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研究文章

抗Endoglin的siRNA多次导入小鼠乳腺癌抑制血管生成和延缓肿瘤生长

摘要

内皮素是一种转化生长因子-β（TGF-β）共受体，参与激活信号通路，介导血管生成性肿瘤血管内皮细胞增殖和迁移。因此，沉默内皮素的表达是肿瘤抗血管生成治疗的一种有吸引力的方法。我们研究的目的是评估小干扰核糖核酸（siRNA）分子对endoglin的治疗潜力在体外和体内.治疗潜力在体外通过测定内皮素表达水平、细胞增殖和管形成来评估人类和小鼠内皮细胞（HMEC-1，2H11）。体内在BALB/c小鼠TS/A乳腺癌中评估siRNA分子的治疗潜力。我们的研究结果表明，抗内皮素的siRNA分子具有良好的抗血管生成治疗潜力在体外脂质体感染后，小鼠和人微血管内皮细胞中内皮素mRNA和蛋白的表达被有效降低，导致内皮细胞增殖和管形成受到抑制。体内通过将siRNA分子三重电转移至TS/A乳腺癌，沉默内皮素也显著降低了mRNA水平、肿瘤血管数量和肿瘤生长。所获得的结果表明，沉默内皮素是一种很有前景的肿瘤抗血管生成治疗方法，不能作为单一治疗，而是作为现有细胞毒治疗方法的辅助手段。

引用：Dolinsek T，Markelc B，Sersa G，Coer A，Stimac M，Laverencak J，et al.（2013）针对Endoglin的siRNA多次传递到小鼠乳腺癌中可防止血管生成并延缓肿瘤生长。公共科学图书馆综合8（3）：e58723。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0058723

编辑：萨尔瓦多·V·皮佐，美国杜克大学医学中心

收到：2012年11月20日；认可的：2013年2月5日；发布时间：2013年3月5日

版权：©2013 Dolinsek等人。这是一篇根据知识共享署名许可证条款分发的开放存取文章，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原创作者和来源已获得认可。

基金：作者感谢斯洛文尼亚研究机构（项目编号P3-0003，项目编号J3-4211）从国家预算中提供的财政支持。研究在EBAM欧洲联合实验室（LEA）范围内进行。这份手稿是成本行动TD1104网络工作的成果。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

介绍

癌症的抗血管生成治疗是传统癌症系统治疗的一种有希望的方法。也就是说，肿瘤依靠血管生成生长超过几毫米三因为它们在缺乏氧气和营养的情况下无法生长。血管生成性肿瘤血管中的内皮细胞增殖速度远快于正常血管，因此它们是理想的治疗靶点。快速增殖也是由于某些内皮细胞标志物的表达增加[1],[2]其中一个标志物是内皮素（CD105），一种TGF-β共受体，参与激活介导细胞增殖、迁移和粘附的复杂信号通路[3],[4]在肿瘤内部和周围增殖的血管内皮细胞中，内皮素表达高度升高[5]–[7]由于内皮素在血管生成内皮细胞中的表达增加，靶向内皮素的抗体已被用于肿瘤成像[8]–[11]endoglin被提议作为肿瘤预后标志物[12]–[14]此外，几个在体外研究表明，不同的抗endoglin抗体抑制人内皮细胞的增殖和管的形成[15]–[17]这为抗内皮素抗体用于血管靶向治疗提供了有力的实验支持体内大多数研究是在携带人类MCF7乳腺癌的免疫缺陷SCID小鼠中进行的。当使用毒素结合或放射性标记的抗内皮素抗体进行重复治疗时，肿瘤生长得到了长期的抑制，而裸抗体对肿瘤生长的影响较小[18]–[21]。裸体抗endoglin抗体在携带4T1乳腺癌或结肠-26结肠癌的免疫活性BALB/c小鼠中也有抗肿瘤效果和抗转移活性[22]–[24].

通过RNA干扰沉默内皮素mRNA是另一种有吸引力的内皮素靶向方法。这种方法已经过研究在体外并证明endoglin的沉默可减少小鼠胚胎内皮细胞的增殖[25]然而，内皮素沉默对在体外抗血管生成潜能和体内肿瘤生长抑制尚未被研究。因此，我们研究的目的是评估siRNA分子对内皮素的治疗潜力在体外和体内首先，内皮细胞系中内皮素的表达水平在体外和乳腺肿瘤体内在endoglin沉默后进行评估。其次，测定内皮素沉默对内皮细胞增殖和管形成的影响在体外最后，研究了siRNA分子对内皮素的治疗潜力体内在携带TS/A乳腺癌的BALB/c小鼠中。

结果

内皮素在内皮细胞、肿瘤细胞和肿瘤中的表达

采用定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）检测HMEC-1人内皮细胞、2H11小鼠内皮细胞、TS/A肿瘤细胞和BALB/c小鼠TS/A皮下肿瘤中内皮素的表达。HMEC-1和2H11细胞表达高水平的内皮素。在TS/A肿瘤细胞中，内皮素的表达很低。相反，在BALB/c小鼠中诱导的TS/A肿瘤表达较高水平的内皮素，表明内皮素水平升高源自肿瘤血管中的内皮细胞，而不是肿瘤细胞本身(表1).

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表1。内皮素在内皮细胞、肿瘤细胞和肿瘤中的表达，以qRT-PCR获得的阈值（Ct）表示，并与参考基因进行比较。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0058723.t001

用siRNA分子转染内皮细胞后，内皮素表达降低

用靶向内切蛋白编码序列不同片段的siRNA分子转染HMEC-1和2H11细胞两天后，与仅用Lipofectamine RNAiMAX和阴性对照siRNA处理的细胞相比，这些细胞中的内切蛋白mRNA水平在统计学上显著降低。在人类HMEC-1内皮细胞中，所有三种测试的siRNA分子（h_siRNA 529、h_siRNA2 40、h_si RNA 241）都将内皮素mRNA水平降低到大致相同的水平，范围从88到96%(图1A). 在小鼠内皮细胞系中，两种测试的siRNA分子（m_siRNA 868和m_siRNA 869）在降低内皮素mRNA水平方面同样有效(图1B)而m_siRNA 150仅略微降低内皮素mRNA水平。

缩略图
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图1。用抗endoglin的siRNA转染内皮细胞导致mRNA和蛋白质水平降低。

（A） qRT-PCR分析内皮细胞HMEC-1转染3种不同siRNA分子（hsiRNA 529、hsiRNA 240、hsiRNA241）后内皮素mRNA水平。（B） qRT-PCR分析内皮细胞2H11转染3种不同siRNA分子（m_siRNA 868、m_siRNA 869、m_si RNA 150）后内皮素mRNA水平。用siRNA分子处理的细胞中内皮素的mRNA水平归一化为仅用Lipofectamine RNAiMAX处理的细胞的内皮素mRNA水平（LF的%）*与未经处理的对照细胞（HMEC-1或2H11）、LF和阴性对照siRNA（siRNA Ctrl）相比，P<0.05。数据表示算术平均值±SEM。（C） 用3种不同的siRNA分子（h_siRNA 529、h_siRNA 240、h_siRNA 241）转染内皮细胞HMEC-1后endoglin的免疫荧光染色。（D） 内皮细胞2H11转染3种不同siRNA分子（m_siRNA 868、m_siRNA 869、m_si RNA 150）后内皮素的免疫荧光染色。（E） 用3种不同的siRNA分子（h_siRNA 529、h_siRNA2 40、h_si RNA 241）转染细胞后，用流式细胞术分析测定HMEC细胞内切蛋白染色的平均荧光强度。（F） 用3种不同的siRNA分子（m_siRNA 868、m_siRNA 869、m_si RNA 150）转染细胞后，用流式细胞仪分析测定2H11细胞内切蛋白染色的平均荧光强度。将数值归一化为脂质内酰胺RNAiMAX组（LF的%）*与未经处理的对照细胞（HMEC-1，2H11）、LF和siRNA Ctrl相比，P<0.05。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0058723.g001

除了endoglin mRNA水平外，还通过endoglin的免疫荧光染色和endoglin阳性细胞的流式细胞术分析来确定siRNA分子对endoglin表达的沉默作用。在HMEC-1细胞中，通过减少内皮素的免疫荧光染色证明了所有三种测试的siRNA（h_siRNA 529，h_siRNA240，h_si RNA 241）都能沉默内皮素(图1C). 在2H11细胞中，2H11的免疫荧光染色显示，m_siRNA 868和m_siRNA869在mRNA水平上与m_siR-150一样，在更大程度上减少了内切蛋白的数量，mRNA水平的qRT-PCR也证明了这一点(图1D).

内皮素阳性内皮细胞的流式细胞术分析证实了免疫荧光染色的结果。与仅用Lipofectamine RNAiMAX处理的细胞相比，用所有3种siRNAs转染后，HMEC-1细胞的平均荧光强度在统计学上显著降低了约50%(图；1E级). 另一方面，m_siRNA 868和m_siRNA 869的2H11细胞的平均荧光强度在统计学上显著降低（约25%），而qRT-PCR和免疫荧光染色已经证明m_siDNA150对内切蛋白水平的影响很小(图1F).

转染抗内皮素的siRNA分子后，内皮细胞增殖减少

用不同的siRNA分子沉默内皮素对内皮素高表达的HMEC-1（加倍时间：55.0 h）和2H11细胞（加倍时间18.6 h）增殖的抑制作用持续4-6天。在HMEC-1细胞中，与仅用Lipofectamine RNAiMAX处理的HMEC-1的细胞增殖相比，h_siRNA 529转染后第6天的细胞增殖显著降低约60%，具有统计学意义。其他2个siRNA分子h_siRNA240和h_siRNA 241也对细胞增殖有影响，但无统计学意义。此外，siRNA Ctrl没有显著降低细胞增殖(图2A). 由于2H11细胞的快速生长，增殖只持续了4天。与仅用Lipofectamine RNAiMAX处理的2H11细胞的增殖相比，M_siRNA 869在转染后第4天将细胞增殖降低了约45%。其他2个siRNA分子m_siRNA 868和m_siRNA150以及siRNA Ctrl没有显著降低细胞增殖(图2B).

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图2。抗内皮素的siRNA对细胞增殖的影响。

（A） 仅用Lipofectamine RNAiMAX（LF）、h_siRNA 529、h_si RNA 240、h_sii RNA 241和阴性对照siRNA（siRNA Ctrl）转染HMEC-1细胞后的增殖。（B） 仅用Lipofectamine RNAiMAX（LF）、m_siRNA 868、m_si RNA 869、m_sii RNA 150和阴性对照siRNA（siRNA Ctrl）转染后2H11细胞增殖。（C） 仅用Lipofectamine RNAiMAX（LF）、m_siRNA 868、m_si RNA 869、m_sii RNA 150和阴性对照siRNA（siRNA Ctrl）转染后TS/A细胞增殖。每个实验组的细胞增殖恢复到第0天*与未经处理的对照细胞（HMEC-1、2H11或TS/A）、LF和siRNA Ctrl相比，P<0.05。注意，由于HMEC-1细胞生长较慢，y轴的范围不同。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0058723.g002

此外，我们证明，靶向小鼠内皮素的siRNA分子转染不会减少小鼠乳腺癌细胞TS/A的增殖，后者表达极低水平的内皮素mRNA(图2C).

转染抗内皮素的siRNA分子后，内皮细胞的管状结构减少

为了确定siRNA分子对内皮素的抗血管生成潜能，内皮细胞管形成试验(在体外血管生成测定）。转染后2天和3天，h_siRNA 529抑制HMEC-1细胞的试管形成。其他两种siRNA分子h_siRNA 240和h_siRNA 241以及siRNA Ctrl对HMEC-1细胞的管形成没有显著影响，从而证实了细胞增殖获得的结果(图3A、3B). 二值图像分析表明，h_siRNA 529在转染后第2天和第3天显著降低了肾小管复合体的总长度、肾小管复合物的总尺寸和连接数(表2). 在第2天下降更为明显，表明内皮素沉默的作用是短暂的。其他两种siRNA分子（h_siRNA 240和h_siRNA241）对管状复合体的测量性能没有显著影响。

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图3。含有siRNA的HMEC-1和2H11细胞对内皮素的脂质作用减少了管形成。

转染不同siRNA分子2天后HMEC-1细胞管状复合体的原始图像（A）和相应的二元掩模（B）：未经处理的对照细胞（HMEC-1）、仅转染Lipofectamine RNAiMAX（LF）的细胞、h_siRNA 529、h_si RNA 240、h_sii RNA 241和阴性对照siRNA（siRNA Ctrl）。用不同siRNA分子转染2天后2H11细胞的管状复合物（C）和相应的二元掩模（D）的原始图像：未处理的对照细胞（2H11）、仅用Lipofectamine RNAiMAX（LF）、m_siRNA 868、m_siRNA 869、m_siRNA 150和阴性对照siRNA（siRNA Ctrl）转染的细胞。比例尺：100µm。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0058723.g003

缩略图
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表2。用3种不同的siRNA分子（h_siRNA 529、h_siRNA2 40、h_si RNA 241）转染内皮细胞HMEC-1后，管状复合体的总长度、管状复体的总尺寸和连接数。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0058723.t002

根据在HMEC-1细胞中获得的结果，在转染两天后测定2H11细胞的试管形成。M_siRNA 869分子显著抑制试管形成。其他2个siRNA分子m_siRNA 868和m_siRNA150以及siRNA Ctrl对2H11细胞的管形成没有显著影响，从而证实了由细胞增殖决定的结果(图3C，3D). 二值图像分析显示，m_siRNA 869在转染后第2天显著降低肾小管复合体总长度约16%，肾小管复合物总尺寸约13%，连接数约22%。另外两种siRNA分子（m_siRNA 868和m_siRNA150）对管状复合体的测量性能没有显著影响。

用siRNA分子转染TS/A肿瘤后，肿瘤生长和内皮素mRNA水平降低体内

对于体内由于TS/A细胞本身表达几乎无法检测到的内皮素mRNA水平，我们的目标是靶向肿瘤内的支持细胞，因此我们使用了生长在免疫活性BALB/c小鼠中的小鼠TS/A乳腺癌进行了肿瘤内皮素沉默实验。此外，转染抗内皮素的siRNA后，TS/A细胞的增殖没有改变在体外.由于脂质体转染效率低体内在肿瘤中，电转移用于体内实验[26]在TS/a肿瘤中单次电转移m_siRNA 869后体内，未观察到有统计学意义的肿瘤生长减少(图4A)尽管在治疗后第2天，与未治疗的对照肿瘤相比，endoglin mRNA水平在统计学上显著降低了约50%(图4B). 重复治疗（连续三天三次电转染m_siRNA 869）后，在治疗开始后的前6天，与所有其他组相比，肿瘤生长明显减少，具有统计学意义(图4C)以及肿瘤的三倍增长时间(表S1). 然而，这种减少持续6天后，治疗组肿瘤的生长速度与对照组肿瘤的增长速度相似。其他相关的对照治疗并不影响肿瘤生长，尽管在所有这些治疗组中，肿瘤都接受了H2O（对照组和EP组）或m_siRNA Ctrl（m_siRNA-Ctrl和m_si核糖核酸Ctrl+EP组）3次。肿瘤的生长速度与接受单一治疗的肿瘤相同。此外，与治疗后第2天未治疗的对照肿瘤相比，内皮素mRNA水平在统计学上显著降低了80%以上(图4D). 重复三次瘤内注射m_siRNA 869对肿瘤生长和内皮素mRNA水平也有轻微影响，降低了约60%，但差异无统计学意义。这些结果以及单次电转移后的结果表明，内皮素mRNA水平的降低必须至少达到60%才能产生明显的肿瘤反应。此外，在观察期内，动物的体重没有变化，表明治疗没有引起全身毒性。

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图4。小干扰RNA对TS/A肿瘤内皮素的电转移作用。

（A） 暴露于单一疗法的TS/A肿瘤的生长：瘤内注射H2单独（对照）或联合应用电脉冲（EP）、瘤内注射m_siRNA 869、瘤内注入阴性对照siRNA（siRNA-Ctrl）、电转染m_siRNA-869（m_siRNA-869+EP）和阴性对照siRNA-Ctrl+EP。箭头表示治疗日期。（B） 单次治疗后内皮素mRNA水平的qRT-PCR分析。（C） 重复治疗下TS/A肿瘤的生长。箭头代表治疗日期。（D） 重复治疗后内皮素mRNA水平的qRT-PCR分析*与所有组相比P＜0.05。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0058723.g004

体内用siRNA分子三重转染TS/A肿瘤后血管数量减少

m_siRNA 869三重电转移后2天进行组织学分析。在肿瘤的存活部分，不同组之间的内皮细胞或血管壁厚度没有形态学变化。在接受m_siRNA 869三重电转移治疗的组中，观察到管腔较大的血管。此外，小血管不像对照组或其他组那样明显。因此，由于内皮素参与内皮细胞的激活，从而使血管萌芽，因此对直径小于30μm的CD31阳性血管进行计数，以确定内皮素沉默的抗血管生成作用。根据组织切片中血管的外观，选择此切点作为肿瘤毛细血管的代表。m_siRNA 869的三重电转移显著减少了肿瘤中的血管数量。单独应用电脉冲和单独使用m_siRNA 869治疗也减少了肿瘤血管的数量，但程度较小。单独使用对照siRNA Ctrl或结合电脉冲治疗肿瘤不会影响肿瘤血管的数量(图5A、5C). 对肿瘤进行Ki-67的额外染色以评估治疗后肿瘤细胞的增殖情况，结果表明，各治疗组间增殖肿瘤细胞的比例没有差异。这些结果支持CD31染色的结果，表明对肿瘤生长的影响是由于阻止小血管的生长，而不是通过直接作用于肿瘤细胞的增殖(图5B、5D).

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图5。抗内皮素的SiRNA减少了血管数量，但不影响肿瘤细胞的增殖。

反复治疗TS/A肿瘤后用抗CD31（A）和抗Ki-67（B）抗体进行免疫组织学染色的肿瘤切片：瘤内注射H2单独（对照）或联合应用电脉冲（EP）、瘤内注射m_siRNA 869、瘤内注入阴性对照siRNA（siRNA-Ctrl）、电转染m_siRNA-869（m_siRNA-869+EP）和阴性对照siRNA（siRNA Ctrl+EP）。比例尺：50μm。（C） 30倍放大镜下肿瘤切片中每个视野小于30μm的平均血管数量（D）30倍放大率下肿瘤切片每个视野中Ki-67阳性细胞的平均数量*与对照组、siRNA Ctrl和siRNA Ctrl+EP相比，P<0.05。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0058723.g005

讨论

在这项研究中，我们发现抗内皮素的siRNA分子具有良好的抗血管生成治疗潜力在体外和体内也就是说，转染后内皮细胞中endoglin mRNA和蛋白水平的表达有效降低，这导致内皮细胞增殖和管形成的抑制在体外.体内m_siRNA 869重复电转染后，在内皮素mRNA水平和肿瘤血管数量减少（导致TS/a肿瘤的生长显著减少）方面，沉默效应明显。

肿瘤血管生成和血管发育过程中内皮素在增殖血管内皮细胞中的过度表达[3],[5],[27],[28]使endoglin靶向治疗成为肿瘤治疗中一种有前途的抗血管生成治疗方法。已经进行了几项使用抗内皮素抗体的研究。然而，据我们所知，我们的研究是首次全面评估siRNA分子沉默内皮素表达对抗血管生成潜能的影响在体外和抗肿瘤效果体内.

在我们研究的第一部分中，沉默内皮素的抗血管生成潜能在体外通过细胞增殖和在体外管子成型。我们的结果表明，h_siRNA 529和m_siRNA 869是有效的治疗分子，因为用这些siRNA转染内皮细胞导致内皮素mRNA和蛋白水平降低，细胞增殖和内皮细胞管形成减少。内皮细胞的增殖减少至～60%，这与使用siRNA对抗小鼠内皮素或特异性抗体和纳米体的其他研究结果一致。Lebrin等人研究了内皮素通过TGF-β受体复合物信号传导调节内皮细胞功能的分子机制，他们证明在TGF-[25]Maier等人证明，抗endoglin抗体TEC-11在孵育3天后分别降低了约60%和约75%的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和人真皮微血管内皮细胞（HDMEC）的增殖[16]在She等人的研究中，4种不同的SN6系列抗体在孵育3天后抑制HUVEC细胞增殖26–55%[17].Ahmadvand等人描述了一种新的靶向内皮素的纳米体（无轻链抗体的单体可变域），也观察到在孵育3天后，原代HUVEC细胞的增殖受到约40%的抑制[15].

体外试管形成分析通过测量内皮细胞形成毛细血管样管状结构的能力，快速评估治疗的抗血管生成潜力[29]在我们的研究中，内皮细胞内内皮素的沉默导致抗血管生成作用，因为用hsiRNA 529转染HMEC-1细胞可减少内皮细胞管的形成在体外对于∼30%，而用m_siRNA 869转染2H11细胞的效果不太明显，这可能归因于2H11的快速生长，从而导致转染细胞中siRNA的稀释。与我们对siRNA的研究结果类似，抗内皮素纳米体也对试管形成产生抑制作用[15]在原代HUVEC细胞中存在TGF-β的情况下，反义DNA对抗内皮素mRNA[30]因此，我们使用siRNA分子沉默endoglin的方法被证明是有效的在体外与其他用抗体或DNA寡核苷酸靶向内切蛋白的策略相比。基于鼓励在体外结果体内进行了研究。

对于体内实验中，选择了经临床验证的方法电转染代替脂肪感染，将m_siRNA 869导入皮下肿瘤。与肿瘤脂质体感染相比，电转染产生更高的转染效率[26]此外，它是将不同分子输送到不同类型细胞的有效和安全的方法在体外和组织体内 [31]–[33]它也用于临床，与化疗药物博莱霉素或顺铂或编码白介素-12的质粒DNA联合治疗肿瘤[34]–[37].关于小干扰RNA向肿瘤电转移的报道很少；迄今为止，siRNAs的电转染仅用于沉默稳定转染肿瘤细胞B16F10中的报告绿色荧光蛋白，以及沉默血管内皮生长因子VEGF和Rho GTPase Rac1基因[38]–[40]在Golzio等人的研究中，与我们的结果类似，在m_siRNA 869的一次电转染后，内切蛋白的mRNA水平降低了50%，GFP的mRNA降低了52%[38]此外，该研究表明，电转移siRNAs的作用寿命很短，持续时间不到5天[38]因此，为了证明siRNA对内皮素的治疗潜力体内，采用重复（3次）治疗，并与单一治疗进行比较。重复性方法也用于其他治疗性siRNA的电转移研究[39],[40]在我们的研究中，用m_siRNA 869电转移对肿瘤进行单次治疗或单独用m_siRNA 869进行多次治疗足以使endoglin沉默高达60%，但这并没有或只是轻微地反映在肿瘤生长的减少上。另一方面，m_siRNA 869的三重电转染可将内切蛋白mRNA水平降低80%，从而产生显著的抗肿瘤效果并显著延缓肿瘤生长。我们的结果与其他体内研究中，全身注射抗内皮素抗体用于治疗。与我们的3次局部治疗相比，多次注射（4或5次）抗体对肿瘤生长有显著影响是必要的。在Tsujie等人的研究中，经抗内皮素抗体SN6j治疗后，结肠-26和4T1肿瘤的生长显著降低；在结肠26中使用5次治疗，在4T1乳腺癌模型中使用4次治疗[23]因此，我们的方法虽然是局部的，但可以作为抗体治疗的可行替代方案，尤其是因为它不会导致动物体重的任何变化，这表明该治疗不会引起全身毒性。然而，要取得显著的抗肿瘤效果，需要多次给药。因此，这种治疗方法，就像抗体治疗一样，可以预见为标准化疗或放疗的辅助治疗。此外，由于siRNA从血流中清除的速度很快，因此缺乏治疗效果，与瘤内注射相比，siRNA的系统传递目前还存在技术障碍[41].

其他抗血管生成治疗方法使用电转移作为传递系统，利用siRNAs对抗Rac1和VEGF[39],[40]Rac1是参与VEGF信号通路的Rho-GTPase，而endoglin是TGF-β共受体，其在肿瘤血管中的表达高度升高。因此，通过靶向VEGF的替代信号通路，endoglin的沉默可能代表了抗血管生成治疗的一种新方法[42],[43]此外，TGB-β可以刺激血管平滑肌细胞中VEGF的合成，因此靶向内皮素也可能减少肿瘤中的VEGF，从而减少VEGF介导的血管生成[44]. The体内我们的研究结果表明，endoglin是一个合适的靶点，因为它的沉默产生了与Rac1沉默类似的抗肿瘤效果。此外，我们观察到治疗肿瘤中血管形成减少。

总之，我们的研究结果表明，内皮素靶向治疗是一种很有前景的抗血管生成治疗方法，可能是目前临床上使用的抗血管内皮生长因子治疗的替代方法，这种治疗方法具有一些不良副作用，如肾功能不全和颅内出血[45],[46]SiRNA分子显示出良好的抗血管生成潜力在体外具有显著的抗血管生成和抗肿瘤作用体内试验。由于siRNA分子的半衰期短体内，通过使用编码shRNA的质粒DNA或根据我们实验中使用的siRNA序列构建的miRNA分子，这一领域的进一步研究可能会继续。另一方面，使用化学修饰的LNA基寡核苷酸也可以提高siRNA分子的稳定性。

材料和方法

细胞系、肿瘤、动物

人类微血管内皮细胞系HMEC-1（佐治亚州亚特兰大市疾病控制与预防中心）在补充有10μg/l表皮生长因子（Gibco）、1 mg/l氢化可的松（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）、10%胎牛血清（Gibco-）、10 mM l-谷氨酰胺（Gibco/）、，在5%CO中50µg/ml庆大霉素（Krka，Novo mesto，斯洛文尼亚）和100 U/ml结晶菌素（Pliva d.d，萨格勒布，克罗地亚）237°C下的增湿培养箱。

小鼠内皮细胞系2H11（美国型培养物收集中心，弗吉尼亚州马纳萨斯）在37°C下，在添加有5%胎牛血清、10 mM L-谷氨酰胺、50µg/ml庆大霉素和100 U/ml甲状腺素的高级DMEM培养基（Gibco）中培养。

小鼠乳腺癌细胞TS/A[47]在添加有5%胎牛血清、10 mM L-谷氨酰胺、50µg/ml庆大霉素和100 U/ml结晶菌素的高级MEM培养基（Gibco）中培养237°C下的增湿培养箱。

实验中使用了从斯洛文尼亚卢布尔雅那大学医学院病理研究所购买的6-8周龄雌性BALB/c小鼠。将小鼠置于特定的无致病条件下，保持恒定的室温和湿度，并进行12小时的光/暗循环。提供了食物和水随意。实验前，动物经历了2周的适应期。

皮下肿瘤诱导用2×10的悬浮液6TS/A细胞，由细胞培养物制备在体外在0.1ml生理溶液中，注入小鼠右侧。当肿瘤最大直径达到3mm时（皮下注射细胞后4-5天内），动物被随机分为实验组，并接受特定的实验方案。

道德声明

动物研究是根据欧盟指令的动物实验指南和斯洛文尼亚共和国农业和环境部兽医管理局的许可（许可号：34401–12/2009/6）进行的。所有的努力都是为了减少痛苦。

siRNA分子

根据Invitrogen的程序»BLOCK-iT，选择了三个针对人或鼠内切蛋白编码序列不同部分的siRNA双链TM（TM）RNAi设计者»（加利福尼亚州卡尔斯巴德市英维特罗根）(表3).

缩略图
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表3。研究中使用的siRNA双工序列。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0058723.t003

制造商保证，阴性对照siRNA双链是以与任何已知脊椎动物转录本都没有同源性的方式设计的。siRNA双链作为退火、纯化的双链获得，并在无菌的二乙基焦碳酸酯（DEPC）处理的H中稀释2O至20µM的浓度。

转染

体外脂肪感染。

将细胞胰酶化并从单层细胞中收获到无抗生素培养基中的细胞悬浮液中。电池（1.4×106)在1.5 ml特定培养基中，在24孔超低连接板（Corning Inc.，Corning，NY）上进行电镀。siRNA双链体和Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen）的复合物制备如下：将5µl 20µM siRNA稀释在500µl Opti-MEM I培养基（Gibco）中，其中添加5µl Lipofeectamine RNAiMAX。将该混合物培养15分钟后，将配合物添加到每个孔中。细胞在37°C和5%CO中培养2将培养箱加湿5 h，然后将其置于直径10 cm的培养皿上进行进一步分析：qRT-PCR、免疫荧光染色、流式细胞术、增殖试验和试管形成试验。

体内电转染。

体内连续一天进行一次或三次电转染。用40µl m_siRNA 869瘤内注射治疗肿瘤，然后立即施加电脉冲（8个振幅240 V的方波脉冲（振幅与距离之比600 V/cm），频率1 Hz持续5 ms）（m_siRNA869+EP组）。电脉冲由电脉冲发生器GT-01（斯洛文尼亚卢布尔雅那大学电气工程学院）产生，并通过两个平行不锈钢电极传递，电极之间的距离为4mm。由于瘤内注射m_siRNA 869的量相对较大，溶液也从肿瘤中逸出。因此，包裹在电极之间的肿瘤周围组织也被m_siRNAs电转染，包括血管周围的肿瘤，其中内皮素的表达升高[5]–[7]相关对照组为：瘤内注射H2单用O（对照组）或联合应用电脉冲（EP组）、瘤内注射m_siRNA 869（m_siRNA 869组）、肿瘤内注射阴性对照siRNA（siRNA-Ctrl组）和电转移siRNA Ctrl（m_si RNA-Ctrl+EP组）。

RNA提取和qRT-PCR分析

RNA提取和qRT-PCR分析用于测定转染2天后内切蛋白的表达水平和内切蛋白在mRNA水平的沉默程度在体外和体内。对于在体外实验中，细胞被胰蛋白酶化，从单层细胞中提取到细胞悬浮液中，然后离心。然后从细胞中提取总RNA。对于体内实验中，处死小鼠，每组切除2-9个肿瘤，并在液氮中冷冻。冷冻肿瘤在研钵中用杵匀浆，然后从样品中提取总RNA。

根据制造商的说明，使用TRIzol Plus RNA纯化系统（Invitrogen）提取总RNA。在260 nm处用分光光度计定量RNA浓度（Epoch、Biotek、Winooski、VT）。通过测量A处的吸光度比来确定RNA的纯度260纳米/280纳米和A260纳米/230纳米使用SuperScript VILO将1µg总RNA逆转录为cDNATM（TM）cDNA合成试剂盒（Invitrogen），根据制造商的说明。逆转录后，使用10倍稀释和100倍稀释混合物作为qRT-PCR的模板，使用TaqMan基因表达主混合物（Applied Biosystems，Carlsbad，CA）和TaqMan-基因表达测定（Applied-Biosystes）。Taqman基因表达测定包含一对引物和Taqman探针，用于扩增人内皮素cDNA片段（Hs00923996_m1）或鼠内皮素cNA片段（Mm00468256_m2）。作为内部对照，使用TaqMan探针扩增人类RNA聚合酶II cDNA（Hs00172187_m1）或小鼠18S核糖体RNA（Mm03928990_g1）。在7300系统（Applied Biosystems）上进行qRT-PCR，如下所示：尿嘧啶-DNA糖基化酶的激活（50℃下2分钟），AmpliTaq金酶的热启动激活（95℃下10分钟），45个变性周期（95℃时15秒），退火和延伸（60℃下1分钟）。使用7300 System SDS软件（Applied Biosystems）分析qRT-PCR产物。endoglin在不同内皮细胞和肿瘤细胞系以及TS/A肿瘤中的表达水平表示为阈值周期值。治疗后内皮素mRNA水平根据参考基因进行标准化。

免疫荧光染色

转染两天后，用免疫荧光染色法测定内皮素在蛋白水平的沉默程度。细胞胰蛋白酶化，5×104将细胞接种在含有10%胎牛血清和抗生素的适当培养基中的Lab-Tek培养箱载玻片系统（美国伊利诺伊州纳贝维尔Nalge Nunc International）上。将附着的细胞固定在4%多聚甲醛（电子显微镜科学，哈特菲尔德，PA）中15分钟。然后用0.5%吐温20（西格玛）使固定细胞渗透10分钟。用10%驴血清（西格马）阻断非特异性结合。然后，将细胞与一级抗体在4°C下孵育过夜。对于HMEC-1细胞，使用鼠抗内皮素单克隆抗体（P3D1:sc-18838，稀释1∶50，Santa Cruz Biotechnology Inc.，Santa Cruz，CA）。与一级抗体孵育后，将细胞与荧光素结合的驴抗鼠二级抗体培养1小时（1∶100，Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.，West Grove，PA）。对于2H11细胞，使用羊抗内皮素多克隆抗体（AF1320，稀释1∶12.5，R&D Systems Inc.，明尼阿波利斯，MN）。与初级抗体孵育后，将细胞与荧光素结合的驴抗羊二级抗体孵养1小时（1∶100，Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.）。在每一步之间，用磷酸盐缓冲盐水清洗细胞3次。与二级抗体孵育后，用Prolong Gold Antifade试剂（Invitrogen）安装载玻片。图像是由连接到BX-51显微镜（奥林巴斯）的DP72 CCD相机（德国汉堡奥林巴斯市）拍摄的。在对照细胞上确定曝光时间和采集设置，并在整个采集过程中保持不变。

流式细胞术

为了在蛋白水平定量内切蛋白的沉默，进行了流式细胞术分析。转染后2天，对细胞进行胰蛋白酶处理，并进行1×106将细胞重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水中。将细胞固定在4%多聚甲醛中15分钟，并用0.5%吐温20渗透10分钟。然后用初级荧光素结合小鼠单克隆抗体（P3D1 FITC:sc-18838，1∶50，Santa Cruz Biotechnology，Inc.）在4°C下培养HMEC-1细胞过夜。第二天，取出一级抗体溶液，将细胞重新悬浮在300µl磷酸盐缓冲盐水中。小鼠2H11细胞经渗透后，首先与原代山羊抗鼠多克隆抗体（1∶50）在4°C下孵育过夜。第二天，细胞与荧光素结合的驴抗羊二级抗体孵育1h（1∶100）。在每一步之间，用磷酸盐缓冲盐水清洗细胞3次。使用FACSCanto II流式细胞仪（BD Biosciences，San Jose，CA）对每个样本至少20000个细胞进行测量。分别使用488 nm激光器（风冷，20 mW固态）和530/30 nm带通滤波器激发和检测FITC荧光。首先，根据正向和侧向散射定义的双参数对数图确定细胞群体门，以消除碎片。其次，记录门控细胞相对于其荧光强度的直方图。测定每个实验组门控细胞的平均荧光强度（软件：BD FACSDiva V6.1.2）。

增殖试验

转染后1.5×10三HMEC-1，3×1022H11电池或2×102将TS/A细胞置于含有10%胎牛血清和抗生素的96个平板（Corning）上的0.1 ml特殊培养基中进行增殖试验。细胞在37°C的5%CO中孵育2加湿培养箱。每隔一天用普雷斯托蓝试验（Invitrogen）测定细胞活力。向每个孔中添加10µl普雷斯托蓝试剂，并在37°C和5%CO中培养1.5小时后测量孔中的荧光强度2带微孔板阅读器的增湿培养箱（瑞士梅内多夫帝肯Infinite 200）。

试管形成分析

为了确定内皮素沉默对内皮细胞管形成的影响，将细胞在37°C的5%CO中培养2转染后不同时间段加湿培养箱。转染后第1、2和3天，1.5×104HMEC-1细胞被镀在覆盖有BD Matrigel的96-well板（Corning）上TM（TM）基底膜基质生长因子降低，无酚红（BD Biosciences）并培养6小时，直到形成管状复合物。将管状复合物固定并用结晶紫染料（Sigma）染色。为了评估2H11细胞的试管形成，使用了一种改进的试管形成评估系统[48].电池（1.6×104)在转染µ-Slide Angiogenesis（Ibidi，Munich，Germany）后两天，用BD Matrigel覆盖TM（TM）基底膜基质，无酚红（BD Biosciences），培养2小时直到形成管状复合物。管状复合体用钙黄绿素AM（Sigma）染色。图像是用连接到IX-70倒置显微镜（奥林巴斯）的DP72 CCD相机（奥林匹斯）拍摄的。AxioVision程序（德国耶拿卡尔蔡司显微镜有限公司）用于将原始图像转换为二进制掩模，并使用AngioQuant图像分析程序进行量化[49]对管状复合体的总长度、管状复体的总尺寸和接头的总数量进行了量化。

肿瘤生长

通过在治疗后每天使用数字游标卡尺测量肿瘤大小来评估m_siRNA 869分子对小鼠内皮素的电转移治疗潜力。根据椭球体公式计算肿瘤体积：V=a×b×c×π/6，其中a、b和c代表垂直肿瘤直径。根据肿瘤生长曲线，确定肿瘤的三倍增长时间（治疗开始时肿瘤体积三倍增长的时间）。小鼠的体重作为全身毒性的一般指标。每组由6只小鼠组成。

组织学

每个实验组在治疗后第2天处死2或3只小鼠，并切除肿瘤。肿瘤用IHC锌固定剂（BD Pharmingen，BD Biosciences）固定，石蜡包埋。从每个石蜡块上切下三个连续的5μm厚的切片。第一部分用苏木精和伊红染色，第二和第三部分用免疫组织化学染色。免疫组织化学染色切片用抗小鼠CD31的兔多克隆抗体（ab28364，Abcam，Cambridge，MA）以1∶100或Ki-67（克隆SP6，Thermo Fisher Scientific，Cambrick1，MA）稀释1∶150孵育。使用过氧化物酶偶联的链亲和素-生物素系统（兔特异性HRP/DAB检测IHC试剂盒，ab64261，Abcam）作为致色试剂，然后进行苏木精复染。在光学显微镜下观察免疫组织化学染色载玻片，并用连接到BX-51显微镜（Olympus）的DP72 CCD相机（Olymbus）从每张载玻片中随机选取6个活肿瘤组织区域拍摄图像。在采集的图像上，测定了直径小于30µm的Ki-67阳性细胞和CD31阳性血管的数量。

统计分析

所有数据均采用Shapiro-Wilk检验进行正态分布检验。实验组之间的差异通过单向方差分析（单向ANOVA）进行统计评估，然后通过Holm-Sidak检验进行多重比较。小于0.05的P值被认为具有统计学意义。SigmaPlot软件（Systat软件，伊利诺伊州芝加哥）用于统计分析和图形表示。

支持信息

表S1。

抗内皮素siRNA三重电转移治疗TS/A肿瘤的跳闸时间。在用m_siRNA 869重复治疗肿瘤后，在肿瘤倍增时间水平上观察到具有统计学意义的肿瘤生长延迟（与图4).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0058723.s001

（文件）

致谢

我们要感谢Mira Lavric（斯洛文尼亚卢布尔雅那肿瘤研究所）在实验方面提供的所有宝贵帮助，以及Frenk Valjavec（斯洛文那卢布尔雅那化学与化学技术学院卢布尔亚那大学）在试管形成分析方面的帮助。

作者贡献

构思并设计了实验：TD BM GS SK MC。进行了实验：TD BM AC MS JL AB。分析了数据：TD AC JL AB-BM。撰写论文：TD MC。

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