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研究文章

极化上皮中KCa3.1的顺行转运是Rab1和Rab8依赖性的，与循环内皮无关

摘要

中间电导，Ca2+-激活的K+通道（KCa3.1）靶向极化上皮中的基底外侧（BL）膜，在跨上皮离子转运中起关键作用。然而，没有研究确定KCa3.1在极化上皮中的顺行和逆行运输。在此，我们利用B类奥丁L（左）igase酶A类接受者P（P）肽（BLAP）标记KCa3.1，利用MDCK、Caco-2和FRT细胞解决极化上皮细胞中的这些贩运步骤。我们证明，KCa3.1在过滤器支架上生长时，专门针对这些细胞中的BL膜。内吞作用后，通过抑制溶酶体/蛋白质体途径阻止KCa3.1降解。此外，KCa3.1的泛素化在BL膜的内吞作用后增加，而氘化酶抑制剂PR-619阻止降解，表明KCa3.1是泛素化降解的靶点。我们证明KCa3.1在极化LLC-PK中靶向BL膜1缺乏AP-1复合物μ1B亚单位的细胞，表明KCa3.1的BL靶向性与μ1B无关。由于Rabs 1、2、6和8在ER/Glgi退出和向BL膜转运蛋白质中发挥作用，我们评估了这些Rabs在转运KCa3.1中的作用。在显性阴性Rab1或Rab8存在的情况下，KCa3.1细胞表面表达显著降低，而Rabs 2和6没有影响。我们还与Rab1和Rab8共同免疫沉淀KCa3.1。这些结果表明，这些Rab是KCa3.1顺流贩运所必需的。最后，我们确定KCa3.1是直接转运到BL膜还是通过MDCK细胞中的内体再循环。在这些研究中，我们使用了再循环内体消融或显性阴性RME-1构建物，并确定KCa3.1直接运输到BL膜，而不是通过再循环内体。这些结果首次描述了KCa3.1在极化上皮细胞中的顺行和逆行运输。

引用：Bertuccio CA、Lee S-L、Wu G、Butterworth MB、Hamilton KL、Devor DC（2014）极化上皮中KCa3.1的顺行贩运是Rab1-和Rab8-依赖性的，并且再循环内皮细胞是独立的。公共科学图书馆·综合9（3）：e92013。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0092013

编辑：墨西哥Cinvestav-IPN，Agustin Guerrero-Hernandez

收到：2013年12月6日；认可的：2014年2月16日；出版：2014年3月14日

版权：©2014 Bertuccio等人。这是一篇根据知识共享署名许可协议它允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源得到了认可。

资金：这项工作得到了国家卫生研究所对DCD（HL092157）、GW（GM076167）和MBB（DK078917）的资助。KLH得到奥塔哥大学（UoO）研究拨款和生理学系的支持。SLL得到了UoO生理学系硕士奖学金的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

竞争利益：提交人声明不存在相互竞争的利益。

介绍

在各种上皮中，包括结肠、气道和唾液上皮，激动剂介导的钙激活2+-从属K+众所周知，通道（KCa）在跨上皮离子和水传输的调节中起着关键作用。因此，跨上皮Cl−分泌需要激活许多转运蛋白/通道，包括钠+/K（K）+-基底外侧（BL）膜上的ATP酶维持跨膜离子梯度。此外，BL膜Na的活化+-K（K）+-2毫升−协同传输允许Cl−以积累超过其电化学平衡。心尖膜Cl的活化−通道允许Cl−降低其平衡电位。最后，激活BL膜K+通道保持有利于连续氯离子的膜电位−流出通过顶膜，同时回收钾+被Na接手+-K（K）+-2毫升−共同运输者和Na+/K（K）+-ATP酶。我们以前用全细胞和全细胞来表征结肠上皮中的KCa[1]和单通道[2]方法，后来证实这是KCa3.1[3]在其分子克隆之后[4],[5]现已公认，KCa3.1是主要的BL K+维持钙的电化学驱动力的关键通道2+-介导Cl−这些上皮分泌[6],[7],[8],[9]考虑到KCa3.1在维持跨上皮离子和液体运输方面的关键作用，毫不奇怪，该通道被认为在各种疾病的病因中发挥作用。事实上，KCa3.1与克罗恩病有关[10]、溃疡性结肠炎[11]囊性纤维化与慢性阻塞性肺病[12],[13]和ADPKD囊肿形成[14].

显然，决定上皮细胞对钙增加的生理反应的关键成分2+是质膜上KCa3.1通道的数量。我们[15],[16],[17]和其他[18]已确定N端和C端以及跨膜结构域内的分子基序，这些基序在KCa3.1的组装和顺行运输中至关重要。使用B类伊奥汀L（左）igase酶A类接受者P（P）肽（BLAP）标记的KCa3.1在人类胚胎肾（HEK293）细胞和人类微血管内皮（HMEC-1）细胞中，我们证明KCa3.1从质膜内吞并通过运输所需的内胚体复合体（ESCRT）和Rab7依赖性途径靶向溶酶体[19]此外，我们证明KCa3.1最初在内吞后泛素化，然后在溶酶体降解前被USP8氘化[20]施瓦布及其同事[21]也证明了KCa3.1在MDCK细胞中内源性表达，并且在非极化迁移细胞中以网格蛋白依赖的方式内吞。

与上述研究相比，关于KCa3.1在极化上皮中顺行和逆行转运的信息很少。因此，本研究的目的是研究KCa3.1在极化上皮细胞中的转运。在此，我们证明KCa3.1仅在模型极化上皮细胞系MDCK、Caco-2、FRT和LLC-PK的BL膜上表达1表明这种定位与衔接蛋白μ1B无关。在极化细胞中，KCa3.1在BL膜上泛素化，并且在内吞作用后增加，之后通道被靶向用于原体和溶酶体降解。我们进一步证明，Rab1和Rab8对ER/Glgi退出和随后的KCa3.1质膜表达至关重要。最后，我们证明，在高尔基体退出后，KCa3.1不会通过RME-1或转铁蛋白受体（TfnR）阳性的再循环内体进入极化上皮细胞的质膜，这表明KCa3.1直接进入质膜。这些结果首次描述了KCa3.1在极化上皮细胞中顺行和逆行运输的特征。

材料和方法

分子生物学

我们的HA、myc和生物素连接酶受体肽（BLAP）标记的KCa3.1（也称为IK1或SK4）构建物，以及双顺反子质粒（pBudCE4.1)表达BLAP-KCa3.1和BirA-KDEL之前已经描述过[22],[23],[24]BLAP-KCa3.1也使用EcoRI和SalI限制性位点亚克隆到pAdlox（SwaI修饰）腺病毒穿梭质粒中。为了在转运到质膜之前使内质网内的KCa3.1生物素化，我们将BLAP-KCa3.1和BirA-KDEL（由马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院的Alice Ting博士慷慨提供）亚克隆到双顺反子腺病毒穿梭质粒DUALCCM-CMW-MCS2（Vector Biolabs；Philadelphia，PA）中。在这个结构中，两个cDNA都位于独特的CMV启动子后面。分别使用EcoRI/XhoI和NheI/SalI限制位点对BLAP-KCa3.1和BirA-KDEL进行顺序亚克隆。BLAP-KCa3.1和BirA-KDEL/BLAP-KCa3.1复制缺陷型腺病毒分别由匹兹堡大学矢量核心设施和矢量生物实验室产生。转铁蛋白受体（TfnR）腺病毒由Ora Weisz博士（宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学）慷慨提供。先前已经描述了Rabs 1、2、6和8的GFP和标记的变体的产生[25],[26],[27]Rab 10购自Addgene（马萨诸塞州剑桥）。Barth Grant博士（新泽西州新不伦瑞克罗格斯大学）慷慨提供了野生型（WT）和显性阴性（DN）GFP标记受体介导的内吞-1（RME-1）结构。

细胞培养

Madin-Darby犬肾（MDCK）和猪上皮（LLC-PK）1)细胞在α-MEM培养基中培养，人上皮性大肠腺癌（Caco-2）和人胚胎肾（HEK293）细胞在Dulbecco改良的Eagle's培养基（Invitrogen）中培养，Fischer大鼠甲状腺（FRT）上皮细胞在F12（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）中生长。所有培养基均添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素。野生型LLC-PK1细胞和LLC-PK1Michael Caplan博士（耶鲁大学，康涅狄格州纽黑文）慷慨提供了稳定表达AP1适配器复合体FLAG标记的μ1B亚单位的细胞系[28]MDCK、Caco-2、HEK293、LLC-PK1和FRT细胞系来自ATCC（弗吉尼亚州马纳萨斯）。所有细胞在5%的加湿CO中生长2/95%O237°C培养箱。通过转染pBudCE产生稳定的FRT细胞系4.1按照制造商的说明，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）表达BLAP-KCa3.1和BirA-KDEL的双顺反子质粒，并使用佐菌素（850μg/ml）选择稳定的细胞系（方案经奥塔哥大学生物安全委员会批准，批准代码GMD003298-33）。

按照制造商的说明，使用Lipofectamine 2000转染HEK293细胞。MDCK、Caco-2、LLC-PK1将FRT细胞接种到Transwell®渗透支架上（Corning Inc.，Corning，NY），并生长到汇合处，形成极化上皮（接种后3-4天）。极化MDCK、Caco-2、LLC-PK1或用BLAP-KCa3.1或BirA-KDEL/BLAP-KCa3.1腺病毒转导FRT细胞，如每个实验所示。简言之，将极化良好的细胞用Ca洗涤三次2+-去除PBS，然后将腺病毒添加到过滤器的顶端。在37°C和5%CO中孵育1小时后2/95%O2在大气中，用PBS清洗细胞一次，然后在正常生长培养基中恢复到第二天。在一些实验中，在将腺病毒添加到MDCK细胞中6小时后，按照制造商的说明，用WT或DN RME-1或使用Lipofectamine 2000的适当Rab构建物进一步转染细胞。

利用重组生物素连接酶对KCa3.1进行生物素化

如前所述，使用重组生物素连接酶（BirA）将BLAP标记的KCa3.1生物素化[22]或与BirA-KDEL联合表达[23]然后在4°C下用链霉亲和素Alexa555（0.01 mg/ml，Invitrogen）标记质膜BLAP-KCa3.1 15分钟。广泛清洗细胞以去除未结合的链霉亲和素，并按指示在37°C下培养不同时间段，或立即固定并用2%多聚甲醛和0.1%Triton X-100渗透[22]用WGA-Alexa488（小麦胚芽凝集素，5μg/ml）、（Invitrogen）标记顶端质膜。用DAPI（Sigma-Aldrich）标记细胞核。如前所述，使用63×油浸透镜通过激光扫描共焦显微镜（Olympus FluoView 1000系统）对细胞成像[19]Z堆叠以0.5μm的步长覆盖细胞的整个厚度。

抗体

GFP抗体来自Santa Cruz Biotechnology，Inc.（加州圣克鲁斯）。单克隆α-链霉亲和素抗体从Abcam（马萨诸塞州剑桥）获得。单克隆Flag、α-微管蛋白和β-肌动蛋白购自Sigma-Aldrich。抗Myc和HA抗体从Covance（新泽西州普林斯顿）获得，Rab8抗体从BD转导实验室（加利福尼亚州圣何塞）购买。

免疫沉淀和免疫印迹

我们的免疫沉淀（IP）和免疫印迹（IB）协议已被描述[15],[16]简单地说，细胞被裂解，用蛋白G-琼脂糖珠（Invitrogen）预先清除等量的总蛋白，然后与所示抗体孵育。正常IgG作为阴性对照。免疫复合物用蛋白G-琼脂糖珠沉淀，广泛洗涤，并重新悬浮在Laemmli样品缓冲液中。蛋白质通过SDS-PAGE溶解并转移到硝化纤维素中进行IB分析。为了消除IP中免疫沉淀抗体重链和轻链的干扰，使用小鼠或兔子IgG Trueblot ULTRA（eBioscience，加州圣地亚哥）作为二级抗体检测IB中的免疫沉淀蛋白。

KCa3.1质膜降解率的测定

内吞膜KCa3.1的降解率测定如下[22]简而言之，使用BirA对极化MDCK、Caco-2或FRT细胞中的KCa3.1进行特异性生物素化，并用非结合链霉亲和素标记，之后将细胞在37°C下培养不同时间，如图所示。在一些实验中，溶酶体蛋白酶抑制剂leupeptin（100μM）和胃蛋白酶抑制素（1μg/ml；Leu/Pep）（Sigma-Aldrich）、蛋白酶体抑制剂lactacystin（10μM，Lacta）或普通氘化酶（DUB）抑制剂PR-619（50μM）（LifeSensors Inc.，Malvern，PA）在37°C孵育步骤之前，添加到心尖膜和BL膜。然后裂解细胞，并通过SDS-PAGE分离等量的总蛋白，然后通过IB分离链霉亲和素。使用ImageJ软件（NIH；http://rsb.info.nih.gov/ij/). 将获得的不同时间点的带强度相对于时间0（T）的强度进行归一化 = 0）和已报告。还检测了印迹中的α-微管蛋白和β-肌动蛋白作为蛋白质负载对照。

使用TUBE下拉泛素化KCa3.1

为了确定KCa3.1在质膜上的泛素化状态，以及在内吞作用后，我们使用GST标记的串联重复泛素结合实体（TUBEs）（LifeSensors Inc.），如前所述[20]对Caco-2细胞进行酶生物素化，并在质膜上标记链霉亲和素，然后在GST-TUBEs（200μg/ml）存在下对细胞进行裂解，或在不同时间段内将细胞返回37°C以允许内吞作用发生，然后在TUBEs存在下进行裂解。随后用谷胱甘肽琼脂糖珠将TUBE拉下，然后进行SDS-PAGE。用α-链亲和素Ab探测产生的IB。通过这种方式，只检测到链亲和素标记的KCa3.1，其被泛素化，因此与TUBE结合[20].

再循环内体消融分析

用TfnR和BirA-KDEL/BLAP-KCa3.1腺病毒转导MDCK细胞。24小时后，根据Ang等人的方法进行再循环内体消融。[29]MDCK细胞与0.010 mg/ml Tfn-HRP和Tfn-Alexa488在37°C无血清培养基中孵育45分钟，在无血清αMEM培养基中洗涤两次，并在37℃孵育20分钟。然后在冰镇PBS上清洗细胞两次。在0.15 M NaCl和20 mM柠檬酸（pH 5.0）中通过两次5分钟的清洗去除表面结合的Tfn-HRP和Tfn-alexa488。在用冰镇PBS洗涤后，将细胞培养在含有0.1 mg/ml二氨基联苯胺（DAB；Sigma-Aldrich）的PBS中，在没有（对照）或存在（消融）H的情况下进行培养2O（运行）2（0.025%）在冰上黑暗放置1小时。Tfn-HRP与DAB和H反应2O（运行）2形成不溶性沉淀物，阻止高尔基后囊泡与再循环内体融合。在含有1%BSA的PBS中清洗细胞两次，从而停止消融反应。在循环内体消融后，向对照和消融细胞中添加中微子生物素结合蛋白（600μg/ml）（伊利诺伊州罗克福德的Thermo Scientific），并在4°C下消融2小时，以使所有质膜定位的BLAP-KCa3.1通道结合并被“阻断”从结合到随后添加链霉亲和素。然后在37°C下，将细胞在含有环己酰胺（400μg/ml，Sigma-Aldrich）的培养基中培养90分钟，以使ER/Gorgi-resident KCa3.1通道可能进入质膜。为了确定再循环内体消融术后ER/Golgi受体通道是否向质膜转运，我们在4°C下用链霉亲和素Alexa555（0.01 mg/ml，Invitrogen）标记15分钟。

KCa3.1从高尔基向质膜的贩运

用BirA-KDEL/BLAP-KCa3.1腺病毒转染MDCK细胞，然后用GFP标记的WT或DN RME-1转染。如上所述，用中性黄素（600μg/ml）“阻断”了定位和生物素化的BLAP-KCa3.1质膜。为了允许高尔基体中的通道积累，细胞在19°C的温度下在持续存在的中性粒细胞亲和素中培养2小时。然后在冰镇PBS上清洗细胞两次，添加温热培养基，并在37°C下培养细胞30分钟或2小时，以使通道通到质膜。最后，用链霉亲和素-Alexa555标记新驻留的质膜通道，用于IF定位研究，或用非结合链霉菌亲和素标记，然后用IB标记α-链球菌亲和素抗体，以量化质膜KCa3.1的出现率。类似地，用BirA-KDEL/BLAP-KCa3.1转染HEK293细胞，每个Rab构建体随后用中性粒细胞生成素“阻断”，在19°C培养以允许KCa3.1高尔基体积累，随后在37°C培养指定的时间段，以允许KCa 3.1从ER/高尔基体运输到质膜。然后用非结合链霉亲和素标记质膜定位的KCa3.1，然后用α-链霉亲和力抗体标记IB，以量化质膜外观。

统计分析

所有数据均以平均值±SEM表示，其中n个表示实验次数。使用Student’st吨-测试。为了比较IB带强度的标准化值，使用非参数Kruskal-Wallis检验进行统计分析。使用双向Anova测试和Bonferroni后测试分析从ER/高尔基体到质膜的流量，比较每个时间点的WT和DN。p<0.05的值被视为具有统计意义，并被报告。

结果

KCa3.1在极化上皮细胞中的表达和定位

为了确定KCa3.1在极化上皮细胞中的质膜定位，我们用BLAP-KCa3.1腺病毒转导了生长在Transwell过滤器上的MDCK、Caco-2和FRT细胞。第二天，使用重组BirA在质膜上特异性标记KCa3.1，然后用链霉亲和素Alexa555孵育。心尖质膜与WGA–Alexa488联合标记。如所示图1A，BLAP-KCa3.1仅定位于这些极化上皮细胞的基底外侧（BL）膜。使用Transwell®培养的细胞证实了这些结果，这些细胞分别在顶端（AP）或BL膜上用链霉亲和素标记，然后用α-链霉亲和力抗体标记IB。显然，KCa3.1在BL膜上高度表达，而与心尖膜相关的表达可以忽略不计(图1A). 为了确定KCa3.1在BL膜上的降解时间，我们标记了通道，并允许在37°C的指定时间段内内化，然后是IB，如上所述。如所示图1B和C在MDCK和FRT细胞中，KCa3.1的降解时间相似，而在Caco-2细胞中，降解速度较慢。

缩略图
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图1。KCa3.1在极化上皮细胞中的定位和降解。

A类.BLAP-KCa3.1被转导到MDCK、Caco-2或FRT细胞中，这些细胞在Transwell®过滤器上生长汇合。使用重组BirA对基底膜（BL）和顶膜（AP）质膜KCa3.1通道进行特异性生物素化，并用链亲和素Alexa555（红色）标记用于IF定位，或用未结合的链亲和蛋白标记用于IB。顶膜与小麦胚芽凝集素（WGA）-Alexa488（绿色）联合标记，细胞核用DAPI（蓝色）标记用于国际单项体育联合会本地化。顶部面板显示通过细胞中间平面的单个共焦截面，底部面板显示z堆叠。对于IB实验，BL和AP膜在单独的Transwell过滤器上独立标记。每条车道装载30μg蛋白质。数据代表了3个单独的实验。经IF和IB评估，KCa3.1仅定位于BL膜。B类如上所述，KCa3.1在MDCK和Caco-2细胞的BL膜上生物素化，或在稳定表达BirA-KDEl/KCa3.1-BLAP的FRT细胞的ER水平生物素化并评估其随时间的降解。请注意每个单元格行使用的不同时间点。Tubulin被用作负荷控制。C类.B中所示斑点的量化，至少用于3个单独的实验*T方面P<0.05 = 0

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0092013.g001

基底膜KCa3.1靶向溶酶体和蛋白酶体进行降解

为了确定溶酶体是否参与BL膜KCa3.1的降解，我们在正常条件下利用Transwell®过滤器上生长的Caco-2和FRT细胞，并在溶酶体蛋白酶被leupeptin和pepstatin（Leu/Pep）抑制后使用。如上所述，对BLAP-KCa3.1进行生物素化，并用链霉亲和素标记，然后在37°C下孵育指定时间，然后进行IB，以确定KCa3.1的剩余量。如所示图2在Caco-2细胞中，24小时后仍有28±3%的KCa3.1残留，在Leu/Pep（n = 4; P<0.05）。此外，在FRT细胞中，我们在5小时后观察到Leu/Pep的类似作用，即在对照细胞中，KCa3.1的残留量为29±1%，增加到81±4%（n = 6，P<0.05），表明内吞作用后溶酶体降解。

缩略图
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图2。BL定位的KCa3.1在溶酶体中降解。

BLAP-KCa3.1在生长于Transwell®过滤器和BL质膜通道上的Caco-2细胞中转导，BLA质膜通道被生物素化并用链霉亲和素标记。细胞用亮蛋白胨（100μM）和蛋白胨（1μg/ml）（Leu/Pep）或乳糜蛋白酶（10μM，Lacta）处理，并测定KCa3.1的降解。Leu/Pep和Lacta均抑制KCa3.1的降解。每条车道装载30μg蛋白质。下面绘制了3个实验的平均值*T方面P<0.05 = 0，相对于T，#P＜0.05 = Caco-2细胞24小时。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0092013.g002

我们还确定蛋白酶体抑制剂乳酸菌素是否会改变极化上皮中表达的BL KCa3.1的降解命运。如所示图2，乳酸菌素消除了KCa3.1的降解，24小时后，KCa3.1中有67±2%残留在Caco-2细胞中；显著高于对照条件（n = 4; P＜0.05），表明蛋白酶体在BL KCa3.1的降解中发挥作用。

KCa3.1在质膜和内吞作用后泛素化

为了确定KCa3.1在极化上皮中是否泛素化，Caco-2细胞生长在Transwell®支架上，KCa3.1表达并标记，如上所述。如所示图3A，T时 = 0，KCa3.1定位于BL膜，在37°C下8小时后，KCa7.1被内吞。为了评估KCa3.1的泛素化，在GST标记的TUBE存在下对细胞进行裂解（见方法）[20]T时 = 0，我们观察到少量泛素化KCa3.1(图3B内吞8小时或12小时（8小时：143±4%，12小时：139±1%；n = 3，P<0.05，图3B，车道2和3），尽管KCa3.1的总表达因降解而减少。这些结果表明KCa3.1在极化上皮的BL膜上泛素化，并且在内吞作用后增加。

缩略图
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图3。KCa3.1在极化Caco-2细胞内吞后泛素化。

A.标记后，KCa3.1（红色）在Transwell®过滤器汇合Caco-2细胞中的IF定位图1T时 = 0及之后8小时，温度为37°C。8小时后，KCa3.1被内吞。Nuclei标有DAPI（蓝色）。B类.泛素化KCa3.1在T = 0，当KCa3.1定位于BL膜，并在内吞8小时和12小时后（见方法）。尽管通道被降解，但泛素化KCa3.1在8小时和12小时明显增加[链球菌（KCa3.1）印迹]。肌动蛋白被用作加载控制。C类PR-619（50μM）抑制氘化酶可防止KCa3.1降解。Leu/Pep被用作这些实验的对照。每条车道装载30μg蛋白质。肌动蛋白被用作加载控制。D类.量化C中所示的至少3个单独实验的斑点*相对于T，P＜0.05 = 0，#相对于T，P<0.05 = 24小时。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0092013.g003

脱泛素酶（DUB）是一种蛋白酶，在目标蛋白发生蛋白酶体和/或溶酶体降解之前，从目标蛋白中重塑或裂解泛素[30],[31]如上所述，我们确定了DUBs是否在用BLAP-KCa3.1转导并在Transwell®支持物上生长的极化Caco-2细胞中的KCa3.1降解中发挥作用。将细胞在37°C的温度下，在有或无DUB抑制剂PR-619的情况下培养24小时，然后用IB评估KCa3.1-BLAP的表达。如图3C和D24小时后，KCa3.1被广泛降解，平均为T = 0（n） = 三；P<0.05），与上述结果相似。在PR-619处理的细胞中，通道降解被显著抑制，24小时后仍保留87±1%的KCa3.1（n = 三；P<0.05）。在这些实验中，溶酶体蛋白酶抑制剂Leu/Pep被用作阳性对照，阻止了KCa3.1的降解，与我们的上述结果相似，KCa3.1残留68±2.6%（P<0.05）。这些结果表明，DUBs对KCa3.1的氘化是极化上皮细胞通道正确降解的必要条件。

将KCa3.1从内质网/高尔基体贩运到质膜需要Rab1和Rab8

研究表明，Rabs 1、2和6参与了从内质网到高尔基体的蛋白质运输，而Rabs 8和10则参与了从高尔基体到质膜的蛋白质运输[26],[27],[32],[33]我们初步确定这些Rab是否参与将KCa3.1转运至HEK293细胞的质膜。对于这些研究，我们将BirA-KDEL/BLAP-KCa3.1与这些Rab的WT、DA或DN形式联合转染，以使BLAP-KCa3.1在ER中生物素化。然后通过链霉亲和素标记和IB检测质膜BLAP-KSa3.1，如上所述。我们通过联合转染带有myc标记的KCa3.1和相关Rab并进行myc印迹来评估KCa3.1的总表达。如所示图4A和B而Rab1（Q70L）和Rab8（Q67L）的WT或DA形式不影响KCa3.1、显性阴性Rab8的质膜表达（T22N:37±10%，n = 三；P<0.05）和Rab1（N124I:48±4%；S25N:44±8%；n = 三；P<0.05）显著降低KCa3.1质膜表达。相反，我们没有观察到Rabs 2或6对KCa3.1质膜表达的任何影响(图4B). 同样，我们观察到Rab 10对KCa3.1的质膜表达没有影响（数据未显示）。我们还确定了所观察到的Rabs的作用是否对KCa3.1具有特异性，或者是否会对另一个家族成员KCa2.3的质膜表达产生类似的影响。如所示图4DRabs 1、2、6或8对KCa2.3的质膜表达无影响。

缩略图
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图4。DN Rab1和Rab8降低了质膜定位KCa3.1，但Rab2或Rab6没有降低。

用BLAP-KCa3.1和WT、DA或DN Rabs 1、2、6或8联合转染HEK293细胞，通过特异性生物素化、链霉亲和素标记和IB评估质膜定位KCa3.1（见方法）。如所示A类和C类DN Rab8（T22N）和两种不同的DN Rab1（N124I，S25N）降低质膜KCa3.1的表达。相反，DN Rab2和Rab6对KCa3.1的膜表达没有影响(B类和C类). 每条车道装载30μg蛋白质。中的条形图C类是3个实验的平均值*WT Rabs方面P<0.05。D类HEK293细胞与BLAP-KCa2.3和WT、DA或DN Rabs 1、2、6或8联合转染，膜定位KCa2.3如上评估。这些Rab对KCa2.3（n = 3).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0092013.g004

我们还进行了联合IP实验，以确定KCa3.1是否与Rab1 WT/DN或Rab8 WT/DN相关。因此，我们将HA标记的KCa3.1与标记的Rab1或GFP标记的Rab 8联合转染到HEK293细胞中，并用α-HA抗体免疫沉淀，然后用IB免疫沉淀适当的异源表达的Rab。如所示图5A和B，KCa3.1主要与Rab1和Rab8的DN形式共免疫沉淀。此外，在我们的Rab8实验中，通过使用αRab8 Ab进行印迹，我们能够直接评估KCa3.1和内源性Rab8之间的相互作用。如图5B（下表），我们能够在异源表达的WT和DN Rab8存在下，将内源性Rab8与KCa3.1结合。事实上，我们观察到两种情况下内源性Rab8水平相似，表明一些Rab8继续与KCa3.1相关，并在DN Rab8存在的情况下促进渠道的前向贩运。

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图5。KCa3.1免疫沉淀与Rab1和Rab8。

A类如方法所述，在HEK293细胞中对HA标记的KCa3.1和WT或DN Rab1（Flag）进行Co-IP。使用α-HA-Ab（泳道5、6）或α-V5-Ab作为IgG对照（泳道3、4）对总细胞裂解物进行IP，随后对Rab1进行印迹（α-Flag）。B类.HA标记的KCa3.1的Co-IP和内源性（底部面板）或GFP标记的WT和DN Rab8（顶部面板）。总细胞裂解物按照A中的IP进行处理，随后对内源性Rab8（α-Rab8）或GFP标记的Rab8进行IB处理（α-GFP）。WT和DN Rab1或8的裂解物显示在每个印迹的前两条车道上（每条车道装载5μg）。这些数据证实了KCa3.1与Rabs1和Rabs8之间的关联。数据代表了3个实验。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0092013.g005

如果DN Rab的表达减缓了KCa3.1从ER/Galgi中的退出，那么很明显，向质膜的转运速度会降低。我们定义此步骤的方法如中的IF所示图6A在这些研究中，我们在HEK293细胞中表达了BirA-KDEL/BLAP-KCa3.1。通过链霉亲和素Alexa488标记（T = 4°C时为0）。立即用链霉亲和素Alexa555标记无信号（T = 4°C时为0；Strep-555），证实KCa3.1上的生物素位点饱和或被链霉亲和素Alexa488结合“阻断”。然后在19°C下培养细胞2小时，以在ER/Glgi（T）中积累BLAP-KCa3.1 = 19°C下2小时）。显而易见，一些链霉亲和素-Alexa488通道在19°C的孵育步骤中被内吞，但是，根据缺乏链霉亲和力蛋白-Alexa555标记的评估，没有其他通道被输送到质膜。在37°C下培养细胞80分钟后，我们在细胞内观察到小的绿色斑点，这与质膜KCa3.1的内吞作用一致。此外，新的通道已经从内质网/高尔基体进入质膜，因此可以被“捕获”，我们可以用链霉亲和素Alexa555标记这些新到达的通道。为了量化这个速率，我们利用中性粒细胞亲和素在质膜上“阻断”现有的BLAP-KCa3.1通道，并用链霉亲和素和IB“捕获”新到达的通道，如上所述。然后将任何时间点“捕获”的信道量与T处存在的信道量进行比较 = 0，表示稳态表达水平。从所有随后的时间点中减去“阻滞”后留下的任何信号，因为这代表了中微子亲和素无法束缚的通道数量。如所示图6B，KCa3.1迅速退出ER/高尔基体，并在10分钟内开始出现在质膜上，并且随着时间的推移，通道表达水平继续增加。在37°C下加入WT Rab1或Rab8 2小时后，KCa3.l在质膜上的表达水平恢复到T组的54±7%和46±5% = 分别为0。相反，在DN Rab1和Rab8存在的情况下，这仅为28±7（n = 三；P＜0.05）和27±4%（n = 三；P<0.05），表明DN Rab1和Rab8的表达降低了KCa3.1从内质网/高尔基体向质膜的转运率。

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图6。DN Rab1和Rab8减缓了KCa3.1的ER/Glgi-to-lasma膜传递。

A类.关于质膜BLAP-KCa3.1阻断方案的IF图解，以及随后沿着生物合成途径在质膜上出现的新BLAP-KSa3.1。在pBudCE中用BLAP-KCa3.1和BirA-KDEL转染HEK293细胞4.1使得BLAP-KCa3.1在ER水平上被特异性生物素化（参见方法）。顶行：质膜BLAP-KCa3.1标记有链霉亲和素-Alexa488（左侧；绿色），随后标记有链霉菌亲和素-Alexa555（中间；红色）。显而易见，strep-488饱和了生物素结合位点，排除了strep-555标记；现有质膜的演示块定位了KCa3.1通道。中间一行：在19°C下2小时后，在高尔基体中积累KCa3.1，一些最初在质膜上标记的通道（strep-488）已被内吞。用strep-555标记表明，在这19°C的孵育过程中，没有新的通道像预期的那样进入质膜。最下面一行：在37°C下进一步培养80分钟会导致KCa3.1通道在T = 0.用链球菌-555标记表明，新的KCa3.1通道出现在质膜上，与高尔基体外的转运相一致。Nuclei标有DAPI（蓝色）。B类除了使用中微子素阻断现有的质膜KCa3.1外，实验如A所示进行。如第2栏中的每个印迹所示，由于链霉亲和素与质膜BLAP-KCa3.1结合，中微子亲和素消除了90%以上的标记。在37°C下孵育10分钟内，KCa3.1开始出现在内质网/高尔基体退出后的质膜上。2小时后，KCa3.1相对于T恢复了约50% = 在存在WT Rab1和Rab8的情况下为0，而在存在DN Rab1或Rab8时降至～27%。每条车道装载30μg蛋白质。3个实验的平均值显示在条形图中。实心条表示存在WT-Rab时KCa3.1的表达，而开放条表示存在DN-Rab时的KCa3.1表达（与WT-Rab相同时间段相比，*P<0.05）。“<”表示非特定带。这些结果表明，DN Rab1和Rab8减缓了KCa3.1从ER/Glgi的退出，导致血浆表达降低，如图4.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0092013.g006

我们进一步确定Rabs 1和Rabs 8是否参与KCa3.1向极化MDCK和FRT细胞质膜的转运。最初，我们通过转染BirA-KDEL/BLAP-KCa3.1和转染WT或DN Flag-Rab1或GFP-Rab8进行IF研究。固定/渗透后，用链霉亲和素Alexa555在质膜上标记BLAP-KCa3.1，用α-Flag Ab标记Flag-Rab1；直接可视化GFP-Rab8。如所示图7ADN Rab1（N124I）或Rab8（T22N）的表达导致KCa3.1的质膜表达明显降低。为了从生化角度证实这一结果，我们进行了质膜BLAP-KCa3.1的IB。如所示图7B和CDN Rab1和Rab8均导致MDCK和FRT细胞中KCa3.1的质膜表达显著降低。在3个实验中，Rab1 N124I将MDCK和FRT细胞中WT Rab1表达后的质膜表达分别降低到60±3%和45±7%（P<0.05）(图7C). 同样，Rab8 T22N将MDCK和FRT细胞中WT Rab8表达后的质膜表达分别降低至57±8%和47±4%（P<0.05）(图7C). 与我们的HEK293数据类似，DN Rab2对MDCK细胞中质膜KCa3.1的表达没有影响(图7B)。

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图7。DN Rab1和Rab8降低极化上皮细胞KCa3.1的质膜表达。

A类.BLAP-KCa3.1和WT或DN Flag-Rab1（N124I）（顶行）或GFP-Rab8（T22N）（底行）转染到融合的MDCK细胞中。用链霉亲和素Alexa555（红色）标记质膜KCa3.1，然后固定/渗透细胞，用α-标记抗体标记Rab1（Rab8标记GFP）。DN Rab1（顶部面板）和Rab8（底部面板）均导致质膜KCa3.1表达明显减少。细胞核用DAPI（蓝色）标记。B类BLAP-KCa3.1和WT或DN Flag-Rab1（N124I）或GFP-Rab8（T22N）转染到MDCK（左）或FRT（右）细胞和IB评估的质膜KCa3.1中（见方法）。根据我们的HEK298数据，将WT和DN Rab2与BLAP-KCa3.1作为阴性对照转染到MDCK细胞中(图4). 每条车道装载10μg蛋白质。Tubulin被用作负荷控制。IB分别使用α-Flag和α-GFP抗体确认Rab1和Rab8的表达。C类对3个分离的印迹进行定量分析表明，DN Rabs1和8降低了MDCK和FRT细胞中KCa3.1的质膜表达（与WT Rabs相比，*P<0.05），而DN Rab2对MDCK细胞中的膜KCa3.1表达没有影响。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0092013.g007

极化上皮细胞中KCa3.1的BL正确分类不需要AP-1衔接蛋白μ1B

研究表明，衔接蛋白复合物AP-1的μ1B亚基在极化上皮中几种蛋白质的BL分类中起重要作用[34]重要的是，虽然μ1B在MDCK细胞中表达，但在LLC-PK中不表达1导致某些BL蛋白靶向错误的细胞[35]为了确定KCa3.1的BL靶向性是否需要μ1B，我们将BLAP-KCa3.1转导至亲代和μ1B-Flag校正的LLC-PK1如上所述，通过IF和IB评估BL和心尖定位。如所示图8，KCa3.1在LLC-PK中靶向BL膜1-WT和μ1B-表达LLC-PK1基于IF（A）和IB（B）的单元格。μ1B的表达被IB证实(图8C). 这些数据表明极化上皮中KCa3.1的BL分类独立于AP-1复合体的μ1B亚单位。

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图8。KCa3.1的基底外侧靶向性与衔接蛋白μ1B无关。

A类.BLAP-KCa3.1转导至WT LLC-PK1单元格（左侧面板）或LLC-PK1稳定表达μ1B（右面板）的细胞在Transwell®过滤器上生长汇合。使用重组BirA和生物素化蛋白对AP和BL膜进行生物素化，并用链霉亲和素Alexa555（红色）标记生物素化蛋白质。心尖膜与WGA-Alexa488（绿色）联合标记。用DAPI（蓝色）标记细胞核。顶部面板显示通过细胞中间平面的单个共焦截面，底部面板显示z堆叠。KCa3.1仅在LLC-PK的BL中检测到1克隆。B类.WT LLC-PK的AP或BL膜1单元格（左侧面板）或LLC-PK1使用BirA对生长在Transwell®过滤器上并融合的稳定表达μ1B（右面板）的细胞进行生物素化，然后进行链霉亲和素标记和随后的IB，以确定KCa3.1的定位。KCa3.1在两个LLC-PK1克隆中都特异定位于BL膜。Tubulin被用作负荷控制。印迹是3个独立实验的代表。每条泳道加载20μg蛋白质。C类.IB确认LLC-PK中Flag-tagedμ1B的表达1-μ1B细胞系。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0092013.g008

KCa3.1直接进入极化上皮细胞的基底外侧质膜

研究表明，通往BL膜的蛋白质可以通过以下两种途径进行运输：1）从高尔基体直接运输到BL膜，或2）通过再循环内体从高尔基体内运输到BL-膜[36],[37]为了确定KCa3.1是否通过再循环内体进行运输，我们对MDCK细胞进行了再循环内体消融[29]我们用转铁蛋白受体（TfnR）和BirA-KDEL/BLAP-KCa3.1腺病毒转导MDCK细胞。最初，Tfn-HRP和Tfn-Alexa488都与TfnR结合，并在37°C下内化45分钟，从而使具有结合底物的Tfn R通过早期和再循环内体进行运输。随后，用链霉亲和素Alexa555标记BLAP-KCa3.1，以确认在T = 0或neutravidin来“阻断”质膜驻留通道（另见，图6). 如所示图9，T时 = 0 Tfn-Alexa488位于内胚体隔室中，从绿色斑点可以明显看出，而KCa3.1定位于质膜。接下来，在无H（对照）或有H（消融）的情况下，通过用DAB处理细胞进行再循环内体消融2O（运行）2如标记为“Block”的图像所示，在没有DAB的情况下，Tfn-Alexa488位于细胞质中的小泡中，而在有DAB的条件下，Tfn-Alexa 488仅定位于核周再循环内体，如报告所述[29]这些结果证实了再循环内体消融，使得TfnR不再从这些囊泡中退出。此外，BLAP-KCa3.1不能被链霉亲和素Alexa555标记，证实了“Block”是由中性粒细胞亲和素标记的。最后，在环己酰胺存在下将细胞放回37°C下2小时，以便KCa3.1能够离开高尔基体并进入质膜，然后用链霉亲和素Alexa555标记这些通道。如图所示（Block+2小时37°C），KCa3.1在对照和再循环的内切体消融细胞中被转运至质膜，与KCa3.1直接转运至质质膜一致，而不是通过TfnR阳性再循环内切体。

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图9。KCa3.1不通过转铁蛋白阳性再循环内体运输到MDCK细胞的质膜。

用转铁蛋白受体（TfnR）和BirA-KDEL/BLAP-KCa3.1转导MDCK细胞，然后TfnR-与Tfn-Alexa488（绿色）和Tfn-HRP的混合物结合，并在37℃下内吞40分钟。然后用链霉亲和素Alexa555（红色）标记质膜BLAP-KCa3.1。这显示在左侧面板（T = 0），并确认在这些条件下，我们能够标记融合MDCK细胞中的TfnR和KCa3.1。为了确定KCa3.1是否通过TfnR阳性再循环内体进入质膜，我们如上所述标记了Tfn R，并用中性黄素阻断质膜BLAP-KCa3.1。随后，通过Tfn-HRP与H反应进行再循环内体消融2O（运行）2+DAB（DAB被省略为非消融控制）和ER/Galgi出口允许在37°C下继续运行2小时，然后将新输送至质膜的KCa3.1标记为strep-555（更多详细信息，请参阅方法和结果部分）。如T所示 = 0面板和无DAB对照（右上面板），Tfn-488在整个细胞质的内胚体中表达，正如预期的那样，它会再循环到质膜。然而，DAB依赖性消融后，Tfn-488聚集在再循环内体中，其核周定位证明了这一点；证实再循环内体消融导致TfnR转运回质膜受到抑制。重要的是，在消融细胞和非消融细胞中，BLAP-KCa3.1通过质膜，这表明KCa3.1在通往质膜的过程中不会通过TfnR-阳性再循环内体。图像代表了3个单独的实验。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0092013.g009

作为破坏再循环内体的替代策略，我们与BLAP-KCa3.1共同表达WT或DN RME-1（G429R）。DN RME-1诱导再循环内体的再分配，并抑制蛋白质的排出，从而使输送到DN RME-1阳性内体的货物被困在该隔室中[38]因此，我们确定G429R-RME-1的表达是否会抑制KCa3.1在高尔基体退出后向质膜的传递。用BirA KDEL/BLAP-KCa3.1腺病毒转导MDCK，并用WT或DN-GFP标记的RME-1转染。如所示图10A，T时 = 0，KCa3.1在WT或DN RME-1存在的情况下，在质膜上用链霉亲和素Alexa555标记，这种标记可以被中微子亲和素（Block）阻断。在19°C下培养以在高尔基体内积累KCa3.1后，我们无法在质膜（Block+19°C）中检测到KCa3.1，如上所述(图6和9). 最后，将MDCK细胞放回37°C下2小时，使通道离开高尔基体并进入质膜，然后用链霉亲和素Alexa555标记通道（Block+19°C+2小时37°C）。很明显，在WT和DN RME-1转染的MDCK细胞中，KCa3.1运输到质膜。我们通过IB确定KCa3.1在质膜上的出现率是否因DN RME-1的表达而改变，从而证实了这一结果。如图所示图10B和C，用中性粒细胞生成素阻断，消除了与质膜KCa3.1相关的信号。37°C下高尔基体释放20分钟后，KCa3.1在质膜上明显可见，2小时后表达增加。重要的是，表达WT或G429R RME-1的MDCK细胞质膜上表达类似水平的KCa3.1。在3个实验中，37°C下2小时后，KCa3.1在质膜上的表达没有差异，为对照组的66±11%（T = 0）和对照组的62±6%（T = 0）在G429R RME-1表达细胞中(图10C). 这些结果进一步证明，KCa3.1直接从高尔基体运输到BL膜，而不是通过再循环内体间接运输。

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图10。KCa3.1不通过RME-1阳性再循环内体进入质膜。

A类MDCK细胞转染BLAP-KCa3.1和GFP标记的WT（顶部面板）或DN（底部面板）RME-1。用链霉亲和素Alexa555（T = 0）生物素化后，这可以通过预先用中性粒细胞生成素（Block）来阻止。在质膜（block+19°C）上未检测到19°C BLAP-KCa3.1下的阻滞和ER/Golgi陷阱。随后在37°C下培养2小时，在WT-和DN-RME-1-表达的MDCK细胞的质膜上均出现BLAP-KCa3.1。B类A中的实验由IB定量。显然，在20分钟和2小时时，KCa3.1在质膜上的出现率不会因DN RME-1的表达而改变。每条车道装载10μg蛋白质。IB使用α-GFP抗体证实了WT和DN RME-1的表达C类填充条表示在WT RME-1存在时KCa3.1的表达（*T方面P<0.05 = 0），而开条表示存在DN RME-1时KCa3.1的表达（#P<0.05关于T = 0）（n =  3). KCa3.1质膜出现率无差异，表明KCa3.1在到达质膜的过程中不会通过RME-1阳性再循环内体。D类用TfnR转导MDCK细胞，并转染GFP标记的WT（顶部面板）和DN（底部面板）RME-1。TfnR与Tfn-Alexa546结合，并在37°C下内吞45分钟，然后固定/渗透细胞（见方法）。在存在WT RME-1的情况下，Tfn-546均匀分布在细胞质中，而在存在DN RME-1时，Tfn-546被困在核周隔室中。注意，在不表达DN RME-1的细胞中，Tfn-546定位于细胞质中，与观察到的WT RME-1表达类似。这些结果表明，与KCa3.1相比，TfnR通过RME-1阳性再循环内体进行转运。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0092013.g010

最后，我们通过用TfnR转染MDCK细胞，然后用WT或DN GFP标记的RME-1转染，来确定Tfn R是否会被困在RME-1阳性的内体中。TfnR与Tfn-Alexa546结合，并在37°C下内吞45分钟，然后固定细胞进行IF定位。如所示图10D，在WT RME-1存在的情况下，TfnR在整个细胞质的内体中。然而，在DN RME-1存在的情况下，TfnR聚集在RME-1阳性小室中。这一结果证实了DNRME-1能够捕获通过再循环内体运输的蛋白质。

讨论

根据电生理学和药理学数据，现在很清楚KCa3.1在许多上皮细胞的BL膜中表达[6],[7],[8],[9]然而，最近的证据表明K+人类支气管上皮两种原代培养物中的分泌物[12]和近端结肠[39]对鱼腥草毒素和克霉唑阻滞敏感；表明心尖膜中存在KCa3.1通道。根据这些数据，Rajendran和同事[40]鉴定出一个独特的转录物KCNN4c，该转录物缺少编码KCa3.1第二跨膜结构域的外显子2。这些作者证明，当与大电导Ca共同组装时，该通道靶向心尖膜2+-激活的K+通道β亚基[40]虽然这些数据表明KCa3.1可以靶向极化上皮的顶端或BL膜，这取决于表达的转录物，但迄今为止还没有信息表明该通道如何靶向BL膜或一旦进入BL膜后的内吞命运。在这里，我们使用BLAP标记的KCa3.1开始解决这些问题。我们证明KCa3.1-BLAP在BL膜上高度表达，而在三种不同极化上皮细胞模型（MDCK、Caco-2和FRT）的顶膜上无显著表达(图1A). 与我们之前在HEK293细胞中报道的类似[22]，KCa3.1在MDCK和FRT细胞中降解了约3-5小时。然而，在Caco-2细胞中，降解的半衰期明显更长，约为16小时(图1B). 目前尚不清楚为什么KCa3.1在Caco-2细胞中的降解速度减慢。虽然这可能表明KCa3.1降解在肠上皮中受到独特调节，但还需要更多的研究来确定这一点。

我们证明，极化上皮的BL膜内吞后，通过抑制溶酶体蛋白酶阻止降解(图2); 与我们之前在HEK293细胞中报道的类似[19]虽然我们已经证明了p97/Derlin-1和蛋白酶体在内质网中错误折叠的KCa3.1通道的降解中的作用[17]蛋白酶体在内吞作用后KCa3.1降解中的作用尚未被研究。如所示图2，乳酸胱氨酸抑制KCa3.1降解，表明26S蛋白酶体在将KCa3.1靶向溶酶体进行降解中发挥作用。许多研究表明，蛋白酶体抑制剂也阻止了膜驻留蛋白的降解[41],[42],[43]在这方面，有人认为泛素-蛋白酶体途径参与了一些蛋白质到溶酶体的内体分选步骤[44]最近的研究表明，Ecm29结合26S蛋白酶体，并通过其N末端和分子马达通过其C末端将蛋白酶体连接到各种内吞蛋白，包括Rab11和rabaptin[45]此外，MG132对蛋白酶体的抑制作用持续20小时，导致内胚体适配器蛋白APPL1和早期内胚体标记物Rab5重新分布到细胞的核周区，而早期内胚体内标记物EEA1不受影响[46]因此，26S蛋白酶体可能直接与含有KCa3.1的内体偶联，从而影响其降解。

迄今为止，已经鉴定出60多条Rab，并且认为每一条Rab都与特定的细胞器或通路有关[32],[47]Rab 2主要定位于ER/Glgi中间隔室（ERGIC），参与ERGIC到ER的逆行运输[48]Rab 6主要定位于高尔基体和跨高尔基体网络（TGN），在那里它调节高尔基体池之间或高尔基体到内质网的逆行运输[25]已有研究表明，DN Rab 2和Rab 6的表达可抑制许多蛋白质的顺行运输，包括囊性纤维化跨膜电导调节器（CFTR）和G蛋白偶联受体（GPCR）[48],[49]此外，Rab 1定位于内质网和高尔基体中，调节从内质网到高尔基体的顺行运输以及高尔基体间的顺行输送[32]Rab1功能的操纵被证明可以阻断α-肾上腺素能、血管紧张素II 1型和人钙敏感受体的ER到细胞表面的转运[50],[51],[52]最后，在极化上皮细胞中对Rab 8和Rab 10进行了广泛的研究，发现它们在高尔基体向BL膜的蛋白质运输中发挥作用[27],[33],[53]在此，我们证明Rab1和Rab8在KCa3.1顺行运输到极化MDCK细胞的BL膜中起着至关重要的作用(图7)而Rabs 2、6和10似乎在KCa3.1贩运中没有发挥作用。事实上，我们证明DN Rab1或Rab 8的表达减缓了KCa3.1在HEK细胞质膜上的出现(图6)与它们在各种蛋白质的前向贩运中的已知作用相一致[27],[50],[51]有趣的是，作为一个密切相关的家族成员，KCa2.3不受任何这些Rab的DN形式表达的影响(图4D)，表明在这些KCa家族成员中具有高度的特异性。不幸的是，KCa3.1和KCa2.3之间的嵌合体并没有揭示出任何对依赖Rab的KCa3.1贩运至关重要的明显域（C.A.Bertuccio和D.C.Devor，未发表的观察结果）。

GPCR已被证明与Rab家族成员直接相互作用，包括与β相互作用的Rab1和Rab82-和α2-肾上腺素能受体[27],[54]在此，我们通过co-IP证明了KCa3.1和WT或DN Rab1和Rab8之间的密切联系(图5). 有趣的是，KCa3.1优先与Rab1和Rab8的非活性、GDP结合形式结合，类似于一些GPCR的描述[27],[54]事实上，有人认为这些受体可以与Rab GTPase相互作用并激活它们，从而促进它们自身的转运[27],[55]，尽管这对于KCa3.1来说是未知的。

极化上皮BL结构域的众多蛋白质的分类是与衔接蛋白-1复合体（AP-1）的μ1亚单位相关联的结果[56],[57]AP-1复合物是唯一一种与极化上皮BL分类有关的氯菊酯相关的衔接物复合物[58]重要的是，虽然μ1B在MDCK和Caco-2细胞中表达，但在LLC-PK中不表达1细胞。LLC-PK缺乏μ1B亚单位1研究表明，细胞会导致一些BL蛋白误靶向顶端表面，μ1B的稳定表达会恢复BL的正确靶向性[35]此外，Ang等人证明Rab8与AP-1B协同作用，将蛋白质靶向极化上皮的BL膜[53]由于KCa3.1在MDCK细胞中内源性表达[59]，以氯菊酯依赖的方式内吞[21]其质膜表达受Rab8调控(图4和7)，我们使用LLC-PK评估了KCa3.1的BL靶向性是否需要μ1B1-WT和μ1B-表达LLC-PK1细胞。如所示图8，KCa3.1靶向WT和μ1B-表达LLC-PK的BL膜1这表明极化上皮中KCa3.1的BL分类独立于AP-1复合体的μ1B亚单位。同样，卡普兰和他的同事证明了H+/K（K）+-ATP酶和钠+/K（K）+-ATP酶与极化上皮中μ1B的表达无关[28],[60].

如前所述，在极化细胞和非极化细胞中，沿着生物合成路线运输到质膜的蛋白质，既可以直接从高尔基体运输至质膜，也可以通过再循环内体运输[29],[32],[37],[61],[62]为了确定KCa3.1在到达质膜之前是否通过再循环内体进行转运，我们使用两种不同的策略监测了KCa3.1的质膜外观。首先，我们使用Tfn-HRP进行再循环内体消融，导致TfnR被困在核周隔室中(图9)[29]然而，KCa3.1转运至BL膜，表明该通道不通过TfnR阳性再循环内体转运。其次，我们利用DN RME-1方法破坏再循环内体。Lin等人。[38]结果表明，epsin同源结构域（G429R）中的突变诱导了再循环内体的重新分布，并抑制了蛋白质从该隔室中流出。我们证明，内吞作用后，KCa2.3靶向RME-1阳性细胞室，而KCa3.1没有靶向RME1阳性细胞室[22].英寸图10，我们表明KCa3.1同样不针对高尔基体沿生物合成途径退出后的内体再循环。事实上，我们证明KCa3.1在质膜上的出现率不会因DN RME-1的表达而改变(图10B)表明交货率没有变化。因此，使用两种不同的方法破坏再循环内体隔间表明，KCa3.1不会沿着生物合成途径通过该隔间。

蛋白质向BL膜的有序转运是一个重要的过程，它控制细胞表面的蛋白质数量，从而调节其功能。在此，我们证明KCa3.1以Rab1和Rab8依赖的方式靶向极化上皮的BL膜。然而，在高尔基体退出后，KCa3.1的正确BL靶向与AP-1B复合物无关。此外，我们证明，新合成的KCa3.1通道的贩运路线并不涉及通过再循环内体室。最后，在正确插入BL膜后，KCa3.1被内吞并靶向溶酶体降解，这一过程需要先进行泛素化，然后进行去泛素化。乳酸菌素对这一过程的抑制表明，蛋白酶体在功能上与含有KCa3.1的内体有关。

作者贡献

构思并设计了实验：CAB SLL GW MBB KLH DCD。执行实验：CAB SLL。分析数据：CAB SLL KLH DCD。贡献的试剂/材料/分析工具：CAB SLL GW MBB KLH DCD。撰写论文：CAB SLL GW MBB KLH DCD。

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