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研究文章

宿主细胞材料向沙眼衣原体化学固定过程中的包裹体流明

摘要

沙眼衣原体操纵宿主细胞途径以确保其增殖和存活。宿主物质转移到致病性液泡（称为“包涵体”）可能有助于营养物质的获取，包涵体内观察到各种细胞器，包括脂滴、过氧化物酶体、多泡体成分和内质网膜。然而，在活细胞中，这些过程很少被记录下来。在这里，我们调查了大量亚细胞元素的定位，发现ER、线粒体和包涵膜位于固定细胞的包涵腔内。然而，我们很少看到活内含物中这些细胞器在腔内定位的证据。使用延时视频显微镜，我们记录了化学固定过程中ER标记移位到包涵体腔的情况。这些包埋内ER元件可抵抗各种固定后操作，并可通过免疫荧光显微镜进行检测。我们推测，细胞器子集的定位可能在固定过程中被夸大。最后，我们在致病性液泡中发现了类似的结构立克次体感染细胞，表明固定诱导的细胞物质移位可能发生在一系列细胞内病原体的液泡中。

引用：Kokes M，Valdivia RH（2015）《宿主细胞材料的差异性移位》沙眼衣原体化学固定过程中的包裹体流明。公共科学图书馆综合10（10）：e0319153。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139153

编辑：加州大学旧金山分校、加州大学伯克利分校和美国儿童医院奥克兰研究院院长黛博拉

收到：2015年1月16日；认可的：2015年9月8日；出版：2015年10月1日

版权：©2015科尔斯，瓦尔迪维亚。这是一篇根据知识共享署名许可协议它允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源得到认可

数据可用性：所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。

基金：这项工作得到了美国国立卫生研究院的支持(网址：http://www.nih.gov/)向RHV和美国心脏协会授予AI081694(http://www.heart.org/HEARTORG（心脏网）/)向MK授予11PRE7360030。RHV是Burroughs Wellcome传染病发病机制学者。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

介绍

沙眼衣原体是一种具有全球意义的人类病原体，是最常见的性传播细菌病原体，也是全球可预防失明的主要原因[1]. 在哺乳动物细胞感染期间，细菌仍被隔离在一个被称为包涵体的膜结合隔间内。内含物是细胞内生活方式的基础C.沙眼因为它是抵抗免疫监视和抗菌效应物的第一道防线[2]. 此外，作为一种专性细胞内病原体，C.沙眼衣原体需要从受感染的宿主细胞中获得重要营养素（参见[3])内含物和宿主细胞成分之间的相互作用在这一过程中起着重要作用（在[4]).

许多亚细胞器位于内含物附近，其中一些已被报道与内含物密切相互作用（综述于[4]). 在一个特征明确的例子中，内质网（ER）小管与C.沙眼衣原体包涵膜[5,6]形成膜接触位点，促进脂质直接在内质网和致病性液泡之间转移[7,8]. 高尔基器械碎裂成小包装[9]以肌动蛋白和细菌效应依赖的方式[10]它们紧紧围绕着包裹体[11,12]. 脂滴聚集到包涵体外围[13]并能移位到包涵体腔[14]而溶酶体紧密包围包裹体，可能是为了增强细菌从降解蛋白质中获取氨基酸的能力[15]. 多泡体（MVB）在包涵体外围富集，抑制MVB的生物生成可以破坏C.沙眼衣原体脂质摄取[16,17]. 再循环内体与包涵体密切相关[18–20]但被认为在融合抑制状态下与内含物相互作用[19,21]. 线粒体定位于某些衣原体物种[6,22]线粒体蛋白输入对C.鱼子酱[23].

在一些情况下，与包涵体的相互作用超出了对周围细胞的补充，整个细胞器移位到包涵体腔。简单地说，鞘磷脂的蛋白质标记物[11]、胆固醇[24]、脂滴[14]和ER[25]已报道包含活细胞。ER的组件[25,26]，MVB[16]和过氧化物酶体[27]，以及Rab14[28]、apoA-1和磷脂酰胆碱[29]以及与酰基辅酶A相互作用的蛋白质，包括ASCL3、ACBD6和ZNF23[30]. 此外，一些亚细胞成分和标记物，如MVB[31]或磷脂酰胆碱[12]仅在固定细胞内的内含物中观察到。

在这项研究中，我们试图通过系统地测量感染细胞内定位的细胞器标记来表征细胞器与内含物的相互作用。我们在包涵体中发现了许多包涵体-最大亚细胞元素的子集，包括内质网成分、线粒体和包涵体膜标记物。我们记录了在化学固定过程中ER标记显著移位到包涵体管腔。这些内化结构在间接免疫荧光样品处理过程中持续存在，表明固定过程可能会夸大细胞器子集对内含物的定位，而不是在操作前准确反映细胞器定位。最后，我们观察到贝氏柯克斯体-感染细胞，表明在研究大液泡内的细胞内病原体时，固定诱导的亚细胞元素移位可能是一种更普遍的现象。

结果

一组内含物-位于内含物内腔的近端亚细胞器官

我们通过在感染30小时的细胞中表达各种亚细胞器的荧光蛋白标记标记，来研究宿主细胞器和中晚期周期内含物之间的相互作用(图1A). 我们固定细胞，并用荧光材料量化包涵体腔中细胞的频率(图1B). 为了提高我们在不受每个焦点平面上方和下方光线干扰的情况下准确定义三维夹杂物边缘的能力，我们使用了共焦显微镜，而不是宽视野显微镜。此外，由于与细胞结构相比，大多数标记物在内含物内的强度低得多，因此我们使用旋转圆盘而不是激光扫描共焦显微镜来减少光漂白，同时对细胞进行三维成像。

缩略图
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图1。线粒体、ER和包涵膜位于C.沙眼衣原体夹杂物。

HeLa细胞被C.沙眼衣原体LGV L2，转染指示质粒，固定在30 hpi进行连续旋转圆盘激光共焦分析。注意内质网、线粒体基质和外膜以及包涵体管腔内包涵体膜的标记（A，青箭头）。图像描绘了夹杂物中心的单个z截面，夹杂物被视觉识别为大的黑色中心椭圆或用虚线勾勒。细胞定位标记出现饱和，因为内含物内的物质通常明显较暗。（B） 评估每个内含物的整个3D空间内内化结构的频率。质粒分为内质网、线粒体、包涵体、胞浆、再循环内体或其他标记物。在另一类中，GFP-GalT定位于高尔基体，CD63-GFP定位于MVB，LAMP1-GFP定位于溶酶体，KPhi-mRFP定位于质膜。50%处的虚线区分包裹体内腔内结构的高频和低频。每个实验中评估了12–20个夹杂物，显示了三个独立实验的平均值±SEM。比例尺代表5μm。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139153.g001

在所有测试的细胞间室中，我们发现了内质网腔和膜、线粒体基质和外膜的标记[32]和蛋白质，这些蛋白质除了不同地定位于一系列亚细胞隔室外，还与包涵体有关（FAPP1-PH-GFP是磷脂酰肌醇4-磷酸盐的标记物[33]在包裹体上富集[34]) [35,36]在相当大比例（超过50%）的夹杂物内(图1B)表现为气泡状结构(图1A，箭头）。值得注意的是，我们发现了细胞质和其他包含-最大亚细胞器的标记，包括再循环内体、MVB、高尔基体和溶酶体[9,12,16,18,21,31]也只有大约四分之一的包涵体内有气泡状结构，但没有观察到远端质膜的标记[37]夹杂物内。这些发现揭示了在固定细胞内含物中发现内含物-最大亚细胞元素的选择性。

内质网成分表现为固定而非活细胞内含物中的大结构

在包涵体管腔内最明显可见的蛋白质标记物，如ER-RFP和Sec61β-GFP，通常在固定细胞包涵体内腔的大部分三维空间内形成一个由大气泡和小管组成的扩张网络(图2A和2B，顶部面板，S1（第一阶段）,第3章，以及S4系列电影）。然而，在我们的实验设计和分析的细胞数量范围内，我们无法检测到活感染细胞中的这些结构(图2A和2B，底部面板，S2系列,第5章和S6系列电影）。

缩略图
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图2。ER标记显示固定而非活细胞包涵体管腔内的扩张结构。

HeLa细胞被感染C.沙眼衣原体与ER-RFP（红色）和Sec61β-GFP（绿色）联合转染的LGV L2在30 hpi时被固定或在活着时进行三维成像。用激光扫描共聚焦显微镜获取图像。（A） 一张朝向细胞中心的单一xy显微照片。请参见S1（第一阶段）和S2系列沿z轴的xy显微照片的进展影片。（B） 图像用于在3D中渲染体积。固定单元格的3D渲染在z轴上受到限制，以允许在包含范围内进行查看。请参见第3章–S6系列QuickTime虚拟现实文件的电影，用于旋转和查看这些3D卷。注意，在固定细胞的包涵体管腔内存在膨胀的材料网络。N表示原子核。比例尺代表5μm。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139153.g002

化学固定诱导内质网内化到包涵体内质网

由于活细胞和固定细胞的内质网定位模式不同，我们认为固定过程可能会夸大细胞器向包涵体腔的移位程度。为了验证这一点，我们使用激光扫描共聚焦显微镜对活感染细胞进行扫描，以监测多聚甲醛固定过程中ER-RFP定位的变化(图3和S7电影). 在加入固定剂后的几分钟内，我们观察到ER-RFP材料形成的气泡扩展到包涵腔。这些气泡出现在包涵体周围的随机位置，并随着时间的推移扩大为新的向内气泡位置(图3，箭头）出现。许多气泡仍然附着在夹杂物边缘，但有些气泡似乎脱离到夹杂物的中心。到了10分钟，大多数新的内质网起泡和扩张都已停止，现有结构的荧光强度发生了变化。我们还注意到在细胞的其他区域，主要是在细胞边缘，形成了一些较小且不太明显的ER-RFP泡状聚集体。这些发现表明，化学固定可以诱导内质网物质戏剧性地移位到包涵体腔。

缩略图
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图3。ER-RFP在化学固定过程中移位到包涵体腔。

HeLa细胞被感染C.沙眼衣原体LGV L2并转染ER-RFP。在30 hpi时，将活细胞置于4%多聚甲醛中，并用激光扫描共聚焦显微镜随时间成像。注意在固定过程中ER-RFP气泡进入内含物管腔的成因（青色箭头）。请参见S7电影对于在更大视野中包含更多单元格的延时视频。N表示原子核。比例尺代表10μm。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139153.g003

化学固定影响包裹体中观察到的细胞器的程度

评估细胞器内化过程是否会在先前研究宿主细胞材料的各种固定技术中发生衣原体夹杂物[12,14,16,28,29]，我们量化了固定感染细胞后内含物中ER-RFP结构的频率(图4A). 用由多聚甲醛或液体福尔马林（含有少量甲醇）制备的不同浓度的甲醛进行固定，导致具有内部ER-RFP结构的夹杂物的频率同样高，表明福尔马林中甲醛浓度和微量甲醇不会影响内化频率。因为用于电子显微镜的戊二醛固定会在可见光谱中产生高水平的自荧光[38]，在这些条件下，我们无法可靠区分任何荧光标记或被测染料与背景荧光（数据未显示）。此外，我们无法评估甲醇固定后包裹体中ER-RFP结构的频率，因为mRFP荧光被该处理猝灭。

缩略图
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图4。在甲醛和醇基化学固定后，通过免疫荧光显微镜检测包涵体内的ER结构。

HeLa细胞被感染C.沙眼衣原体LGV L2。（A） 用ER-RFP转染感染细胞，用不同浓度的多聚甲醛（PFA）或甲醛（Form）固定在30 hpi，并评估内含物内ER-RFP的频率。（B和C）感染细胞转染ER-RFP，如图所示。在30 hpi时，用PFA、甲醇或乙醇固定细胞，然后用Triton X-100（Tx100）渗透，如图所示。用ER蛋白PDI抗体对处理后的细胞进行免疫荧光处理，并评估内含物内PDI阳性结构的频率。比例尺表示5μm。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139153.g004

为了比较变性固定剂（如醇类）和交联固定剂（例如醛类）的效果，我们通过免疫荧光显微镜在不同条件下监测内质网内化到包涵体中。由于酒精固定同时固定和渗透膜，我们首先评估ER-RFP包合物内结构抵抗洗涤剂渗透的能力。使用先前在包裹体内宿主细胞材料研究中使用的一系列条件[12,14,16]，我们发现ER-RFP结构持续存在，每次包含的数量减少(图4C)通常只有一半的包裹体(图4B和S1图). 接下来，我们对固定了副甲醛的和经洗涤剂渗透的细胞进行了免疫荧光检测，并使用ER-resident蛋白PDI抗体将其与甲醇或乙醇固定/渗透的细胞相比较(图4B和4C). 值得注意的是，我们在四分之一到一半包裹体的所有条件下都观察到了PDI-阳性结构。这些发现表明，甲醛和基于酒精的化学固定都会导致内源性内质网物质移位到包涵体腔中。

内质网物质嵌入另一种细胞内病原体的液泡

这个衣原体包涵体是一种异常宽敞的细胞器，与宿主细胞质相比，与透射电子显微镜观察到的细胞器相比，管腔空间基本上没有电子致密物质[39]. 我们推测，这种宽敞的性质可能有助于固定诱导的物质移位，而这些物质在细胞的其他地方可能不会发生。为了评估这一点，我们询问另一个同样宽敞的致病性液泡是否被贝氏柯克斯体（在中审查[40])会表现出类似的内在结构。当我们转染伯内特科谢拉-感染ER-RFP的细胞，在感染52小时后固定，我们在致病性液泡腔内发现ER-RFP-结构，其外观和频率（90%）与在衣原体夹杂物(图5).

缩略图
下载：
图5。致病液泡内的ER-RFP贝氏柯克斯体.

HeLa细胞被感染贝氏柯克斯体转染ER-RFP，固定于52 hpi。注意，致病性液泡（青色箭头）内腔中存在ER-RFP结构，类似于沙眼衣原体夹杂物。N表示细胞核，虚线表示放大倍数较高的区域。比例尺代表5μm。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139153.g005

讨论

在这项研究中，我们报告了在固定的内腔中容易观察到ER、线粒体和包涵膜的荧光标记标记沙眼衣原体夹杂物。然而，这可能不是对体内我们确定的化学固定过程可以诱导内质网成分移位到包涵体中。这些内化结构抵抗许多常见的免疫染色程序，并通过免疫荧光显微镜进行检测，表明在固定细胞内含物中检测到的特定细胞材料可能会高估活细胞的真实定位。

我们的研究结果表明，固定诱导的内化进入包涵体腔在靠近包涵体的亚细胞成分中具有选择性。我们经常在固定细胞的包涵体管腔内发现包涵体膜、ER管腔、ER膜、线粒体基质和线粒体外膜的标记，这些细胞都与包涵体密切相关。然而，包括高尔基体、再循环内体、溶酶体和细胞质在内的其他包含-最多亚细胞元素的标记物却没有。同样，我们也没有观察到包涵体中远端质膜更多的标记。由于脂质直接在内质网和包涵体之间转移，位于两者之间的膜接触部位[7,8]我们推测，注视诱导的内化可能具体发生在直接物质转移的包含-组织相互作用区域。事实上，在固定过程中，我们很少观察到ER标记物跨细胞质膜向外移位的现象，ER和质膜之间的膜接触位点也有报道（综述于[41]). 一些细胞器被建议直接转移到包涵体中，包括脂滴[14]和过氧化物酶体[27]在活细胞中证实了脂滴（14）和ER（25）的易位。一般来说，固定诱导的移位反应如何尚不清楚真诚地与包涵体的相互作用，尽管固定可能会增加真诚地易位或相互作用事件。

甲醇和乙醇破坏使蛋白质变性的疏水性和氢键，由于使用方便，有时用于固定免疫荧光显微镜的样品，但会收缩和扭曲组织和细胞[42]. 甲醛与生物分子的各种反应基团（包括蛋白质、DNA和糖）反应并交联。它通常用于保存细胞结构和细胞和组织中蛋白质的空间关系（在[42,43]). 然而，在某些情况下，化学或醛固定改变而不是保留细胞结构。一个突出的例子是中间体，它被认为是细菌中一个独立的细胞器，直到被证明是化学固定的产物[44]细胞膜内陷过多[45]. 在哺乳动物细胞中，固定诱导的膜起泡也具有优先性。将细胞单层暴露在低浓度的多聚甲醛中会导致质膜上的小泡释放[46]. 这些小泡的大小从0.5μm到15μm不等，出现在细胞边缘，与我们在固定过程中观察到的ER-RFP罕见起泡类似。标准多聚甲醛浓度下固定细胞向外形成大膜泡的动力学[42]与我们观察到的包涵体管腔内形成的结构相似，可能具有相同的发生机制。

通过透射电子显微镜，包涵体腔看起来宽敞，细菌之间的距离很大，尤其是在中心，除糖原外，包涵体腔大部分没有电子致密物质[22,39]尤其是与宿主细胞胞浆相比。与细胞外环境一样，这种相对空旷的管腔空间特别有利于甲醛诱导的水泡的形成。与此模型相一致，我们还观察到ER-RFP结构位于贝氏柯克斯体在52 hpi时，电子显微镜观察到这个液泡同样宽敞（参见[40]).

我们的研究结果表明，化学固定过程可导致两种细胞内病原体的亚细胞成分在病原体液泡腔中积聚沙眼衣原体和贝氏柯克斯体固定细胞和活细胞内含物腔中发现ER膜的相对效率之间的差异表明，在解释固定细胞中观察到的事件时应谨慎。随着成像技术超越光的衍射极限并以超分辨率捕获图像，化学固定细胞和活细胞之间蛋白质定位和聚集的亚微米级差异越来越明显[47]. 替代固定技术可以更好地保存结构，这种冷冻固定也应该减少亚细胞畸变[48]已用于确认夹杂物中是否存在ER碎片[25]. 固定不太可能完美地保存细胞的内部结构，因此，在评估任何观察到的相互作用的重要性时，观察活的、完整的细胞中的亚细胞成分应该是金标准。理想情况下，通过综合多种技术评估内含物和宿主细胞器之间的相互作用，可以更准确地描述未受干扰时发生的情况C.沙眼衣原体-受感染的细胞会出现。

材料和方法

细胞培养，衣原体感染、转染、抗体和质粒

HeLa细胞（ATCC CCL-2）在37°C、5%CO的高糖DMEM中生长，DMEM补充有L-谷氨酰胺、丙酮酸钠（Gibco，Life Technologies）和10%FBS（Mediatech，CellGro）2加湿培养箱。C.沙眼衣原体LGV生物型L2 434/Bu[13]在Vero细胞（ATCC CCL-81）中繁殖，并如前所述进行纯化[49]. 通过感染接种在96孔板中的Vero细胞单层来测定EB滴度。在24 hpi时，细胞被固定并用抗MOMP抗体染色。使用Cellomics ArrayScan自动荧光成像系统（Thermo Scientific）对包涵体形成单位（IFU）进行计数。细胞在1的MOI下感染，通过离心（2500 x g，在10°C下30分钟）同步到HeLa细胞单层上，并培养30小时。如图所示，在感染时，根据制造商的指示，用jetPRIME（Polyplus转染）转染细胞，4小时后用新鲜培养基交换。抗体和质粒来源：兔抗-衣原体MOMP（肯塔基大学Kenneth Fields）、小鼠抗PDI（Abcam ab2792）ER-RFP和DsRed-Mito（NIH Richard Youle）、Sec61β-GFP（Addgene 15108，哈佛医学院Tom Rapoport）、GFP-GalT（Addgene11929）、Matrix-YFP、YFP-Mito立方厘米5TM和YFP Prohibitin（Jennifer Lippincott Schwartz，Eunice Kennedy Shriver NICHD）、GFP-Rab1（Craig Roy，Yale）、GFP-RhoA、CD63-GFP和LAMP1-GFP（Soman Abraham，Duke University）、Chy-Arf1（Q71L）和mRFP（Micheal Ehlers，Pfizer Neuroscience，前身为杜克大学）、FAPP1-PH-GFP（Tamas Balla，Eunice Kennedy Shriver NICHD），tdTomato（Marc Caron，杜克大学）、KRphi-mRFP（Addgene 17276，Sergio Grinstein，多伦多大学）、GFP（pcDNA3.1-CT，Invitrogen，Life Technologies）、Syntaxin13-GFP（William Trimble，多伦多大学）。

固定包涵体亚细胞器官成像和腔内结构定量

生长在玻璃盖玻片上50%汇合处的HeLa细胞被感染C.沙眼衣原体LGV L2并转染(图1)质粒。在30 hpi时，细胞在pH 7.4的PBS中用4%多聚甲醛（PFA）固定20分钟，RT时用1μg/mL Hoescht 33258（Life Technologies）在PBS中培养20分钟，安装在5μl SlowFade Gold（Life Technologies）载玻片上，并用指甲油密封。使用配备倒置显微镜（蔡司、Axio-Observer，使用100x1.4 NA油物镜）和横河旋转圆盘共焦装置（CSU-22型）的马里亚纳系统（智能成像创新）采集图像。所有硬件都由SlideBook 4.2版（智能成像创新）控制。Z截面从每个单元的上方到下方进行采集，Z截面之间的最佳间距符合奈奎斯特分辨率标准。为了评估包涵体内荧光泡的频率，使用幻灯片4.2或5.5版（智能成像创新）查看每个包涵体的z堆叠图像中每个z截面（每个细胞约30个）的DNA染色信号（定义包涵体和细胞核）和荧光蛋白信号。在每个独立的实验中，对每个标记的至少12个内含物进行评估。对三个独立实验的值进行平均并计算标准误差。使用Prism（GraphPad软件）准备计算和图形，并使用Photoshop CS6（Adobe）处理图像以进行显示。

活细胞和固定细胞腔内结构的比较

对于固定细胞，如上所述制备HeLa细胞。对于活细胞，生长在35 mm#1.5玻璃底培养皿（MatTek）上的HeLa细胞感染了50%的融合细胞C.沙眼衣原体LGV L2并与ER-RFP和Sec61β-GFP共转染。在30 hpi时，在37°C和5%CO的加湿室中，在补充有10%FBS和10μM HEPES（Gibco，Life Technologies2图像是在配备100x1.4NA油物镜的徕卡SP5激光扫描共聚焦倒置显微镜上拍摄的。在最佳间距处获得Z截面，以满足奈奎斯特分辨率标准。使用惠更斯基础（SVI）对图像进行去卷积，并使用ImageJ（NIH）进行处理以创建视频。AVI文件和Photoshop CS6（Adobe）用于演示。为了创建三维重建体，使用Volocity（PerkinElmer）对去卷积图像进行进一步处理，将z轴扩大三倍以降低平面度。将采集到的每个活细胞和固定细胞通道的3D体积导出为QuickTime（Apple Inc.）虚拟现实格式以供查看(第3章–S6系列电影）。

化学固定过程中ER-RFP移位的时程成像

HeLa细胞生长在35 mm#1.5玻璃底培养皿（MatTek）上，50%融合后感染C.沙眼衣原体LGV L2并与ER-RFP和Sec61β-GFP共转染。在30 hpi的条件下，在37°C和5%CO的湿化室中，将细胞浸泡在补充有10%FBS和10μM HEPES的无酚红DMEM-HG（Gibco，Life Technologies）培养基中2将PBS中8%的多聚甲醛添加到最终浓度4%。图像是在配备63x1.2NA水物镜的徕卡SP5激光扫描共焦倒置显微镜上拍摄的。每3.4秒采集一次图像，并根据需要手动调整z位置，以抵消由于热变化引起的焦点漂移。用ImageJ（NIH）和Photoshop CS6（Adobe）对图像进行编辑以进行显示。

不同固定和通透性条件下包涵体ER-RFP腔内结构的定量

生长在玻璃盖玻片上50%汇合处的HeLa细胞被感染C.沙眼衣原体LGV L2并转染ER-RFP，如图所示。在30 hpi时，细胞以三种主要方式之一进行处理。

固定剂。

在室温下用4%、3%、1%PFA、3%或1%甲醛在pH 7.4的PBS（后者由含有微量甲醇的福尔马林原料制备）中固定细胞20分钟，或预冷100%甲醇或乙醇20分钟，安装在5μl SlowFade Gold（Life Technologies）载玻片上，并用指甲油密封。

渗透方法。

如图所示，细胞首先在RT下用4%PFA固定20分钟，然后仅用PBS（未处理）或预冷0.2%培养(图4B和4C)、0.1%Tx-100、0.2%皂苷冰敷10分钟，甲醇和乙醇的1:1混合液冰敷5分钟，或2 mg/mL、1 mg/mL或0.5 mg/mL Zwittergent 3–12（所有清洁剂均在PBS中）冰敷1分钟，装在5μl SlowFade Gold（Life Technologies）中的载玻片上，并用指甲油密封。

样品采用双盲法，在Axioskop 2（蔡司）倒置宽视野荧光显微镜或Axio Observer Z1（蔡斯）上观察(图4B和4C)使用63X 1.4 NA油物镜（蔡司），每次实验在50–100个细胞中定量含有ER-RFP管腔内结构的内含物的频率。对三个独立实验的值进行平均并计算标准误差。通过单因素方差分析和Dunnett多重比较评估统计学上的显著差异临时的将每种情况与未经治疗的情况进行比较分析，p值<0.05被认为是显著的。使用Prism（GraphPad软件）和Photoshop CS6（Adobe）编制统计数据和图表。

固定范围内ER-RFP结构的成像和定量贝氏柯克斯体致病性液泡

生长在玻璃盖玻片上50%汇合处的HeLa细胞被感染贝氏柯克斯体九英里RSA439（第二阶段，克隆4）并通过离心进行同步（在10°C下3000 rpm，30分钟）。在24 hpi时，用ER-RFP转染细胞。在52 hpi时，细胞在室温下用4%多聚甲醛（PFA）在PBS中固定20分钟，在室温下与1μg/mL Hoescht 33258（Life Technologies）在PBS中培养20分钟，安装在5μl SlowFade Gold（Life Technologies）载玻片上，并用指甲油密封。在配备100x1.4 NA油物镜的徕卡SP5激光扫描共聚焦倒置显微镜上拍摄图像，并评估50多个感染细胞在致病性液泡内ER-RFP结构的频率。使用Photoshop CS6（Adobe）对图像进行最低限度的处理以进行演示。

支持信息

S1图。通过许多固定后操作，内含物内固定诱导的腔内ER-RFP结构持续存在。

HeLa细胞被感染C.沙眼衣原体LGV L2并用ER-RFP转染30小时，用4%多聚甲醛固定，用指示的渗透溶液处理，并评估内含物内ER-RFP的频率。治疗包括非离子洗涤剂Triton X-100（Tx-100）、皂苷、两亲性葡萄糖苷、甲醇和乙醇的1:1混合物或Zwittergent 3–12，一种用于不同时间的偶极离子洗涤剂。每个实验中列举了50–100个夹杂物，显示了三个独立实验的平均值±SEM。*通过单因素方差分析和Dunnett多重比较表明P<0.05临时的将每个条件（灰色条）与对照（黑色条）进行比较的分析。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139153.s001

（畅通节能法）

S1电影。通过固定C.沙眼衣原体感染细胞在30 hpi时表达ER-RFP和Sec61β-GFP。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139153.s002

（AVI）

S2电影。生活中的Z形截面C.沙眼衣原体感染细胞在30 hpi时表达ER-RFP和Sec61β-GFP。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139153.s003

（AVI）

S3电影。感染固定细胞内ER-RFP三维体积的QuickTime虚拟现实文件C.沙眼30小时。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139153.s004

（移动电话）

S4电影。感染Sec61β-GFP的固定细胞内3D体积QuickTime虚拟现实文件C.沙眼衣原体或30小时。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139153.s005

（移动电话）

S5电影。感染活细胞内ER-RFP三维体积的QuickTime虚拟现实文件C.沙眼衣原体30小时。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139153.s006

（移动电话）

S6电影。感染活细胞内Sec61β-GFP三维体积的QuickTime虚拟现实文件C.沙眼衣原体30小时。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139153.s007

（MOV）

S7电影。活的时间推移视频显微镜C.沙眼衣原体表达ER-RFP的感染细胞经过化学固定。

第一帧中的白色箭头表示C.沙眼衣原体夹杂物。时间在每帧中显示为分钟：秒。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139153.s008

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致谢

我们感谢杜克光学显微镜核心设施以及范恩·贝内特和罗伯特·莱夫科维茨实验室使用他们的显微镜。我们感谢Valdivia实验室的成员进行了宝贵的讨论。

作者贡献

构思并设计了实验：MK RHV。执行实验：MK。分析数据：MK RHV。贡献的试剂/材料/分析工具：MK RHV。撰写论文：MK RHV。

工具书类

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