摘要
广泛用于绘制传入激活的大脑区域体内，无标记的内在光信号（IOS）主要归因于神经胶质谷氨酸摄取后的血容量变化。相比之下，IOS映像在体外通常归因于神经元和胶质细胞肿胀，但不同细胞类型和分子参与者的相对贡献仍不清楚。我们使用464元件光电二极管阵列设备对大鼠海马切片中的IOS至Schaffer侧支刺激进行了表征，该设备能够以0.6 ms的时间分辨率进行IOS监测，并同时进行场电位记录。我们通过在50 ms（20 Hz）内施加中等强度的50 V模拟序列来使用短暂的半最大刺激。IOS主要在金字塔街以及放射状街道海马体。它通过阻断电压门控钠的河豚毒素而消除+γ-氨基丁酸（A）受体拮抗剂苦毒毒素通过抑制抑制信号而显著增强。我们发现IOS主要由突触后Glu受体激活启动，并通过星形胶质细胞Glu转运体和Mg的激活而进展2+-独立的星形胶质细胞N-甲基-D-天冬氨酸受体。在控制条件下，神经元K的作用+/氯−共同转运蛋白KCC2，但不适用于胶质细胞钠+/K（K）+/氯−观察到共转运蛋白NKCC1。通过非特异性氯离子轻微增强和抑制IOS−并分别描述了容积调节阴离子通道。脑片短暂传入刺激诱发的高频IOS成像为研究IOS发生机制提供了新的范式。主要参与者以这种方式透露，时空IOS反映了谷胱甘肽能量的海马内观察到的神经元激活和星形胶质细胞反应。我们的模型可能有助于更好地解释体内IOS和支持未来的诊断。
引用：Pál I，Nyitrai G，Kardos J，Héja l（2013）神经元和星形胶质细胞与大鼠海马切片中潜在的时空内在光信号相关。公共科学图书馆综合8（3）：e57694。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057694
编辑：弗里德曼·保罗，德国柏林慈善大学医学院
收到：2012年7月12日；认可的：2013年1月28日；出版：2013年3月1日
版权：©2013 Pál等人。这是一篇根据知识共享署名许可证条款分发的开放存取文章，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原创作者和来源已获得认可。
基金：这项工作得到了ERA-Chemistry OTKA 102166赠款的支持(http://www.otka.hu/)和TECH-09-AI-2009-0117 NKFP NANOSEN9(http://www.nih.gov.hu/). 资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。
竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。
介绍
无标记的内在光信号（IOS）反映了神经细胞的真正兴奋性[1]，[2]基本上可以以蜂窝分辨率检测到体内和在体外 [3]，[4]，[5]，[6]，[7]IOS广泛用于神经外科术中患者时空神经活动的无创成像[8]，[9]，[10]矛盾的是，尽管IOS成像技术具有诊断能力，但仍缺乏对传入诱发时空IOS产生的分子和细胞过程的详细了解[11]，邀请研究突触活动与IOS信号之间的关系。
据推测，离体脑片中的体外IOS几乎完全是由光吸收和光散射的变化引起的[1]，[2]光吸收变化主要归因于线粒体卟啉和残留血红蛋白等固有细胞色素[12]兴奋毒性相关的光散射变化与树枝状珠粒有关[13]而与抑郁症相关的IOS的传播归因于线粒体结构或代谢活动的改变[1]，[2]，[14]，[15].活动依赖性细胞肿胀导致光散射的局部变化[1]，[16]细胞外体积的改变[17]，[18]被视为渗透压诱导和传入刺激诱发IOS的主要成分[1]，[19].
为了更好地理解机制线索，研究了传入诱发IOS的产生在体外在各种脑片制剂中[1]，[20]，[21]，[22]输入刺激诱发的IOS被认为依赖于海马的突触后活动[7]和新皮质切片[20]，[23]在新皮质切片中，IOS被发现比突触后活动更敏感地反映神经元兴奋性激活[20]，[24]然而，关于兴奋性神经递质受体作用的详细分子解剖仍然缺失。
认为传入诱发的IOS是由神经元活动引起的细胞肿胀引起的，这是基于发现IOS强烈依赖细胞外[Cl]−][7]，[18]，阐述阴离子通道和转运体的作用。胶质细胞摄取谷氨酸在细胞肿胀中的作用也已被证明[25]，[26]据报道，星形胶质细胞产生气味体内IOS通过调节脑血流，而感觉器官刺激诱发的神经活动也通过胶质细胞摄取谷氨酸与星形胶质细胞耦合[27]这些发现最终表明，可能是胶质细胞摄取谷氨酸将神经元活动与IOS耦合。
为了更好地了解IOS生成的分子和细胞过程，我们在海马脑片中应用了短时Schaffer侧支刺激诱发IOS的快速成像，并同时进行局部场电位记录。许多可能影响IOS生成的目标（电压门控Na+通道、γ-氨基丁酸A受体、神经元和星形胶质细胞Glu受体、主要星形胶质细胞谷氨酸转运体、神经元K+/氯−共同运输者KCC2，Na+/K+/氯−共转运体NKCC1，非特异性Cl−用其抑制剂河豚毒素、苦毒毒素、6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮（CNQX）和/或DL-2-氨基-5-磷酸（APV）、二氢喹啉酸（DHK）、速尿、布美他定、4,4′-二异硫氰基二苯乙烯-2,2′-二磺酸DIDS、，分别为4-（2-丁基-6,7-二氯-2-环戊基-1-on-5-基）氧丁酸（DCPIB）。
材料和方法
道德声明
动物的饲养和使用符合1986年11月24日欧洲理事会指令（86/609/EEC）和1998年匈牙利动物法。所有涉及动物的实验均得到匈牙利科学院自然科学研究中心动物测试委员会的批准，以及匈牙利农业和农村发展部的批准。所有的努力都是为了减少动物的痛苦和使用动物的数量。
化学制品
Picrotoxin、DIDS、DCPIB和速尿购自Sigma-Aldrich Co.（美国密苏里州圣路易斯）。河豚毒素（TTX）、DHK和布美他尼购自Tocris Bioscience（英国布里斯托尔）。CNQX和APV购自Abcam生化公司（英国剑桥）。
脑组织切片
如其他地方所述，用来自雄性Wistar大鼠（匈牙利布达佩斯Toxicoop）的振动体（Leica VT1000S，Leica Microsystems，Wetzlar，德国）切割横向400µm厚的海马-内嗅皮层切片[28]P11–20只动物用于同步场电位和单细胞记录，P21–50只动物用于同时场电位和IOS记录。将切片放在浸没式记录室中，用碳饱和人工脑脊液（ACSF，mM:129 NaCl，10葡萄糖，3 KCl，1.25 NaH）灌注2警察4，1.8硫酸镁4，2氯化钙2，21 NaHCO三pH 7.4，36°C）。
电刺激
刺激电极放置在Schaffer侧支循环的轨迹中放射状街道从CA1锥体层记录CA3区和场反应。当使用两个记录电极时，第二个电极放置在CA1中放射状街道在本文中，这些测量值被称为两个记录电极测量值。
通过双极钨电极（直径75µm，生命科学微探针）传输0.2 ms的单方波脉冲。设置刺激强度以激发一半最大场反应（40–50 V）。刺激序列（10个刺激/20 Hz）或单脉冲分别用于IOS和单细胞测量。每次刺激之前都有200毫秒长的延迟期用于基线计算。每10分钟和5分钟进行三次试验，分别用于IOS和单细胞测量。
场电位和单细胞记录
细胞外（2-5 MΩ）和细胞连接（5-9 MΩ）电极填充ACSF。对于细胞连接记录，保持电位设置为0 mV。为了进行全细胞电流记录，用细胞内溶液（mM:135 KGlu，10 NaCl，0.05 CaCl）填充3-5 MΩ移液管2，2腺苷-5′-三磷酸（ATP；Mg2+盐），10-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），3-乙二醇双（2-氨基乙醚）-N，N，N′，N′-四乙酸（EGTA）；pH设置为7.3[29]。将贴片电极的尖端置于细胞外电极的100µm范围内。在同时进行场电位和单细胞记录的情况下，每5分钟进行三次试验，以尽量减少对修补细胞的损害。使用双通道多灯700A放大器进行记录（Axon Instruments，Foster City，CA，USA）。痕迹在2 kHz下进行低通滤波，并在10 kHz下通过Digidata 1320A a/D板（Axon Instruments，Foster City，CA）进行数字化，该板由运行pClamp8的计算机控制（Axon Instruments，Foster City，CA，USA）。
光学记录
用卤素灯光源（最大强度：100 W）通过带通滤波器（700±40 nm，Chroma Technology，Rockingham，VT）照亮切片。透射光通过Wutech H-469IV光电二极管阵列收集，该阵列是Redshirt Imaging集成Neuroplex II成像系统的一部分，安装在Olympus BX51WI显微镜的前端口上（1.6 kHz采样频率，500倍放大，0.5 Hz高通滤波[30]). 每个二极管对应大约70×70µm的平方面积。使用Neuroplex软件采集并显示数据。每10分钟进行三次试验。
药物应用
至少记录了两次对照试验后，将药物过量（3-4 ml/min）15分钟。为了评估药物疗效，在用药5分钟和15分钟后进行了两次试验。如果药物在两个采样点的效果没有显著差异，则使用这两个点的平均值进行进一步评估。使用5µM TTX来确保阻断所有钠通道介导的电流[31].
升高[K+]诱发IOS
升高[K+]缓冲液由ACSF中47 mM NaCl的替代物制成，以获得最终的[K+]50 mM ACSF，带[K+] = 通过贴片吸管（5–10µm直径）将50 mM压力注入切片表面10秒。移液管放置在切片表面上方100µm处，以避免压力引起的伪影。作为对照，在同一位置以相同的方式给药正常ACSF。升高[K+]在CA1中使用泡芙oriens街和放射状街道在10秒长的控制期后持续10秒。使用与传入刺激诱发的IOS相同的照明和调节来监测IOS 1分钟。
初级数据处理和数据分析
为了评估电生理信号，测量每个场反应的场兴奋性突触后电位（fEPSP）斜率。对于在金字塔层中测量的场响应，还计算了种群尖峰（PS）的振幅。根据Anderson等人计算了现场响应参数。[32]群体尖峰振幅被测量为从PS开始到与在PS开始和PS偏移之间绘制的切线相交的振幅。
由于我们使用了10个刺激来激发IOS，因此计算了10个反应的fEPSP斜率或PS振幅的总和，并与IOS参数进行了比较。
通过测量单电极测量中刺激伪影的群体峰延迟或双电极测量中两个记录电极的PS峰之间的延迟来估计神经元激活的传播速度。两种计算方法的估计值没有差异，因此取平均值。
在IOS测量中，对三次试验进行了平均，以降低噪声。如果信噪比超过5，则接受IOS信号。计算IOS曲线的五个参数：振幅（从最大值中减去刺激之前记录的基线的平均值）、最大值的位置、信号长度（从信号开始计算到信号感觉到振幅的5%）、10-90斜率和90-10衰减。还确定了信号/噪声>5的二极管数量。整个切片的综合响应以所有二极管上同时测量的IOS振幅之和为特征（称为IOS总和。ampl.）。此外，IOS曲线形状由所有二极管斜率或衰减之和除以信号/噪声>5的二极管数量计算的平均斜率和衰减参数表示（分别称为IOS斜率和IOS衰减）。还计算了唯一CA1和CA3的所有IOS参数的总和(图S1)但是，除DHK外，与整个切片的总和相比，药物的效果没有显著差异。因此，将场电位参数与整个切片的IOS参数之和进行比较，以提高IOS测量的信噪比。CA1和CA3中DHK效应的差异是由于在这些测量中，CA3中的金字塔层并不总是在视野中。
为了可视化药物应用引起的变化的空间模式，计算了差异图像。对于每个二极管，计算用药期间和用药之前的IOS差异（称为ΔT/Tc，其中ΔT是透射率差异，Tc是对照试验的平均值），并用色条的适当颜色表示。
通过将两个二极管之间的距离除以两个IOS信号一阶导数峰值之间的延迟来估计IOS的扩展速度。
Mann-Whitney U检验用于统计学检验，P＜0.05被认为是显著的，数据以平均值±SEM报告。数据处理、分析和图形表示使用pClamp9（Axon Instruments）、Origin 8.0（Origin Lab）软件和MATLAB 6.5（MathWorks，Nattick，MA）环境中的自定义脚本进行。
结果
大鼠海马切片中传入刺激诱发的IOS
对于IOS测量，我们使用464元件光电二极管阵列（PDA）探测器，而不是常用的电荷耦合器件（CCD）相机。PDA探测器能够以0.6毫秒的时间分辨率进行IOS检测，从而可以将光信号与同时测量的电生理记录对齐。为了量化所用抑制剂的效果，我们计算了每个IOS曲线的六个不同参数：振幅、最大值位置、长度、10-90斜率、90-10衰减和显示显著IOS活性的二极管数量(图1A、B). 将电生理记录部位附近IOS信号的振幅以及覆盖整个海马的所有二极管上测得的总和振幅与电生理信号参数进行比较，即群体峰（PS）的振幅和场兴奋性突触后电位（fEPSP）的斜率群体峰的振幅测量邻近神经元的同步放电[33]fEPSP斜率测量锥体细胞突触激活产生的电流[34].
通过对Schaffer侧支施加短暂刺激诱发海马IOS。通过改变刺激次数来优化刺激方案，以找到产生可测量IOS的最低刺激强度。一次或两次刺激足以产生可检测的IOS，尽管信噪比较低（1.5）。需要在450 ms内以20 Hz的刺激频率进行十次刺激，以检测可靠的IOS(图1A). 因此，我们的方案应用的刺激比先前研究中使用的刺激方案至少少四倍，短八倍[7]，[35]在锥体层记录电极附近测得的IOS振幅与刺激数、PS振幅和fEPSP斜率（R = 0.98和R = 分别为0.99），表明在体外明显的IOS存在于神经元活动中。值得注意的是，坡度（R = 0.99）和衰减（R = 0.97）的IOS也随着刺激数的变化而变化(图1A). 在控制条件下，在记录电极附近测量的IOS从刺激开始时开始，在2.5±0.03 s内达到最大值，并在接下来的3.5 s内回到基线(图1A). 由于短暂的刺激方案，IOS达到峰值的时间至少提前了两倍，下降速度是之前研究的七倍[7]，[35].
偶尔，我们观察到小幅度IOS信号在放射状街道和腔隙分子这些信号对TTX的不敏感性表明，它们是由电压门控钙通道激活引起的中等大小血管收缩引起的[36]在刺激电极附近。血管相关信号可通过其早期最大值（<1.5秒）、短持续时间（<2秒）、低斜率和衰减来区分(图1B右），并在发生时从本地IOS中减去。
IOS在近端最突出放射状街道和金字塔街海马，显示CA1区振幅最高的信号，对应于受刺激Schaffer侧支的神经支配区(图1B). 在锥体层的CA3区也检测到IOS，很可能是由于CA3到CA3结合投射的激活和/或苔藓纤维的激活。IOS振幅沿CA1逐渐下降放射状街道（23.9±1.8%/100µm）。由于大多数神经胶质细胞位于放射状街道，中的高IOS振幅金字塔街在我们的实验中，明显与先前提出的主要胶质起源相冲突[7]并表明神经元活动也有助于IOS。
为了将IOS振幅与放射状结构和金字塔街在海马CA1区的各层，我们用两个记录电极同时测量了场反应。其中一个细胞外记录电极被放置在靠近刺激电极的CA1锥体层中作为参考，而另一个电极被放置i）在距刺激电极至少300µm的锥体层中，或ii）在近端和远端放射状街道(图1B右侧）。发现IOS和场响应的形状和振幅随距离金字塔层的距离而变化(图1B右侧）。
首先，在不同位置的记录电极上测量fEPSP斜率(金字塔街、远端和近端放射状街道，图1B)与记录电极附近测得的IOS振幅进行比较。由于PS在所有测量位置都不可见，因此将fEPSP斜率的绝对值与IOS振幅进行了比较。IOS信号的空间模式与fEPSP斜率的绝对值并不精确相关。缺乏相关性是由于IOS振幅高和fEPSP斜率值低，特别是在远端放射状街道这表明该区域的胶质细胞可能对IOS的贡献大于对fEPSP斜率的贡献。在金字塔层中，IOS振幅和fEPSP斜率呈线性相关（R = 0.86），表明在锥体层中神经元对IOS的贡献与其对fEPSP斜率的贡献一致。类似地，锥体层中相关性的存在表明神经元对IOS信号和fEPSP斜率都有贡献。
IOS的空间模式表明，CA3区也可能通过刺激的轴突反向传播被激活。CA3锥体细胞的激活可以通过海马-内嗅环反射到CA1[37]这也有助于在CA1中测量IOS信号。为了阐明CA3网络活动对CA1区IOS时间进程和空间分布的贡献，比较了刺激电极与CA3切割前后CA1区的IOS信号。物理解耦后，CA3和CA1活动IOS从CA3区域（N = 4,图1C). 然而，CA1内IOS的空间模式和时间进程保持不变，表明Schaffer侧支刺激诱发的神经元活动是CA1内的IOS的唯一来源。
所有二极管上的IOS振幅总和与PS振幅（R = 0.72). 在单个位置测量的PS振幅与切片的求和IOS振幅相关的事实表明，IOS信号和场响应都代表了切片的一般激励水平。
IOS生成的时间剖析
PDA设备的高频采样率允许我们暂时剖析IOS生成过程(图2，视频S1和视频S2）。刺激后，IOS首先出现在CA1中金字塔街在Schaffer的抵押品终点比在放射状街道和的其他部分金字塔街CA1和CA3。这一现象表明，神经元的激活先于IOS的生成，可能是因为IOS在锥体细胞体细胞区的检测极限比树突区快，或者神经元肿胀可能比胶质细胞肿胀更快。
在CA1中放射状街道，IOS最初出现在CA1锥体神经元上Schaffer侧支形成旁路突触的部位[38]然后它向两个方向传播：1）朝向刺激电极和2）朝向副室(图2，视频S1和视频S2）。IOS信号的估计传播速度为0.23±0.05µm/ms，比场电位信号的传播速度（240±12µm/s）慢两个数量级，但比ATP介导的星形胶质细胞钙的传播速度快一个数量级2+在小鼠神经皮层中测量的电刺激诱导的波（0.014±0.005µm/ms）[39].IOS在CA1中的传播现象放射状街道可以用相邻星形胶质细胞通过缝隙连接或胶质细胞间信号传导激活来解释[40]。与CA1相比，CA3中的IOS只向相邻的扩散放射状街道，但不是沿着金字塔结构.
CA3中IOS的出现很可能是由于CA3对CA3结合投射的逆行激活。需要注意的是，IOS很快出现在远端CA3放射状体中，很可能表明苔藓纤维的激活。
CA1和CA3的IOS动态也有显著差异(图2A中间和左侧）。在逆行刺激的CA3中，IOS在放射状街道始终小于金字塔层中的，而在正交激活的CA1 IOS记录道中放射状街道超过了金字塔街这些微妙的差异表明，高频IOS成像不仅可以监测兴奋的扩散模式，而且还可以区分由于不同突触排列引起的激活模式。
IOS是神经激活的结果
为了进一步表征IOS与场反应成分（fEPSP斜率和PS振幅）之间的关系，我们比较了不同药物应用期间场反应成分与IOS总振幅的变化。
在药理实验持续时间（50分钟）内测试IOS和场电位基线的稳定性。尽管所有计算参数（PS振幅101±1%控制的终点值，总IOS振幅102±2%控制，fEPSP斜率103±2%控制）有轻微的正趋势，但在实验期间未观察到显著变化。如果变化超过基线变化的两倍，则认为药物效果显著。
TTX（5µM）阻断电压门控钠通道完全消除了场响应（PS振幅和fEPSP斜率分别为对照的0±3和0±0%；N = 5） 和IOS（IOS总和ampl.：控制的0±1%，N = 5). IOS从所有细胞层完全消失(图3A)，表明组织中的被动电压传播不足以引起IOS，因此神经元激活对于IOS的产生是必要的。
应用GABA增强神经元活动A类受体拮抗剂苦曲霉毒素（100µM）增强了两种IOS（IOS总和ampl.：对照的141±12%，N = 5） 和场响应（PS振幅和fEPSP斜率分别为对照的468±46和204±39%；N = 5,图3B和C). 值得注意的是，IOS振幅的增加（对照组的41±12%）与fEPSP斜率的增加（控制组的104±39%）相比，PS振幅的增加更为相似（控制组为368±46%），这表明IOS比神经元放电更敏感地反映突触电流的变化。有趣的是，在锥体层和远端观察到IOS振幅的最显著变化放射状街道(图3B). 远端IOS变化放射状街道可能是由兴奋区的延伸引起的，而锥体层IOS增强与GABA的高表达水平相对应能量的锥体神经元胞体和顶树突上的突触[41]这些发现最终表明IOS直接依赖于神经活动。
神经元和星形胶质细胞谷氨酸受体激活对传入激活诱发IOS的贡献
CNQX（20µM）对2-氨基-3-（5-甲基-3-氧代-1,2-恶唑-4-基）丙酸（AMPA）/红藻氨酸受体的抑制使PS振幅降低（比对照组降低98±1%），fEPSP斜率降低（比控制组降低61±5%），比IOS总振幅降低（相比对照组降低51±6%，N = 6;图4A和D). CNQX引起的IOS下降在受刺激的Schaffer侧支支配的区域最为显著(图4A). 需要注意的是，CNQX显著降低了平均IOS曲线的斜率（减少了37±8%的控制），但没有影响衰减阶段，这意味着CNQX选择性地作用于IOS生成过程，并保持IOS终止过程不变。
随后添加NMDA受体拮抗剂APV（100µM）进一步降低了剩余的总IOS振幅（比对照组降低了25±6%，N = 5） 主要在CA1放射状街道远离刺激电极(图4B). APV也降低了fEPSP斜率（比对照组降低31±1%），但不影响PS振幅(图4D). IOS斜率（对照的79±5%）和衰减（对照的50±11%）都有所下降，但程度不同。这一发现表明，IOS的主要成分（77%）依赖于刺激Shaffer侧支后离子型Glu受体的激活。
自从除去镁2+阻断NMDA受体通常需要激活AMPA受体[42]，[43]，[44]神经胶质NMDA受体对镁的敏感性较弱2+块[42]，[43]，APV的额外抑制作用表明镁的大量参与2+-独立的神经胶质NMDA受体[42]，[43]然而，应用CNQX和APV不能完全阻断IOS（仍有23±6%的控制）。这种残余IOS可能与突触前谷氨酸释放引起的谷氨酸摄取有关，也可能是安德鲁和麦克维卡观察到的逆行神经刺激的结果[45].
星形胶质细胞谷氨酸摄取对海马切片传入激活IOS的贡献
为了进一步探索神经胶质Glu摄取在IOS生成中的作用，我们应用了DHK（300µM），这是神经胶质谷氨酸转运体EAAT2的特异性抑制剂。在用药的前5分钟，DHK增强了PS振幅（比对照组增加41±19%，N = 7,图4C和D)，但总IOS振幅降低（对照组的42±4%），尤其是在放射状街道(图4C). 有趣的是，它还降低了fEPSP斜率（比对照组降低了39±5%）。与苦毒毒素的作用类似，IOS更密切地跟踪fEPSP斜率的变化，而不是PS振幅的变化。PS振幅增加可由细胞外谷氨酸浓度升高[Glu]解释o（o） [46]，[47]这会导致射速增加[48]促进神经元对刺激的反应[44].
在接下来的10分钟内，所有信号都下降了（PS振幅、fEPSP斜率和summa IOS振幅分别比对照组下降了27±7%、58±3%和59±6% = 6). 导致电生理信号降低的成分可能是：i）神经元Glu受体脱敏[49]，[50]由于细胞外[Glu]增加o（o） [51];ii）电压激活钠通道的部分失活[52];iii）谷氨酸介导电流驱动力降低[53]和iv）神经元基线肿胀的长期变化[54]，[55]为了测试DHK对基线肿胀的影响，还计算了静息光强度（RLI）的变化。在这两个施用点上，只有微小的显著变化（施用DHK后5分钟，对照组的变化为7±2%，在接下来的10分钟内，对照组又增加了5±2%）。RLI变化表明基线细胞肿胀的作用，但与传入刺激诱发IOS变化的DHK敏感成分相比，它们相对较小，表明基线肿胀并不是DHK对IOS影响的唯一原因。总IOS振幅和fEPSP斜率下降几乎相同（分别为对照组的14±10%和19±3%）；因此，药物应用第二阶段的IOS下降可能仅仅是fEPSP斜率下降的结果。DHK在两个阶段都以相同的方式影响IOS的斜率和衰减，这表明这是振幅降低的结果。DHK的作用是可逆的，因为高达70%的场反应控制和IOS在15分钟冲洗后再生。因此我们可以排除兴奋毒性神经元死亡。
DHK与APV和CNQX同时应用并没有进一步降低IOS振幅和场响应参数（分别为对照IOS总和振幅、PS振幅和fEPSP斜率的24±1%、0±1%和7±1%，N = 5,图4D)，表明非谷胱甘肽的作用能量的IOS生成途径，如神经元活动相关的ATP释放介导的细胞肿胀[56].
K的贡献+/氯−共同转运人KCC2，但非Na+/K（K）+/氯−海马切片中传入刺激诱发IOS的共同转运蛋白NKCC1
KCC2运输氯离子−和K+细胞外的离子，对维持神经元胞内[Cl−][57]NKCC1主要在星形胶质细胞上表达并转运Na+，K+和Cl−离子进入细胞[42]两种转运蛋白活性之间的精确平衡是维持抑制性GABA的必要条件能量的成人中枢神经系统的信号传导[58]NKCC1被认为在刺激诱发的IOS中起决定性作用，因为使用速尿后IOS显著减少[7]，[19]在我们的实验中，速尿（5 mM）是二者都NKCC1和KCC2在用药的前5分钟将PS振幅增加了226±37%，而将fEPSP斜率降低了17±8%。神经元兴奋性增加可能是由于GABA受损A类受体介导的抑制功能[59]或减少的K+驱动力[60]与PS振幅相比，总IOS振幅降低（对照组降低37±9%，N = 8,图5A和C)，最突出的是放射状结构(图5A). 需要注意的是，IOS衰变受到的影响更为显著（控制组为33±8%），而斜率受到的影响（控制组14±7%），这表明速尿作用于IOS终止过程。
10分钟后，速尿降低了PS振幅（降低了对照组的57±5%）、fEPSP斜率（降低了控制组的56±5%）和总IOS振幅（降低73±3%，N = 8). 场电位参数降低的可能解释是氯通量的改变降低了囊泡谷氨酸的摄取[61]或刺激诱导的细胞外[K+]增加减少[62]剩余IOS信号（对照组的27±3%）与20µM CNQX和100µM APV抑制突触后激活后的IOS信号相似（对照组为23±6%）。这一发现与之前的研究一致，即速尿完全阻断了突触后激活依赖性IOS[7]，[45]15分钟后，大部分场反应和IOS恢复，因此可以排除神经元死亡。
先前的研究表明，速尿对IOS的作用是通过阻断NKCC1介导的，从而减少神经胶质肿胀[7]，[63]然而，NKCC1的特异性拮抗剂布美他尼（10µM）并不影响summa IOS振幅(图5C). 布美他尼治疗后PS振幅降低（对照组20±4%，N = 5） 可以用Cl的超极化位移来解释−通过抑制NKCC1然后增加GABA的疗效来逆转电位能量的抑制[64]由于NKCC1的特异性拮抗剂没有改变IOS，我们得出结论，NKCC1对大鼠海马脑片中短暂传入刺激诱发的IOS没有贡献。
非特异性Cl的活化−通道增强，但容积调节负离子通道（VRAC）的激活抑制传入刺激诱发的IOS
速尿对IOS的抑制表明氯可能起作用−IOS信号中的梯度。因此，我们探讨了Cl的参与−具有不同特征的通道。选择性VRAC阻断剂DCPIB（40µM）不影响fEPSP斜率和PS振幅，同时适度增加总IOS振幅（增加11±4%的对照，N = 7图5C). 因此，传入刺激协议诱发的细胞肿胀激活了VRAC。VRAC的抑制增强了IOS，因此其生理作用是抑制传入刺激诱发的IOS中的细胞肿胀。
相比之下，一般阴离子通道拮抗剂DIDS（200µM）降低了summa IOS振幅和fEPSP斜率，同时增加了PS振幅（分别比对照组提高42±4%、26±6%和127±32%，N = 5,图5B和C). DIDS并没有改变内部监督办公室的地区分布(图5B)，表明其目标在切片中分布均匀。DIDS降低了IOS的斜率和衰减，这意味着它不喜欢IOS的生成或终止过程。DIDS对IOS的影响表明，非特异性氯通道略微促进了刺激引起的细胞肿胀。
为了解释DIDS的场响应效应，我们应用了细胞附着和全细胞方法。在单元连接方法中[Cl−]在全细胞电流钳法中，修补后的细胞暴露于[Cl−]移液管溶液。尽管由于膜片钳技术的要求，这些实验是在较年轻（P11−20）的动物身上进行的，但野外记录参数没有差异，因此我们认为导致DIDS效应的过程在这些动物身上已经成熟。细胞连接（动作电流增加128±29%，对照组）和全细胞电流钳（动作电位增加160±67%，对照）测量结果的比较表明，DIDS引起的神经元活动增强与细胞内[Cl]无关−].
刺激类型对IOS空间格局和动态的影响
DCPIB的作用暗示了细胞肿胀在传入刺激诱发的IOS中的潜在作用。问题是，不同刺激引起的细胞肿胀相关IOS是否会导致类似的空间模式和动力学。检查IOS特征对刺激类型的依赖性，即升高的[K+]-诱发细胞肿胀[65]，[66]，[67]将相关IOS与传入刺激诱发的IOS进行比较。
IOS是由ACSF当地管理部门用[K+] = 从贴片吸管取50 mM。在同一位置以相同方式给药的正常ACSF不会引起IOS，因此可以排除压力引起的切片机械变化。由于钾离子升高除了引起细胞肿胀外，还使神经元去极化[68]，50 mM K+ACSF烟团用于CA1oriens街和在放射状街道探讨不同类型神经元去极化引起的空间IOS模式是否存在差异。IOS只能在吸管前测量(图6A)表明它仅代表细胞对升高的[K+]. 无论应用部位如何，IOS振幅的空间模式都是相同的，这表明IOS与钾诱导的细胞肿胀有关，而不是与神经元去极化有关，因为神经元去极化在锥体层诱导的IOS比在锥体细胞层诱导的更显著放射状街道.
传入激活和升高[K的时间进程+]-诱发的IOS信号明显不同(图6B). Schaffer附带刺激和升高的[K+]-诱发信号具有正振幅，在刺激开始后迅速上升。刺激终止后，两种信号都进一步增加，但升高的[K+]-诱发信号比传入刺激诱发的IOS下降更快。
升高[K的空间分布和动力学之间的差异+]-诱发和沙弗侧支刺激诱发的IOS提示信号产生的机制可能不同。
讨论
为了更好地理解与神经兴奋相关的IOS，我们开发了一种新的范式，包括短暂的传入刺激，结合快速464元件光电二极管阵列检测器检测IOS在高频下的时空进程。将新的实验范式应用于急性大鼠海马脑片。时空IOS和局部电生理场电位已被同时测量，并在必要时补充全细胞斑贴记录。
通过这一范式获得的主要发现总结如下：我)IOS首先出现在金字塔结构表明神经元激活先于IOS信号生成，ii（ii）)动作电位缺乏通过阻断电压门控钠+通道取消IOS生成，三)GABA抑制A类受体介导的抑制信号显著增加IOS，iv（四）)IOS通过激活离子型谷氨酸受体进化，v（v）)星形胶质细胞还通过星形胶质细胞EAAT2和Mg参与IOS的生成2+-独立的NMDA受体激活，不及物动词)神经元K活性+/氯−但不是胶质钠+/K（K）+/氯−协同转运蛋白有助于IOS的发育，将神经元活动与细胞肿胀联系起来，vii（七）)VRAC减弱，而非特异性Cl−通道激活时会增强IOS。海马切片中时空IOS生成过程的分子和细胞解剖如图所示图7.
体内IOS的小成分[69]，[70]，[71]但在隔离脑研究和体外IOS中，IOS几乎唯一的来源是光散射和光吸收的变化[7]，[16]，[17]，[18].基于IOS的照明波长依赖性[7]我们假设主要是在体外在700 nm处检测到传入诱发IOS。在该波长下进行测量的优点是，可以深入切片，并减少残留血红蛋白的吸收作用（通常在600−660 nm下进行测量[72]，[73]，[74])和固有的细胞色素如卟啉（最大吸收波长440nm[15]). 由于树突状串珠和线粒体结构的改变通常伴随着强烈的激活（即扩散性抑制、兴奋性毒性[2]，[13]，[14])我们认为短暂的传入激活诱发IOS的主要成分是细胞肿胀。这也得到了上一版本的支持在体外研究表明，传入诱发的IOS归因于细胞肿胀[7]，[17]，[18]因为它可以在很宽的波长范围内被检测到，在穿透深度更深的较长波长下效果更大[1]对速尿和细胞外[Cl减少敏感−]抑制细胞膨胀[7]，[17].
锥体层局部场电位成分与局部外观或空间扩散之间的强相关性表明，IOS反映了组织的兴奋性水平。TTX对IOS的100%消除以及GABA抑制抑制信号增加神经元活性时IOS的增强进一步支持了这一点A类受体拮抗剂picrotoxin。我们发现，IOS可以被DHK、速尿和DIDS抑制，而不依赖于动作电位的产生，这揭示了IOS的活性生成过程，包括Glu摄取、K+/氯−共转运和阴离子通道。根据之前的调查结果[20]，[75]DHK、速尿和苦毒毒素诱导的IOS变化与fEPSP斜率密切相关，这表明IOS变化敏感地反映了兴奋性谷氨酸的变化能量的突触电流。应用我们的在体外IOS范式中，约80%的IOS通过抑制离子型谷氨酸受体（AMPA/红藻氨酸和NMDA）而被消除。以前的大多数在体外研究得出结论，IOS是突触后激活的结果[20]，[24]，[76]因为IOS被氰尿酸或钙抑制2+-免费ACSF[7]，[20]，[24]，[45]根据这些发现，我们认为离子型谷氨酸受体抑制剂主要通过降低突触后神经元的活动来影响IOS。
先前描述海马脑片中传入诱发IOS的研究，没有披露任何关于IOS生成的颞叶剥离或由于这些实验中使用的成像设备较慢而导致信号扩散的信息[1]，[7]，[24]，[45]，[63].PDA能够以与电生理信号类似的时间分辨率进行IOS监测。利用这种高速采集设备，我们发现CA3和CA1的神经元激活先于IOS。令人惊讶的是，IOS首先出现在锥体层，然后在放射状街道在CA3和CA1区域。这种时间模式与以胶质起源为主的信号形成鲜明对比。外观模式表明，与神经胶质过程相关的IOS是神经元激活的结果。锥体层中苦毒毒素的IOS增加和锥体层IOS减少更为显著，进一步支持了这一观点放射状街道使用CNQX后。这也与神经活动被阻断时缺乏IOS相一致。
神经元活动诱导的IOS在CA1和CA3区域显示出完全不同的传播模式和动态，这可以用所接受的不同类型的刺激（突触接触与逆行刺激）来解释。IOS启动的顺向和逆向神经元激活可通过信号的空间和时间模式加以区分。有趣的是，我们观察到IOS在CA1放射状体内沿着放射状街道IOS的扩散速度比神经元激活的扩散速度慢一个数量级，比扩散介质相关的星形胶质细胞Ca的扩散速度快一个数量级别2+波浪。这可能意味着星形胶质细胞合胞体通过缝隙连接耦合在IOS增殖中的作用。
IOS的扩散模式和时间分辨率表明神经细胞激活导致胶质细胞激活。培养星形胶质细胞的研究[25]表明谷氨酸的应用可以引起星形胶质细胞肿胀，表明它们参与了谷氨酸能量的神经元激活依赖性IOS生成。星形胶质细胞在谷胱甘肽中起关键作用能量的神经传递，因为Glu主要由星形胶质细胞吸收[77]，[78]因此，星形胶质细胞Glu摄取是IOS的潜在贡献者。为了澄清这个问题，一种选择性不可逆星形胶质细胞谷氨酸摄取抑制剂阻断了突触前释放谷氨酸诱发的动作电位的清除。如预期[46]，[47]，升高的[Glu]o（o）神经元活动增加导致PS振幅增强，很可能是由于神经元放电频率增强所致[48]同时，阻断星形胶质细胞Glu摄取降低了总IOS振幅，表明Glu被星形胶质细胞EAAT2强烈摄取[79]也塑造了在体外明显的IOS。summa IOS振幅的降低可以通过阻断Glu摄取介导的星形细胞肿胀来解释[25]，[26]星形胶质细胞在塑造中的作用在体外观察到最显著的IOS下降到EAAT2封锁，这一事实进一步证实了表面IOS放射状街道海马区富含星形胶质细胞[80]，[81]值得注意的是，血容量的变化与体内IOS信号也归因于星形细胞摄取谷氨酸[27]提示星形胶质细胞在这两种信号中的作用。
此外，当AMPA/红藻氨酸受体被阻断时，NMDA拮抗的额外抑制作用可能表明星形胶质细胞对在体外通过Mg生成IOS2+-独立星形胶质细胞NMDA受体激活[42]，[43].
如上所述，约占在体外表面上的IOS不是由适当的离子型谷氨酸引起的能量的因为它不能被AMPA/红藻氨酸和NMDA受体拮抗剂阻断。为了解释剩余IOS成分，我们可以推测突触前谷氨酸释放引起的星形胶质细胞谷氨酸摄取过程[82]然而，在NMDA和AMPA/红藻氨酸受体拮抗剂存在的情况下同时阻断EAAT2转运体，使IOS保持不变，这意味着它不是由突触前终末Glu释放触发的。因此，剩余IOS的来源可能是通过Schaffer刺激激活其他通路。肿胀轴突非泡状释放ATP诱发的神经元活动依赖性星形胶质细胞IOS成分也可能是计算剩余IOS的候选因素[56]，[83]，[84].
输入刺激诱发IOS在体外可被速尿阻断并降低细胞外[Cl−][7]，[17]据推测，传入诱发的IOS主要表现为星形胶质细胞通过速尿敏感的NKCC1摄取KCl而肿胀[7]，[17]然而，速尿除了抑制星形胶质细胞NKCC1外，还抑制神经元KCC2[85]，[86]这些协同转运蛋白被发现参与了神经元活动的调节[85]，[86]它们的阻滞剂，如速尿和布美他尼，在癫痫模型中也被证明是抗惊厥的[62]，[87]在我们的研究中，速尿是KCC2和NKCC1的一种非特异性阻断剂，对场反应表现出双相效应。速尿首先可能通过改变GABA增加PS振幅A类介导Cl−电流反转电位EGABA公司 [88]，但fEPSP斜率降低。在第二阶段，所有现场响应参数均降低。这些发现可以用刺激引起的细胞外[K+][62]已知有助于速尿的抗惊厥作用[62]我们的发现与Gutschmidt等人的发现一致。[62]但与MacVicar和Hochmann的结果相冲突[7]世卫组织表示，速尿没有改变现场反应幅度。不同的用药时间可能会产生差异。
与电生理信号相反，速尿降低了两个相位的IOS振幅。令人惊讶的是，NKCC1特异性抑制剂布美他尼未影响IOS，排除了NKCC1在产生传入刺激诱发IOS中的主要作用在体外这意味着细胞外[K+]神经活动引起的兴奋可能有助于IOS的生成，特别是当考虑到K+星形胶质细胞的缓冲能力[62]此外，KCC2的直接作用，主要由神经元细胞表达[89]无法排除IOS。根据Gutschmidt等人的观点，值得一提。[62]速尿的抗癫痫作用也缺乏NKCC1的作用。此外，布美他尼对NKCC1的抑制降低了PS振幅，IOS保持不变，而速尿对NKCB1和KCC2的抑制均增加了PS振幅并降低了IOS。仅通过布美他尼（bumetanide）和通过KCC2（速尿）对NKCC1的抑制（NKCC1）的定性区别效果最终表明速尿的影响在于对KCC2的抑制。重要的是，抑制阳离子/Cl−协同转运蛋白将IOS与神经元活动解耦。
越来越多的证据表明，细胞通过细胞肿胀激活的VRAC调节其容积，VRAC可导致调节容积减少[90]，[91]已表明VRAC向外整流Cl−对水和牛磺酸等有机阴离子也具有渗透性[92]，[93]据报道，在电刺激诱发IOS后，VRAC介导的ATP释放[83]表明VRAC对刺激诱发的IOS有贡献。我们发现选择性VRAC阻断剂DCPIB不影响诱发电位，并适度增加IOS振幅。相反，一般阴离子通道拮抗剂DIDS降低IOS振幅，表明非特异性氯离子−通道促进细胞肿胀。与IOS不同，DIDS存在时，场反应振幅和神经元兴奋性增加。当细胞内[Cl−]在全细胞电流钳测量中用贴片吸管设置，表明Cl中神经元兴奋性增加−独立方式。我们对VRAC调节容积减少和非特异性Cl引起肿胀的影响的研究结果−通道显示神经元活动诱发的细胞肿胀对IOS的贡献。
我们已经展示了三个新参与者的重要性（EAAT2、非特定Cl−已知在传入诱发IOS生成中有助于细胞肿胀的通道（VRAC）。问题是，不同刺激引起的细胞肿胀相关IOS是否会导致类似的空间模式和动力学。我们比较了升高[K+]-诱发IOS到传入刺激诱发IOS。两个信号的透光率都有所增加，表明信号产生过程相似。细胞外[K升高+]能使神经元去极化[68]因此，可以通过增加神经元的激活来诱导IOS，但在我们的实验中升高了[K+]-诱发的IOS没有表现出任何神经元活动特异性的空间模式，它仅仅反映了钾梯度。升高的[K+]-诱发IOS和传入刺激诱发IOS显示出明显不同的时空模式。升高[K+]-诱发IOS仅在刺激终止后不久增加，而传入刺激诱发IOS在刺激停止后很久达到峰值。最显著的差异在于信号的衰减阶段。升高[K+]-诱发IOS比传入刺激诱发IOS衰减更快。信号动力学的差异意味着这两个过程可能有不同的机制。这两种信号都被认为代表细胞肿胀，但细胞肿胀的机制可能不同（即Glu摄取诱导或KCl摄取诱导）。
我们提出以下传入诱发IOS生成机制：首先，锥体层神经元被激活，导致其胞体肿胀，然后树突区胶质细胞肿胀。IOS首次出现在金字塔街以及通过TTX-和Glu受体激活信号的敏感性。胶质细胞活性相关的IOS是神经元激活的结果。神经元通过升高细胞外[K诱导胶质细胞IOS+]通过去极化、KCC2共转运体和谷氨酸释放（激活EAAT2和胶质细胞Mg）来浓缩2+-独立NMDA受体。Glu或KCl摄取引起的细胞肿胀激活了VRAC，VRAC负责信号的衰减阶段。参与IOS生成的成分以及正反方向激活区域的空间和时间IOS模式之间的差异意味着IOS反映了神经元和胶质细胞之间的密切沟通。通过高频成像进一步研究传入诱发IOS的成分，并进一步揭示IOS的详细机制，可以使我们更深入地了解神经元组织功能的时空机制。
结论
一个新的在体外该方法旨在更好地理解传入诱发IOS发生的细胞和分子机制。通过应用体内模拟Schaffer侧支的传入刺激，结合海马脑片的高频IOS成像，发现IOS直接依赖于神经元活动，如抑制主要参与者，如电压门控钠+频道，GABAA类或突触后AMPA和NMDA受体。星形胶质细胞EAAT2，阳离子/Cl−协同转运蛋白和非特异性氯离子−通道还将IOS与神经元活动联系起来，将短暂的电活动转化为更持久和强健的电活动光渗透的信号。VRAC对IOS的贡献很小，这可能与此相关。如本文所示，IOS是一种复杂信号，代表复杂的神经-星形胶质细胞信号。因此，我们认为IOS比单纯的电活动更能真实地体现大脑的功能失调。需要进一步研究，以直接比较在体外和体内IOS将扩大我们对体内IOS机制和更好的未来辅助诊断。
致谢
作者感谢Erzsébet Fekete提供的出色技术援助。
作者贡献
构思并设计了实验：IP LH JK GN。执行实验：IP。分析数据：IP。撰写论文：IP LH JK GN。
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