（见材料和方法）时，可以看到明显的差异。10分钟后，在微注射细胞的细胞质中只看到弥散荧光模式(图7A，d). 30分钟后，可见短丝状杆(图7A，e)，但直到注射后3小时，抗myc才发现IF的扩展网络(图7A，f). 与野生型波形蛋白的动力学相比，S38:A/S72:A突变的波形蛋白在组装动力学方面没有表现出任何显著差异。3小时后，所有三种注入形式的波形蛋白都完全组装，这表明在使用内源性波形蛋白（7B、a、b和c）特异性多克隆抗体进行双标记免疫荧光分析时，与内源性波状蛋白共定位。图像显示了S38:A/S72:A突变波形蛋白的行为，但所有三种注射蛋白都获得了类似的结果。综上所述，该分析表明磷酸化对纤维组装有显著影响，但缺少两个关键磷酸化位点不会在更大程度上影响组装。

众所周知，干扰素是高度动态结构，其组成蛋白在组装的干扰素聚合物的主要隔室和极少数分解的干扰物亚基之间进行活性交换。为了实现这些动态特性，IF蛋白需要一种活性支持机制，该机制维持组装和拆卸的蛋白质组分之间的亚基交换。可逆磷酸化是一种可能维持这种交换的机制。我们的结果是通过抑制体内去磷酸化以及研究野生型和部分磷酸化缺陷型波形蛋白磷酸化和非磷酸化形式的体内组装而获得的，表明波形蛋白聚合物和解聚亚基之间的平衡以及亚基交换的周转都受到激酶-磷酸酶平衡的调节。这种调节是基于主要位于波形蛋白N末端区域的许多磷酸化位点的可逆磷酸化。

根据之前的研究(埃里克森等人，1992年;Toivola等人，1997年)我们在此证明，体内IF聚合物的完整性取决于组成蛋白磷酸酶的活性，因为目前的结果表明，PP1和PP2A的抑制导致波形蛋白磷酸化的快速升高，随后波形蛋白IF被分解。从不溶性聚合物中释放的波形蛋白可分为两个蛋白质池，一个由在高离心力下可造粒的碎片细丝组成，另一个由不可造粒真正可溶的亚基组成。从我们的结果来看，磷酸化升高首先诱导聚合物的净碎裂，当磷酸化更显著升高时，则诱导可溶性亚单位的净释放。具体³²两个颗粒蛋白组分的P标记大致处于相同水平，但可溶性池的比标记比纤维组分高1.7倍。这表明，分解是由磷酸化的净增加驱动的，对可溶性亚基具有一定的选择性。相反，这可能表明在正常情况下（在没有PP抑制剂的情况下），波形蛋白导向的PP表现出对可溶性亚单位的偏好，这可以解释为什么它们的存在如此稀少。可溶性组分和颗粒组分之间的磷酸盐相对分布与角蛋白8和18的相对分布在一定程度上不同。虽然波形蛋白包含在所有组分中（对可溶性亚单位有一定偏好），但角蛋白8/18主要包含在可溶性亚单位中(Liao和Omary，1996年;Toivola等人，1997年).

人们对分解的波形蛋白亚基的大小感兴趣，因为了解其组成有助于阐明聚合物和可溶性蛋白质库之间的交换是如何发生的。我们的结果表明，磷酸化在体外和体内释放相同的寡聚肽组成；四聚体低聚物在体外通过PKA磷酸化和在体内通过抑制去磷酸化而释放。先前的体外研究表明，IF亚基通常以四聚体形式存在(唐宁，1996;Foisner等人，1991年;Ip等人，1985年;Meng等人，1996年). 与体外结果一致，有人认为IF蛋白在体内的微溶部分在性质上可能是四聚体(Soellner等人，1985年). 然而，从未有人证明磷酸化会推动分解为四聚体形式。我们目前的结果表明，磷酸化诱导分解为四聚亚基，这可能意味着IF聚合物和可溶性亚基之间磷酸化驱动的亚基交换将以四聚体的形式发生。

体内标记的波形蛋白的磷酸肽图谱显示，有大量的磷酸化位点发生活性转换。由于大多数在cl-A存在下显示磷酸化升高的磷酸肽也可以从对照细胞的图谱上识别出来，我们假设磷酸化升高是磷酸转换的真实反映，并且不是由磷酸酶抑制剂诱导的激酶激活引起的。换句话说，尽管这些位点具有非常低的稳态磷化学计量比，但它们仍在被积极磷酸化，但随后也立即去磷酸化。

体内磷酸肽图谱针对许多假定的IF激酶进行了测试，其中只有PKA和PKC生成的磷酸肽与体内生成的磷酸肽类显示出明显的匹配³²从间期细胞分离的P标记波形蛋白。令人惊讶的是，CaM激酶II并没有显示出与间期磷酸肽有任何明显的匹配。在以前的研究中，CaM激酶已被证明在体外和体内都能磷酸化波形蛋白(Ogawara等人，1995年;Yano等人，1994年;Yano等人，1991年). 由于在本研究中无法观察到生成的CaM激酶特异性位点，这些位点似乎不属于显示活跃转换的位点，而是仅限于特定生理条件和/或特定细胞类型下的特定功能。

Ser-38和Ser-72是体内重要的磷酸化靶点，如前所述，这些位点在体外被PKA磷酸化。有趣的是，这些位点也被报道为RhoA-结合激酶α的靶点(Goto等人，1998年;Sin等人，1998年). 除了这些N末端位点外，在远N末端还有一簇磷酸化丝氨酸，显示出复杂的磷酸化模式。在这个Ser-cluster上，体内存在大量不同的可能磷酸-氨基酸组合。而以前的研究表明，PKC可以在体外磷酸化Ser-6、Ser-8和Ser-9(Inagaki等人，1997年)、Ser-4和Ser-7尚未被报道为磷酸化靶点。除了这些位点外，我们的研究还发现一些C末端位点被磷酸化。在所有这些位点中，Thr-457和Ser-458被报道为体内特定的有丝分裂位点，被p37波形蛋白激酶磷酸化(Chou等人，1996年). 根据我们目前的结果，在有丝分裂期间，这些位点似乎没有完全磷酸化，但至少在一定程度上，也在间期。观察到的Ser-418和Ser-436从未被报道为磷酸化位点。磷酸化这些位点的激酶的身份尚不清楚，也没有推测的激酶，因为围绕这些位点的序列与任何明显的激酶共有位点都不相似。奇怪的是，先前报道的PKC体内位点Ser-33和Ser-50在本次分析中根本没有出现(Takai等人，1996年)这可能是由于不同细胞系上的细胞特异性磷酸盐周转特性所致。

Ser-38和Ser-72的突变使体外PKA介导的波形蛋白磷酸化总水平降低了50-60%。突变并未导致含有这些位点的胰蛋白酶磷酸肽的磷酸化完全丧失，这表明除了这些肽上的两个理想的PKA共有位点（Ser-38:RXXS和Ser-72:RXS）外，这两个胰蛋白酶肽上其他不太典型的位点也被PKA磷酸化。

Ser-38和Ser-72突变对PKA介导的波形蛋白分解有显著影响。虽然野生型波形蛋白的大部分（占总量的70-80%）在体外用PKA磷酸化后被分解成可溶性四聚体形式，但只有一小部分（占总量15-20%）是由相同的S38:a/S72:a波形蛋白处理产生的。这一结果与先前的研究一致，研究表明PKA磷酸化可增加IF蛋白的溶解度(Inagaki等人，1988年;Inagaki等人，1990年;Yano等人，1991年)，但也证实了在所有PKA位点中，这两个位点对确定波形蛋白的组装状态尤其重要。Lamb等人首次对PKA介导的波形蛋白结构磷酸化进行了体内研究(Lamb等人，1989年)对波形蛋白的组织有显著影响。我们目前的结果证实了这些和后来的结果，表明PKA靶向的磷酸化位点Ser-38和Ser-72在维持和调节波形蛋白结构方面具有重要意义。

微注射的细菌表达的波形蛋白同时在细胞质的几个地方结合，在微注射后的30分钟内形成完整的波形蛋白网络。这种纤维形成模式与之前描述的转染鸡波形蛋白在BALB/c 3T3成纤维细胞中的从头表达模式非常相似(Ngai等人，1990年)但与之前报道的牛晶状体波形蛋白的细丝形成模式不同。后者以一种非常独特的模式从核区域向外合并，大约需要4小时才能形成一个完整的IF网络(Vikstrom等人，1989年;Vikstrom等人，1991年). 微注射这两种不同类型的波形蛋白后，纤维形成模式的差异可能是因为这些蛋白质在翻译后修饰状态上可能存在显著差异。细菌表达人类波形蛋白cDNA会产生完全未修饰的“处女”蛋白。相反，由于其来源组织的性质，预计牛晶状体波形蛋白将被高度翻译后修饰(Vikstrom等人，1991年). 因此，在体内成功形成纤丝之前，可能必须以某种方式改变这种蛋白质。我们的结果支持翻译后修饰的波形蛋白掺入延迟的假设，因为在波形蛋白微注射到BHK-21细胞之前，波形蛋白与PKA的磷酸化可以诱导纤维形成的显著延迟。如果体内的丝状体完整性是通过激酶和磷酸酶活性的平衡来维持的(埃里克森等人，1992年;Toivola等人，1997年)因此，在注射后，波形蛋白的磷酸化程度更高的可溶性上清液部分需要更长的时间才能形成纤丝，因为可能需要磷酸酶作用才能实现组装能力。然而，缺乏两个主要的磷酸化位点，即Ser-38和Ser-72，对纤维组装没有重大影响，这表明在调节组装平衡时，磷酸化的作用主要是驱动分解。

我们的研究确定了一些体内磷酸化位点是积极调控的。我们的结果表明，这些位点上整个波形蛋白池的整体磷酸化增加了脱落率，从而推动了聚合物的分解。然而，去磷酸化增加了接通速率，从而驱动聚合物的组装。观察到的体内磷酸化的复杂性是惊人的，涉及大量位点，甚至相邻位点上磷酸化丝氨酸与非磷酸化丝网的大量组合。这种复杂的磷酸化模式和单个位点的磷酸化可能反映了一个事实，即特定位点可能具有相当特定的作用。在这些实验条件下，一些位点表现出优先磷酸化，但根据细胞的状态，各个位点的相对重要性可能会发生显著变化。间期相对磷酸盐掺入量与有丝分裂位点相比存在显著差异，这一假设得到了很好的支持。

为什么需要如此积极的磷酸盐周转和动态调节？在某种程度上，答案是显而易见的：尽管国际单项体育联合会看起来有明确的形状和结构，但在活细胞中，它们不断地被重组(Prahlad等人，1998年;Yoon等人，1998年). 重组复杂的蛋白质网络需要亚基的主动交换，以便及时进行重组。由于IF聚合物的性质与肌动蛋白和微管蛋白聚合物的性质显著不同，不允许与这些蛋白质聚合物中观察到的动力学类型相同，因此需要涉及翻译后修饰的机制。主动重塑和亚单位交换的目的可能不仅仅是为了重组IF网络。特别是关于Ser-38和Ser-72的磷酸转换，一项有趣的研究提出了一种可能性，即RhoA-结合激酶α对波形蛋白的磷酸化可能参与调节激酶的靶向性和隔离性(Sin等人，1998年). 活性激酶主要与波形蛋白干扰素有关。当游离RhoA-结合激酶α的小池被激活时，它磷酸化波形蛋白上的Ser-38和Ser-72，从而导致非活性激酶池的释放、激活和重新定位(Sin等人，1998年). 此外，p21活化激酶也被证明与Ser-38和Ser-72相互作用(Goto等人，2002年).

作为许多其他激酶，包括各种PKC亚型、cdc2、cdk5和环GMP依赖性蛋白激酶(麦克米兰·克罗和林肯，1994年;Spudich等人，1992年;Wyatt等人，1991年)已发现与波形蛋白和其他IF相关(Dosemeci and Pant，1992年;霍兰德和贝内特，1992年;Omary等人，1992年;Starr等人，1996年;肖和蒙泰罗，1994年)很容易推测，波形蛋白不同部位的磷酸化位点可能参与类似类型的隔离或支架过程，正如上文所述的RhoA-结合激酶α。例如，波形蛋白N末端的众多假定PKC位点是否参与这种自动调节隔离和靶向功能尚待解决。

我们感谢霍华德·舒尔曼（斯坦福大学医学院）提供重组CaMKII。我们感谢海伦娜·萨伦托提供的出色技术援助。这项工作得到了芬兰科学院和阿博·阿卡德米基金会研究所的支持。T.H.得到了图尔库生物医学研究生院的支持。