广告

  • 加载指标

开放式访问

同行评审

方法和资源

方法和资源报告了新方法、对当前方法的实质性改进或信息数据集。

参见期刊信息»

利用扩展的自噬报告试剂盒进行CRISPR筛查，发现TMEM41B是一种新型自噬因子

摘要

酵母正向遗传学的力量是自噬研究领域的坚实基础。对高等真核生物自噬的补充研究揭示了这一过程的深层保存，以及在发育、免疫和神经元稳态的背景下调控自噬过程的新机制。最近出现了基于新簇状规则间隔回文重复序列/CRISPR-associated protein 9（CRISPR/Cas9）的技术，该技术开始通过哺乳动物细胞的正向遗传筛选，帮助定义新的自噬因子和途径。在这里，我们着手开发一个适用于CRISPR/Cas9筛查的自噬报告员扩展工具包。我们在哺乳动物细胞中对报告者进行的全基因组筛查几乎恢复了所有已知的自噬相关（ATG）因子以及以前未标记的因子，包括空泡蛋白分选37同源物A（VPS37A）、跨膜蛋白251（TMEM251）、肌萎缩侧索硬化2（ALS2）和TMEM41B。为了验证这个数据集，我们使用定量显微镜和生化分析显示吞噬细胞成熟需要1个新的hit，TMEM41B。TMEM41B是一种完整的内质网（ER）膜蛋白，与已建立的自噬因子空泡膜蛋白1（VMP1）有着远亲关系，我们的数据表明，这两个因子在自噬体生物发生中发挥着相关但不完全重叠的作用。总之，我们的工作揭示了新的ATG因子，揭示了自噬受体遗传相互作用的可塑性网络，并提供了宝贵的资源(http://crispr.deniclab.com)用于进一步挖掘新的自噬机制。

作者摘要

真核细胞利用自噬来消除蛋白质聚集体、细胞内病原体和受损细胞器等不需要的结构，这些结构太大，蛋白酶体无法处理。这种不寻常的小泡运输途径开始于将细胞质靶点包装成一个双膜小泡（自噬体），结束于它们在溶酶体中的降解。深入了解自噬作为蛋白质转换的调节机制，有可能为各种人类疾病提供新的治疗方法，包括神经退行性疾病、心脏代谢疾病和癌症。在这里，我们着手建立新的报告员，通过基因筛选研究哺乳动物的自噬。这种方法使我们能够进行全基因组聚集规则间隔回文重复序列（CRISPR）敲除筛选，并恢复几乎所有已知的哺乳动物自噬相关因子（ATG）。此外，我们还发现了一些没有特征化的蛋白质，包括内质网跨膜蛋白41B（TMEM41B），我们继续证明它是自噬体前体膜围绕其靶点正常生长所必需的。更广泛地说，我们的数据集提供了影响自噬体运输到溶酶体的基因的综合资源，用于进一步的假设检验。

引用：Shoemaker CJ、Huang TQ、Weir NR、Polyakov NJ、Schultz SW、Denic V（2019）使用扩展的自噬报告员工具箱进行CRISPR筛查，确定TMEM41B是一种新的自吞噬因子。《公共科学图书馆·生物》17（4）：2007年4月2日。https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2007044

学术编辑：安妮·西蒙森，挪威奥斯陆大学

收到：2018年6月20日；认可的：2019年3月13日；发布时间：2019年4月1日

版权：©2019 Shoemaker等人。这是一篇根据知识共享署名许可协议它允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源得到了认可。

数据可用性：所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。

基金：美国国立卫生研究院（批准号1R35GM127136）。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。国家卫生研究院（批准号5K99GM117218）授予CJS。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。美国国立卫生研究院（批准号P20-GM113132）。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

缩写：AAVS1、，腺相关病毒整合位点1；ALS2、，肌萎缩侧索硬化2例；自动液位计，自噬相关；BafA1、Bafilomycin A1；BLOC-1、，溶酶体相关细胞器复合体1的生物发生；银行同业拆借委员会，BLOC-单相关复合物；BSD、，抗稻瘟菌素基因；社区卫生服务，半琥珀酸胆固醇酯；CLEM、，相关光学和电子显微镜；COPI、，外壳蛋白I；CORVET公司，C类核心液泡/内体栓系；CRISPR/Cas9，簇状规则间隔回文重复序列/CRISPR-相关蛋白9；DDM、，n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷；呃，内质网；电子顺磁共振成像，运输所需的内体分选复合体；FACS、，荧光激活细胞分选；gDNA，基因组DNA；GFP、，绿色荧光蛋白；嘿，人胚胎肾；HOPS公司，同型融合与液泡蛋白分选；IB、，免疫印迹；IF，免疫荧光；LC3，微管相关蛋白1轻链3B；MAGeCK、，基于模型的全基因组CRISPR-Cas9基因敲除分析；NBR1、，BRCA1基因1的邻居；NDP52，核点蛋白52；NGS，正常山羊血清；寡核苷酸；p-S318，磷脂-318；PI3K、，磷脂酰肌醇-3激酶；PI3P、，磷脂酰肌醇-3磷酸酯；RB1CC1，RB1感应线圈1；招标书，红色荧光蛋白；sgRNA，单导向RNA；SQSTM1、，固位体1；STR、，短串联重复；STX17，突触蛋白17；支持向量机，支持向量机；税务1BP1，tax1结合蛋白1；透射电镜，透射电镜；tf、，串联荧光；TMEM41B，跨膜蛋白41B；TORC1、，哺乳动物雷帕霉素复合物靶点1；ULK1、，类Unc-51自噬激活激酶1；城市发展部，尿卟啉原脱羧酶；VMP1、，液泡膜蛋白1；VPS37A中，空泡蛋白分选37个同源物A；WIPI2，WD重复结构域，磷脂酰肌醇相互作用2

介绍

自噬是一个总括性术语，指将细胞质物质运输到溶酶体进行破坏的一大类贩运途径。其研究最多的形式，即大自噬（以下简称“自噬”），涉及形成一个双膜囊泡（自噬体），将细胞质隔离，并通过囊泡融合将其输送至溶酶体。在自噬体生物发生中发现的第一个因子，即所谓的自噬相关因子，最初是通过酵母的遗传筛选确定的[1–三]. 该列表最终发展到目前的状态，包括大约40个酵母ATG，并将所有形式的自噬所需的“核心”因子与仅特定底物（例如受损的线粒体）所需的因子区分开来[4]. 通过发现酵母中未发现的其他自噬因子，如ATG101、EPG5和液泡膜蛋白1（VMP1），自噬相关因子的清单进一步扩大[5–8]. 是否还有其他自噬因子尚未被发现仍是一个悬而未决的问题。

ATG在自噬体生物发生中的分子功能仍在研究中。启动过程包括在内质网（ER）附近构建杯状前体膜（吞噬细胞）[9–13]. 这个过程依赖于RB1诱导的Coiled-Coil 1（RB1CC1）支架蛋白和含有ATG9A的高尔基后囊泡[14–16]. 接下来，自噬特异性磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）复合物的补充导致局部磷脂酰肌苷-3磷酸（PI3P）的形成和PI3P效应器的补充，如WD重复域、磷脂酰肌酸相互作用2（WIPI2）[17，18]. 尽管LC3脂质化的要求最近受到挑战，但新生吞噬细胞随后随着微管相关蛋白1轻链3B（LC3）家族蛋白（酵母中的自噬相关蛋白8[Atg8]）的脂质结合而伸长[19–21].

自噬体中特异性细胞材料的有效包裹是由自噬受体介导的，自噬接合器蛋白的定义特征是能够将货物与自噬体膜上的脂质LC3桥接[22]. 货物、受体和脂质LC3之间的相互作用导致它们被自噬体相互捕获并随后被溶酶体破坏。LC3的这一特性被用来建立最广泛使用的自噬通量报告：串联荧光（tf）LC3（tfLC3）。在这种方法中，2个荧光蛋白标签（红色荧光蛋白[RFP]和绿色荧光蛋白[GFP]）被附加到LC3的氨基末端。在溶酶体输送tfLC3后，溶酶体腔内的低pH条件选择性地熄灭GFP荧光，导致观察到的红：绿荧光比率急剧增加[23，24]. 以类似的方式，tf固碳体1（SQSTM1）已被用于测量这一备受研究的自噬受体的流量[24].

在这里，我们进一步扩展了这种方法，包括3个与选择性自噬广泛相关的额外的SQSTM1样受体（核点蛋白52[NDP52]、tax1结合蛋白1[TAX1BP1]和BRCA1基因1[NBR1]的邻居）。有了这个扩展的工具包，我们进行了全基因组集群规则间隔回文重复序列（CRISPR）筛选，以确定哺乳动物细胞中的选择性自噬因子。我们几乎恢复了所有已知的ATG因子，并发现了一些无特征的蛋白质以供进一步研究。我们使用定量细胞显微镜和生物化学分析验证了我们的列表，将跨膜蛋白41B（TMEM41B）定义为高等真核生物吞噬细胞成熟所需的完整ER膜蛋白。TMEM41B与一个已建立的自噬因子VMP1共享一个广泛保守的跨膜结构域（pfam09335），我们的数据表明，这两个因子在自噬体生物发生中发挥相关但不完全重叠的作用。

结果

扩展用于基因筛查的自噬通量报告工具

K562细胞（一种人类髓细胞白血病细胞系）可以在细胞悬浮液中容易地培养，这导致它们经常用于混合CRISPR筛查。为了设计监测K562细胞自噬流量的一般策略，我们首先构建了6个同源基因盒：1（tfLC3）编码N端，tf（RFP-GFP）与LC3B融合，4（tfSQSTM1、tfNDP52、tfTAX1BP1和tfNBR1）与SQSTM10相关自噬受体N端融合，1（tfEmpty）作为阴性对照(S1A图). tfLC3的RFP与GFP荧光比率（红绿比）是一种广泛使用的自噬通量度量指标，其预测依据是GFP在低pH环境（如溶酶体腔）中的选择性猝灭(图1A). 在腺相关病毒整合位点1（AAVS1）基因座进行盒整合后，我们在基础条件下通过流式细胞术分析细胞，并在用自噬体-溶酶体融合抑制剂巴氟霉素A1（BafA1）或自噬小分子诱导剂托林处理后进行分析。观察到的tfLC3和tf受体的红绿比的相应变化为K562细胞的基础和诱导自噬提供了有力证据(图1B). 相比之下，tfEmpty细胞的红绿比对两种药物治疗都没有反应，认为非选择性报告吞噬对我们的流量测量贡献微乎其微。我们使用粘附的人类胚胎肾HEK293T细胞获得了类似的结果(S1B图). 此外，我们证实，都灵诱导的红绿比增加是由于选择性GFP猝灭所致(S1C图)并且基础和诱导的自噬都依赖于已知的自吞噬相关因子RB1CC1和ATG13(S1D和S1E图). 总的来说，这些数据验证了一系列自噬流量报告因子，可作为K562细胞的遗传筛选工具。

缩略图
下载：
图1。一个扩展的自噬报告器工具包的性能与tfLC3相当。

（A） tf受体如何测量自噬流量的示意图。tf受体与靶细胞结合，并与自噬机制的其他成分如脂溶性LC3（黑色卵形细胞）结合。GFP荧光在低pH环境中选择性猝灭，导致tf受体暴露于溶酶体腔后红绿比增加。虚线表示溶酶体水解酶降解。（B） 表达AAVS1位点所示tf蛋白的K562细胞在基础条件下和用100 nM BafA1或250 nM torin处理18 h后通过流式细胞术进行分析。每个报告者的值均按BafA1处理标准化。图中显示了中位数红绿比、内四分位数（方框区域）以及第10和第90百分位数（胡须）。n个>每个样本1000个细胞。与相关S1图。可以在中找到所有汇总统计的基础数据S1数据AAVS1，腺相关病毒整合位点1；BafA1、Bafilomycin A1；绿色荧光蛋白；LC3，微管相关蛋白1轻链3B；NBR1，BRCA1基因1的邻居；NDP52，核点蛋白52；SQSTM1，固位体1；TAX1BP1，tax 1结合蛋白1；tf，标准荧光。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2007044.g001

自噬通量修饰物的CRISPR筛选可恢复已知ATG因子并揭示新的候选因子

接下来，我们使用我们的自噬通量报告程序，在共表达CRISPR相关蛋白9（Cas9）的K562细胞中进行了一系列全基因组的、合并的CRISRP敲除筛选。为此，我们利用了Brunello单引导RNA（sgRNA）文库，该文库包含76441个sgRNA，覆盖19114个基因[25]. 在sgRNA文库转导后，我们使用荧光激活细胞分选（FACS）收集根据红绿比排列的前三分之一和后三分之一的细胞(图2A). 通过Illumina测序获得来自这些细胞组分的sgRNAs读取计数，并通过全基因组CRISPR-Cas9敲除（MAGeCK）的基于模型的分析进行计算分析[26，27]. 每个基因的结果输出包括一个β评分（类似于对数倍变化），作为其自噬效应器强度的代理(图2B). 为了便于公开挖掘这些数据，我们在http://crispr.deniclab.com.

缩略图
下载：
图2。使用tfReporters的全基因组CRISPR筛查揭示了已知的和新的基础自噬调节器。

（A） 示意图描述了一种用于在基础条件下定义tfReporters（tfLC3和tfReceptors）遗传修饰物的混合CRISPR筛选策略。用布鲁内洛慢病毒sgRNA文库转导表达Cas9的K562细胞。根据红绿比收集细胞顶部和底部的三分之一。通过Illumina测序获得来自收集的细胞的sgRNA序列，并通过MAGeCK进行分析。（B） 所示为所示sgRNAs的平均β得分热图（类似于折叠富集）。分数根据所示sgRNA的作用进行颜色编码（红色，sgRNA抑制自噬；蓝色，sgRNA增强自噬）。为了进行比较，已知的ATG因子（无论效果大小）与新的点击数一起呈现。基因根据其已知功能松散地聚集在一起。在“其他”项下列出的sgRNAs（例如TMEM41B）是从贝塔得分排名前50位的目标中选出的，大约有一名或多名记者点击了这些sgRNAs。在“增强子sgRNAs”中列出的sgRNAs靶向6个基因，这些基因的得分高于已知的最核心的自噬调节因子MLST8。基本阅读次数和测试版分数见S2数据和S3数据分别是。数据的交互式界面也可在线访问http://crispr.deniclab.com.ATG，自噬相关；Cas9，CRISPR相关蛋白9；CRISPR，簇状规则间隔回文重复；FACS，荧光激活的细胞分选；LC3，微管相关蛋白1轻链3B；MAGeCK，全基因组CRISPR-Cas9基因敲除的基于模型的分析；MLST8，MTOR相关蛋白LST8同源物；sgRNA，单导向RNA；tf，串联荧光；TMEM41B，跨膜蛋白41B；VMP1，液泡膜蛋白1。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2007044.g002

来自基因点击的全球分析(图2B)，我们进行了多次观察，验证了我们的基因筛查方法。首先，几乎所有已知的ATG因子都被确定为报告通量所需的因子。其次，我们观察到雷帕霉素复合物1（mTORC1）哺乳动物靶点阳性和阴性调节物的预期表型，该复合物是一种有效的自噬信号抑制剂。第三，我们可以区分与自噬相关的蛋白质复合物和具有共享亚基的相关复合物。例如，我们的分析将同源融合和空泡蛋白分选（HOPS）系留复合体的自噬作用与相关的C类核心空泡/内体系留（CORVET）复合体区分开来。类似地，BLOC-one-related complex（BORC）中的hits干扰了自噬，但我们没有发现溶酶体相关细胞器复合体（BLOC-1）相关生物发生特异性亚基中的hit(图2B).

我们的筛选方法还确定了几个未被表征的因素作为自噬的强调节剂。为了进一步检查这些点击，我们将其作为单个sgRNAs与一组已知的ATG因子进行了重新测试(图3A;S2A–S2D图). 事实上，绝大多数单个sgRNAs的通量增加或减少与其β得分排名成正比（相比之下图3B和图2B). 相比之下，我们发现以尿卟啉原脱羧酶（UROD）为靶点的sgRNAs是虚假点击，通过大幅增强RFP荧光来修改红绿比(S2E图). 我们还证实，K562细胞中的tfNBR1通量在很大程度上独立于LC3脂质化所需的ATG因子（例如ATG7），这与我们最初的筛查结果一致(图3B). 据报道，在其他类型的细胞中有ATG7非依赖性自噬体的形成，我们的工作表明NBR1可能为进一步分析这一过程提供一个有用的新标记[28–30]. 总之，我们的基因筛查策略和hit验证有力地揭示了已知的ATG因子，并为进一步研究提供了新的候选基因。

缩略图
下载：
图3。在单基因敲除实验中，新的屏幕点击可以产生自噬表型。

（A） 联合表达Cas9和tfSQSTM1的K562细胞用针对指定基因的单个sgRNA或非靶向sgRNA对照物进行转导。用托林预处理细胞以使tfSQSTM1信号的动态范围最大化，并通过流式细胞术进行分析(n个>5000个电池）。图中显示了R中使用ggplot2生成的小提琴图。每个样本的中值由黑线标识。使用FlowJo的BifurGate函数以无偏见的方式解卷双峰种群。所有样本上的黑色虚线对应于未受影响细胞的红绿比（即负ctl 1）。所有样品上的红色虚线对应于在最大抑制条件下观察到的比率（sgATG9A）。请参见S2A–S2D图其他tfReporters的类似数据。（B） 根据A部分和S2A–S2D图.根据以下公式，使用每个群体的中位数红绿比计算折叠抑制：（比率sgGene基因−比率sgATG9A型)÷（比率sg控制−比率sgATG9A型)假设sgATG9A产生真正的自噬-空表型。深浅的红色表示较强的抑制表型。黑框表示未评分案例。与相关S2图。可以在中找到所有汇总统计的基础数据S1数据ACP1，酸性磷酸酶1；ATG，自噬相关；Cas9，CRISPR相关蛋白9；ctl，对照；EPG5，异位P颗粒自噬蛋白5同源物；LOH12CR1，杂合性缺失12染色体区域1；MEF2BNB，MEF2B邻居；RB1CC1、RB1感应线圈1；sgRNA，单导向RNA；SQSTM1，固位体1；tf，串联荧光；TMEM251，跨膜蛋白251；TMEM41B，跨膜蛋白41B；VPS37A，空泡蛋白分选37个同源物A；WIPI2，WD重复结构域，磷脂酰肌醇相互作用2。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2007044.g003

TMEM41B是一种自噬所需的保守内质网膜蛋白

TMEM41B因其在K562细胞中的强表型（尤其是tfNDP52和tfTAX1BP1）而在我们未经标记的命中中脱颖而出。预计该蛋白跨越膜6倍，并携带二赖氨酸、C末端高尔基体到内质网的检索信号(S3A图) [31]. 与这些预测一致，之前对亚细胞组分的无偏见蛋白质组学分析将TMEM41B的居住地指定为内质网[32]. 事实上，当我们免疫沉淀TMEM41B时，我们发现N-末端标记而非C-末端标记的TMEM41B共同免疫沉淀了来自洗涤剂溶解细胞裂解物的Golgi-to-ER囊泡的外壳蛋白I（COPI）复合物成分(S3B图). 此外，当我们用GFP的第11条β链（GFP11）标记内源性TMEM41B的N末端并共同表达互补的GFP片段（β链1至10[GFP1-10]）时，我们观察到一个网状GFP荧光信号，该信号与ER标记物calnexin共定位(S3C图).

为了测试TMEM41B在其他人类细胞系中是否对自噬至关重要，我们在HEK293T和HCT116细胞中敲除了它的基因，在那里我们观察到了比在我们原始的K562背景中更强大的自噬作用。具体而言，内源性SQSTM1、TAX1BP1、NDP52和LC3的免疫印迹（IB）分析显示，在缺乏TMEM41B的情况下，它们的积累与自噬周转减少的可能性一致(图4A;S3D和S3E图). 自噬通量的两个补充测量进一步支持了这一解释。首先，治疗TMEM41B公司科含有BafA1的细胞无法诱导脂质LC3（LC3-II）的进一步积聚(图4B). 其次，tfLC3和tfSQSTM1通量在TMEM41B公司科单元格，与自动液位计7科控制单元(S3F和S3G图). 综上所述，这些数据表明，在缺乏TMEM41B的情况下，自噬通量被显著抑制。

缩略图
下载：
图4。自噬通量需要TMEM41B。

（A） 提取自WT和TMEM41B公司科HEK293T细胞通过SDS-PAGE和带有指示抗体的IB进行分离。在装载之前，使用BCA分析通过总蛋白对所有样品进行标准化。I和II表示LC3的未修饰和修饰形式。条形图显示了3个独立实验中每个样本的平均值±SD。WT细胞的蛋白质水平标准化为1；第页-使用一个样本确定值t吨测试*第页< 0.05. （B） WT和TMEM41B公司科用250 nM BafA1处理HEK293T敲除细胞达到指定时间。相应的细胞提取物通过总蛋白标准化，通过SDS-PAGE解析，并通过IB分析LC3。I和II表示LC3的未修饰和修饰形式。条形图显示了3个独立实验中每个样本的平均值±SD；第页-使用一个样本确定值t吨测试*第页< 0.05. 与相关S3图。可以在中找到所有汇总统计的基础数据S1数据BafA1、Bafilomycin A1；BCA，双钦酸；HEK，人胚胎肾；免疫印迹法；LC3，微管相关蛋白1轻链3B；NDP52，核点蛋白52；ns，不显著；SQSTM1，固位体1；TAX1BP1，tax1结合蛋白1；TMEM41B，跨膜蛋白41B；WT，野生型。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2007044.g004

TMEM41B介导吞噬细胞成熟

虽然自噬在缺乏TMEM41B公司目前尚不清楚这种缺陷是由无法正确启动自噬、吞噬体未能成熟为自噬囊泡或成熟自噬体未能正确运输和/或与溶酶体融合引起的。定义自噬体形成的阶段TMEM41B公司科我们利用一系列互补的方法系统地探索了自噬体的生物发生途径。脂质LC3在TMEM41B公司科细胞与起始缺陷不一致(图4A). 为了进一步支持这一观点，我们分析了类Unc-51自噬激活激酶1（ULK1）的激酶活性，ULK1是RB1CC1复合物的一种成分，可调节吞噬细胞成核[33]. 在自噬诱导后，ULK1磷酸化许多底物，包括ATG13。因此，ATG13中丝氨酸-318（p-S318）的磷酸化可以作为ULK1活性的替代物[34，35]. 我们发现，在野生型和TMEM41B公司科单元格(S4A图). 为了进行比较，该分析有力地检测到缺乏RB1CC1（一种已知的ULK1激酶辅激活剂）的细胞中ULK1活性的丧失(S4A图). 这些数据表明，TMEM41B的主要作用是启动下游。

接下来，确定启动的吞噬细胞是否在TMEM41B公司科细胞，我们转向蛋白酶保护测试(图5A) [36]. 在这个实验中，适当密封的自噬体保护其货物免受外源蛋白酶的蛋白水解。用BafA1处理细胞18小时以积累自噬体，然后通过机械破坏进行溶解。正如预期的那样，在野生型提取物中，自噬受体NDP52具有蛋白酶抗性，直到膜被Triton X-100（非离子洗涤剂）溶解。相比之下，NDP52在来源于TMEM41B公司科单元格和RB1CC1型科控制细胞，与未能正确形成完整的自噬体一致(图5B). 我们在分析LC3-II的蛋白酶保护时获得了类似的结果(S4B和S4C图). 总之，这些数据表明TMEM41B是吞噬细胞成熟所必需的。

缩略图
下载：
图5。吞噬细胞成熟需要TMEM41B。

（A） 检测封闭自噬体的蛋白酶保护试验示意图。当被适当密封的囊泡隔离时，靶点可被胰蛋白酶保护免受蛋白水解。（B） 在温和的机械裂解之前，用100 nM BafA1处理WT和指示的HEK293T敲除物18小时。相应的细胞提取物在通过SDS-PAGE溶解之前按照指示进行处理，并通过IB用指示的抗体进行分析。NDP52是一个典型的自噬靶点；微管蛋白是非结合的，是蛋白质水解的控制因素。条形图显示了3个独立实验中每个样本的平均值±SD；第页-值是由一名学生确定的t吨测试*第页< 0.01. 与相关S4图。所有汇总统计数据的基础数据可在S1数据BafA1、Bafilomycin A1；HEK，人胚胎肾；免疫印迹法；NDP52，核点蛋白52；ns，不显著；TMEM41B，跨膜蛋白41B；WT，野生型。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2007044.g005

为了更好地定义自噬体生物发生的停滞阶段TMEM41B公司科我们使用共焦显微镜监测与自噬体生物发生特定步骤相关的各种ATG的募集。为了验证这一方法，我们监测了LC3-阳性（LC3+）点刺的形成。与我们早期的生物化学方法一致(图4，图5;S3图，S4图)，我们发现TMEM41B公司科在基础条件下，细胞显示的LC3+点大约是野生型细胞的5.5倍(图6A和6B). 当我们测量与SQSTM1共定位的LC3+结构的丰度作为自噬体生物发生的额外标记时，我们得出了类似的结论(S5A和S5B图). 此外，都灵治疗诱导野生型细胞中LC3+突起水平增加约4倍，而对TMEM41B公司科单元格(图6A和6B). 这些数据与细胞自噬通量的抑制作用基本一致TMEM41B公司科细胞。

缩略图
下载：
图6。 TMEM41B公司科细胞在自噬体生物发生中积累未解决的中间产物。

（A） 在共焦显微镜分析之前，用250 nM托林处理野生型和指示的HEK293T敲除细胞指定的时间。所示为典型共焦显微照片（作为最大强度投影）。显微照片的选定区域（白框）显示为IF针对指示蛋白质的单个和合并通道的插图。LC3，洋红；WIPI2，绿色；合并，白色；赫斯特，蓝色。比例尺：大面板，5μm；小面板，1μm。（B） 图中显示了在A部分成像的野生型和HEK293T敲除细胞中指示的点状平均值，显示了内四分位数（方框区域）、1.5个四分位数间距（胡须）和异常值（点）。样本大小(n个)对于每个样品，都有指示。（C） 通过共焦显微镜分析HEK293T细胞的野生型和指示单细胞和双细胞的典型共焦显微照片（作为最大强度投影）。显微照片的选定区域（白框）显示为IF针对指示蛋白质的单个和合并通道的插图。LC3，洋红；WIPI2，绿色；合并，白色；赫斯特，蓝色。比例尺：大面板，5μm；小面板，1μm。（D） 显示C部分成像的细胞中所示点状平均值的图，显示了内四分位数（方框区域）、1.5个四分位数间距（胡须）和异常值（点）。样本大小(n个)对于每个样品，都有指示。与相关S5图。可以在中找到所有汇总统计的基础数据S1数据.ATG，自噬相关；DKO，双淘汰赛；HEK，人胚胎肾；IF，免疫荧光；微管相关蛋白1轻链3B；RB1CC1、RB1感应线圈1；TMEM41B，跨膜蛋白41B；WIPI2，WD重复结构域，磷酰肌醇相互作用2。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2007044.g006

接下来我们分析了WIPI2的LC3+结构，WIPI2与富含PI3P的吞噬中间体有关，但与成熟的自噬体无关[17，37]. 我们发现，大多数LC3+结构TMEM41B公司科与WIPI2共定位的细胞（79%；n个=5032 LC3+结构），而野生型细胞与WIPI2重叠不良（8%；n个= 1,394) (图6A和6B). RB1CC1基因消融消除了LC3+或WIPI2+结构在TMEM41B公司科细胞，认为这些结构是吞噬细胞成熟过程中真正的中间产物(图6C和6D;S5C图). 此外，我们观察到syntaxin 17（STX17），这是一种在囊泡闭合之前被征募到晚期吞噬细胞中间产物的SNARE蛋白[38]. 该分析未发现LC3+结构上有明显数量的STX17积聚在TMEM41B公司科单元格(S5D和S5E图). 为了进行比较，我们重述了已发表的观察结果，即STX17+结构在缺乏ATG7的情况下积累(S5D和S5E图) [20].

总之，我们的生物化学和基于显微镜的数据表明，TMEM41B的消融阻止了吞噬细胞在膜伸长过程中的成熟——特别是在LC3或WIPI2募集后，但在WIPI2解离或STX17募集之前。为了证实这一解释，我们使用透射电子显微镜（TEM）作为另一种方法，在超微结构水平上观察阻滞的自噬体中间产物。通过TEM进行的分析揭示了单个膜囊泡（直径约140nm）在TMEM41B公司科细胞，但不在野生型细胞中(S6A图). 然而，相关光镜和电子显微镜（CLEM）表明，荧光LC3点状物与这些囊泡无关，而是与较小（约50 nm）囊泡的明显数量相关(图7A). 含有LC3+结构的电子层析成像的三维重建显示，膜片、小管和小泡的基本集合，让人联想起未成熟的隔离膜[15] (图7B;S6B和S6C图). 相比之下，在野生型细胞中，LC3点状突起与类似于完整的自噬体的结构相关(图7C).

缩略图
下载：
图7。自噬体前膜无法结合TMEM41B公司科细胞。

HEK293T的CLEMTMEM41B公司科（A和B）和表达tfLC3的野生型HEK293T细胞（C）在基础条件下生长（无药物治疗）。分析工作流程由绿色箭头指示。白色箭头表示感兴趣的典型结构。在随后的图像中，白色方框标出缩放区域。蓝色表示Hoechst 33342。A组包括用于对GFP阳性区域的膜结构进行三维重建（在B中）的样本断层摄影。绿色表示膜板和管；青色表示膜泡。请参见材料和方法以获取进一步的CLEM分析细节。与相关S6图CLEM、相关光和电子显微镜；绿色荧光蛋白；HEK，人胚胎肾；LC3，微管相关蛋白1轻链3B；透射电镜；tf，标准荧光。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2007044.g007

TMEM41B在功能上与VMP1相关

为了深入了解TMEM41B的生化功能，我们将重点放在其广泛保守的跨膜结构域（pfam09335）上[39] (S3A图;S7A图). VMP1是另一种广泛保守的ER-膜蛋白，也包含pfam09355结构域，是自噬早期所必需的[6，7，14，15，40]. 基于这些相似性，我们假设TMEM41B和VMP1具有相关活动。为了检验这种可能性，我们寻找了在缺乏TMEM41B的情况下某些ATG因子与内质网膜的增加关联，TMEM41B是自噬体生物发生受阻的标志VMP1（VMP1）科单元格[41]. 事实上，在对细胞裂解物进行差速离心之后(图8A)中，我们观察到WIPI2、RB1CC1和ATG9A从高速颗粒（p100）向包含ER-衍生膜的低速颗粒（p3和p20）的迁移发生了转移VMP1（VMP1）科和TMEM41B公司科单元格(图8B). 重要的是，我们可以在TMEM41B公司科通过基因消融RB1CC1细胞，强调这是一种自噬依赖性效应。

缩略图
下载：
图8。TMEM41B与VMP1共享结构同源性和功能冗余。

（A） 囊泡分馏方案示意图。（B） WT和指示的HEK293T敲除细胞按A组所述进行分馏。分馏部分用SDS-PAGE进行分离，然后用指示抗体进行IB。膜级分以15X浓缩物的形式装载。（C） tfEmpty、tfVMP1或tfTMEM41B表达结构整合在WT和HEK293T敲除细胞的AAVS1位点。在用SDS-PAGE和IB与所示抗体进行分离之前，用总蛋白对细胞裂解液进行标准化。每个车道下显示了相对于WT（tfEmpty）细胞的LC3-II水平（归一化为微管蛋白）。（D） C中所示LC3-II水平的定量。将每条车道中的LC3-II标准化为微管蛋白。WT（空）细胞中的LC3-II水平设置为1。条形图显示了3个独立实验中每个样本的平均值±SD；第页-值是由一名学生确定的t吨测试*第页< 0.02. （E） 用100 nM BafA1处理C来源的HEK293T细胞18小时，然后进行温和的机械裂解。在通过SDS-PAGE解析之前，按照指示处理相应的细胞提取物，并通过IB用指示的抗体进行分析。NDP52是一个典型的自噬靶点；微管蛋白是非结合的，并且作为蛋白水解的对照。条形图显示了3个独立实验中每个样本的平均值±SD；第页-值是由一名学生确定的t吨测试*第页< 0.02. 与相关S7图。可以在中找到所有汇总统计的基础数据S1数据.AAVS1，腺相关病毒整合位点1；ATG，自噬相关；BafA1、Bafilomycin A1；绿色荧光蛋白；HEK，人胚胎肾；免疫印迹法；LC3，微管相关蛋白1轻链3B；NDP52，核点蛋白52；ns，不显著；RB1CC1、RB1感应线圈1；SQSTM1，固位体1；Sup，上清液；TAX1BP1，tax1结合蛋白1；tf，串联荧光；TMEM41B，跨膜蛋白41B；VMP1，液泡膜蛋白1；WIPI2，；WT，野生型。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2007044.g008

为了进一步验证TMEM41B和VMP1具有相关活性的假设，我们进行了遗传互补分析。具体来说，我们使用我们的tf基因盒系统过度表达标记版本的TMEM41B和VMP1，并评估了对TMEM41B公司科通过2种分析检测表型：通过IB监测受体积累，通过蛋白酶保护监测货物包裹。tfTMEM41B和tfVMP1（约15倍过表达[S7B图])补充的TMEM41B公司科表型(图8C-8E). 相比之下，只有tfVMP1能够抑制VMP1（VMP1）科表型。综上所述，这些数据强烈证明VMP1和TMEM41B在吞噬细胞成熟过程中具有部分重叠的作用。

讨论

酵母正向遗传学的力量是自噬研究领域稳固的基础[1–三，42–46]. 对高等真核生物自噬的补充研究揭示了这一过程的深层保存，以及在发育、免疫和神经元内稳态的背景下调控它的新机制。自噬受体是连接不同细胞靶点和核心自噬机制的蛋白质，可使这种多样性在很大程度上得以实现[47]. 然而，这些受体作为识别新因子和人类自噬适应的基因处理的潜力才刚刚开始探索。

最近，基于CRISPR的筛查显示了其在识别新型哺乳动物自噬因子和途径方面优于以往技术的能力[48，49]. 在这里，我们将CRISPR筛查与tf报告子的扩展工具包相结合，以确定哺乳动物自噬所需的新因子。这些数据作为交互式资源可在http://crispr.deniclab.com.

我们的屏幕几乎恢复了所有已知的ATG因子以及非特征化因子，包括TMEM41B。在后续研究中，我们发现TMEM41B是一种内质网整合膜蛋白，对多个人类细胞系的自噬通量至关重要。利用互补的生化和荧光显微镜分析，我们检测到在TMEM41B消融的细胞中未密封的LC3+，WIPI2-阳性自噬中间产物的积累（图5和6). 此外，我们通过CLEM进行的超微结构分析发现，这些中间产物对应于一系列薄的（约50 nm）膜片、小管和小泡，这些是不成熟隔离膜的特征(图7) [15].

TMEM41B包含一个保守的跨膜结构域（pfam09335），也在VMP1中发现，该因子以前已知调节吞噬细胞成熟[15，41，50]. 相应地，VMP1的过度表达恢复了自噬体的形成TMEM41B公司科单元格(图8)，与TMEM41B和VMP1可能在结构和/或功能上相关的可能性一致。VMP1在酵母中缺失，但在高等真核生物中普遍保守。在粘液菌和其他模式真核生物一样，缺乏VMP1的细胞表现出不同的表型，包括自噬缺陷、膜接触位点缺陷、离子稳态缺陷、脂质代谢缺陷和磷脂酰肌醇分布缺陷[6，40，41，50–52]. 鉴于这种多向性效应，尚不清楚在缺乏VMP1或TMEM41B的细胞中观察到的自噬缺陷是ER-organelle动力学更广泛缺陷的直接或后遗症。

在修订这份手稿的过程中，两组独立报道了TMEM41B作为哺乳动物自噬的新修饰物[53，54]. 与本文的结果一致，两者都观察到TMEM41B和VMP1缺失之间的相似性。基于这些表型相似性，一个直接的假设是TMEM41B和VMP1作为复合体发挥作用。事实上，Morita及其同事能够在n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷/胆固醇半琥珀酸盐（DDM/CHS）存在下分离出一种含有VMP1/TMEM41B的共复合物[53]虽然在其他洗涤剂中没有观察到这种复合物[54，55]. 确定TMEM41B的功能是否依赖于其与VMP1的交互，这仍是一个重要的未来目标。一个潜在的线索来自对DedA蛋白的研究大肠杆菌，与TMEM41B和VMP1共享pfam09335[56]与细菌LeuT转运蛋白有远缘关系[57].E类.大肠杆菌缺乏DedA同源物YqjA和YghB的细胞在质子输入方面有缺陷，可以通过过度表达Na来挽救+/K（K）+-H（H）+反转运蛋白[58，59]. VMP1和TMEM41B的未来生化和结构研究将为测试它们在离子稳态中的潜在保守作用提供新的工具。

对自噬的深入了解有可能为许多病理学提供治疗见解，包括神经退行性疾病、心脏代谢疾病和癌症[60–62]. 例如，TMEM41B与多种病理学有关，包括脊髓性肌萎缩[63]，肺类癌[64]和冠状病毒感染[65]. 我们的工作认为，在这些情况下，自噬应该作为一个潜在的病因进行进一步的研究。

TMEM41B作为一种新的ATG因子的鉴定是这项工作的一个方面，但我们数据的其他方面仍有待探索。这些包括新的自噬诱导物、受体特异性调节剂和其他假定的ATG因子。液泡蛋白分拣37同源物A（VPS37A）和VPS25是后一类中的两个因子，已知它们会组装成运输所需的内体分拣复合物（ESCRT）。ESCRT成分长期以来与自噬有关，可能在自噬体生物发生过程中以及自噬体内融合过程中的几个步骤中发挥作用[66，67]. 细胞分裂需要许多ESCRT成分，这使突变表型的分析变得复杂。相比之下，VPS37A是非必需的，为进一步剖析ESCRT在哺乳动物自噬中作用的机制细节提供了潜在的未来处理方法。

总之，本文提供的资源提供了3项具体进展。首先，它说明了tf通量报告作为基因筛选工具的强大特性，可以进一步应用于其他受体和受体靶点。其次，它生成了丰富的数据集(http://crispr.deniclab.com)用于进一步的假设检验。最后，它为进一步剖析内质网膜在自噬体生物发生过程中的神秘作用提供了一个新的分子手柄（TMEM41B）。

材料和方法

抗体

本研究中使用了以下抗体。对于IB，除另有说明外，所有一级抗体均以1:1000的比例使用；二级抗体使用1:3000（HRP）或1:10000（荧光）。对于免疫荧光（IF），在每个抗体之后记录抗体稀释；使用1:500的二次抗体。主要抗体包括：小鼠抗SQSTM1（[1:2000–IF]ab56416，Abcam，Cambridge，United Kingdom）、兔抗TAX1BP1（#5105，Cell Signaling Technology，Danvers，MA）、兔抗NDP52（#9036，Cell信号技术）、兔对抗LC3B（[1:2000-IB]NB100-2220，Novus Biologicals，Centennial，CO）、，兔抗LC3A/B（[1:100–IF]#12741S，细胞信号技术）、大鼠抗微管蛋白（[1:500–IB]sc-53030，德克萨斯州达拉斯圣克鲁斯）、抗p70-S6K（#9202S，细胞信息技术）、抗p70-S6K（pT389）（#9205S，细胞信号技术）、兔抗ATG13（ABC344，MilliporeSigma，马萨诸塞州伯灵顿）、兔抗大鼠ATG13（NBP2-19127，Novus Biologicals，Centennial，CO），抗WIPI2（[1:150–IF]ab105459，Abcam），兔抗ATG7（#8558，细胞信号技术），抗RB1CC1，和兔抗Calnexin（#2679，细胞信号技术）。IB的二级抗体包括：山羊抗鼠IgG HRP（#170-6516，Bio-Rad，Hercules，CA）、山羊抗兔IgG HRP（#1170-6515，Bio-Read，Hergules，加利福尼亚）、山羊抗大鼠IgG-Alexa Fluor 488（A11006，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）、山羊抗体IgG Cy5（A10524，Thermo-Fisher科学）、，和山羊抗兔IgG Alexa Fluor 546（A11010，Thermo Fisher Scientific）。二级抗体（IF）包括以下抗体：山羊抗兔IgG Alexa Fluor 568（A11036，赛默飞世尔科技公司）和山羊抗鼠IgG Allxa Flu Plus 488（A32723，赛默飞科技公司）。

化学品和试剂

本研究中使用了以下化学品和试剂：torin1（sc-396760，Santa Cruz，Dallas，TX）、BafA1（tlrl-baf1，InvivoGen，San Diego，CA）、聚左旋赖氨酸（P4707-50ML，MilliporeSigma）、Lipofectamine 3000（L300008，Thermo Fisher Scientific）、核感染试剂盒T（VACA-1002，Lonza，Basel，Switzerland）、聚布林（H9268-5G，MilliposeSigma，诺莫菌素（ant-nr-1，InvivoGen）、嘌呤霉素（ant-pr-1，InvioGen，和Taq DNA连接酶（M0208L，NEB，Ipswich，MA）。

矢量

pHR-SFFV-GFP1-10（Addgene质粒#80409）和pCDNA CMV mCherry-GFP-11是Bo Huang赠送的礼物。pMRXIP GFP-Stx17TM是Noboru Mizushima（Addgene质粒#45910）赠送的礼物。人类布鲁内洛CRISPR基因敲除库是大卫·鲁特和约翰·多恩（Addgene#73178）赠送的礼物。lentCRISPRv2 puro是Brett Stringer（Addgene质粒#98290）的礼物。lentGuide-puro是张峰送的礼物（Addgene质粒#52963）。ptfLC3是由Tamotsu Yoshimori（Addgene质粒#21074）赠送的。pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9是由Feng Zhang（Addgene质粒#42230）赠送的。AAVS1-CAG-hrGFP是张素春（Addgene质粒#52344）赠送的礼物。psPAX2是Didier Trono（Addgene质粒#12260）送给我们的礼物。pCMV-VSV-G是Bob Weinberg（Addgene质粒#8454）送的礼物。pUMVC是来自Bob Weinberg的礼物（添加基因质粒#8449）。pFUGW-EFSp-Cas9-P2A-Zeo（pAWp30）是Timothy Lu（Addgene质粒#73857）的礼物。

等温装配

使用2X融合主混合（M0531S、NEB、Ipswich、MA）和插入特异性引物生成PCR片段，这些引物与目标DNA重叠30 bp。载体主干通过限制性内切酶线性化，并通过小牛肠磷酸酶（M0290S，NEB，Ipswich，MA）去磷酸化。在组装之前，所有DNA片段都经过凝胶纯化（D4002，加利福尼亚州欧文市，Zymo Research）。线性化载体DNA（50 ng）与等摩尔量的纯化插入物相结合；将5 ul所得DNA混合物添加到等温组装主混合物中，并在50°C下培养20 min[68]. 将组装好的产品转化为NEB稳定的活性细胞（C3040H、NEB、Ipswich、MA），并将其置于LB+琼脂平板上（加上适当的抗生素），以分离单个菌株。单一分离株在LB肉汤+抗生素中生长，并使用Qiagen miniprep试剂盒（#27106，Qiagen，Hilden，Germany）纯化质粒DNA。序列通过Sanger测序进行验证（伊顿生物科学公司，加利福尼亚州圣地亚哥）。

sgRNA寡核苷酸连接方案

sgRNA寡核苷酸（oligos）是从伊顿生物科学公司（加利福尼亚州圣地亚哥）订购的。寡核苷酸序列列于S1表为了生成必要的悬垂，所有寡聚物的形式如下：正向：5′-CACCGNNNNNNNNnnNNNNNN–3′；反向：5′-AAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC–3′。将低聚物在蒸馏水中稀释至10μM。在25 ul的反应中结合总共50 pmol的正向和反向寡核苷酸，并在37°C的1X T4 DNA连接酶缓冲液（B0202S、NEB、Ipswich、MA）中与T4多核苷酸激酶（M0201S、NEB-、Ipswich、MA）磷酸化30 min。将磷酸化寡聚物在95°C下煮沸5分钟，并缓慢冷却（0.1°C/s）以促进退火。将退火的寡核苷酸稀释为1:100，并使用T4 DNA连接酶（M0202S，NEB，Ipswich，MA）将2μl插入物连接到20 ng消化载体（pLentiuGuide-puro，BsmBI位点；pLentiCRIPSR版本2，BbsI位点；pX330-衍生物，BbsI位点）中。结扎在室温下进行15分钟。将连接产物转化为NEB稳定细胞（NEB，Ipswich，MA）。

T7核酸内切酶（检测）分析

根据制造商的说明，使用QuickExtract缓冲液（QE0905T，Epicenter，Madison，WI）提取基因组DNA（gDNA）。随后将gDNA标准化为200 ng/μl。每100μl PCR，使用600 ng gDNA作为模板来扩增目标区域。底漆列于S2表使用酵母凝胶DNA回收试剂盒（D4002，加利福尼亚州欧文市酵母研究所）纯化得到的PCR扩增子，并在19μl 1X NEBuffer 2（B7002S，NEB，Ipswich，MA）中标准化为20 ng/μl。将Amplicon煮沸并冷却（−1°C/s）以允许杂交。以每20μl反应1μl的速度添加T7内切酶I（M0302，NEB，Ipswich，MA），并在37°C下培养15分钟。通过添加1.5μl 0.25 M EDTA对反应进行猝灭，并在2%超纯琼脂糖凝胶（#16500500，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）中进行分析。

生成AAVS1目标tfReporter

使用SalI/EcoRV从AAVS1-CAG-hrGFP中切下hrGFP片段，并替换为从ptfLC3亚克隆的RFP-GFP，以生成pCS418 tfEmpty（puro）。对LC3B（NP_074058.2）、SQSTM1（NP_003891.1）、NDP52（NP_005890.2）、NBR1（NP-006015.4）或TAX1BP1（NP_0005822.1）进行PCR扩增并亚克隆到pCS418的KpnI位点。底漆列于S3表为了生成每个盒的抗急速杀菌素版本，用XhoI/SpeI消化物从pCS418中切除嘌呤霉素抗性基因，并用编码抗急速抗菌素基因（BSD）的类似基因块片段（Integrated DNA Technologies，Coralville，IA）替换。

组织培养

所有细胞均在含有5%CO的标准水套培养箱中生长2K562细胞在含有10%FBS（#30-2020，ATCC，Manassas，VA）和1x青霉素/链霉素的IMDM培养基（#30-2005，ATCC、Manassas、VA）中生长。细胞保持在每毫升100万个细胞以下。HEK293T细胞在含有10%FBS和1x青霉素/链霉素的DMEM培养基（#30–2002，ATCC，Manassas，VA）中生长。诺莫霉素（1:500）用作常用添加剂。所有细胞传代少于25次。为了传代，用胰蛋白酶-EDTA（#25300-054，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）对细胞进行胰蛋白酶化。必要时添加嘌呤霉素（2μg/ml）、速溶菌素（5μg/ml。Hct116细胞在含有10%FBS（#30-2020，ATCC，Manassas，VA）和1x青霉素/链霉素的McCoy的5a修饰培养基（#30-2007，ATCC，Manassas，VA）中生长。

细胞系验证

使用GenElute哺乳动物基因组DNA Miniprep试剂盒（MilliporeSigma，马萨诸塞州伯灵顿）从HEK293T和K562细胞中分离出gDNA。Dana-Farber癌症研究所分子诊断实验室进行了短串联重复序列（STR）分析和等位基因鉴定。简而言之，使用GenePrint 10 STR分析试剂盒（Promega，Madison，WI）和Amelogenin对分离的gDNA进行性别鉴定。使用GeneMapper第4版片段分析软件（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）和GenePrint10等位基因面板（Promega，Madison，WI）自定义bin文件来识别8个STR基因座（TH01、TPOX、vWA、CSF1PO、D16S539、D7S820、D13S317和D5S818）的等位基因。ATCC STR图谱数据库用于验证所识别的等位基因与预期细胞类型的等位蛋白相匹配。

瞬时转染和核转染

转染前，HEK293T细胞接种在OptiMEM Reduced Serum培养基中（#51985-034，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）。按照制造商的建议，在90%的融合率下，使用脂质体3000试剂转染细胞过夜。第二天早上，交换培养基，并在药物治疗前将细胞再传代24小时。使用Nucleofector 2b设备（瑞士巴塞尔Lonza），使用核感染试剂盒T（瑞士巴塞尔Lunza，VACA-1002）和T-016方案对K562细胞进行核感染。使用ZymoPURE质粒Midiprep试剂盒（D4200，Zymo Research，加利福尼亚州欧文）制备转染/核感染DNA。

利用CRISPR-Cas9基因编辑技术建立基因敲除细胞系

为了产生稳定的敲除物，如上所述，分别转染HEK293T和K562细胞。sgRNAs的寡核苷酸序列由CHOPCHOP生成，或从Brunello文库中提取，并按照上述“sgRNA寡核苷酸连接协议”克隆到指定的载体中[25，69]. 低聚物列在下面S2表通过限制稀释或细胞分选，将细胞稀释成96周的平板，并进行克隆扩增。通过western blot或PCR/T7核酸内切酶测试确认扩增的细胞被敲除。

GFP1-10细胞系的产生

用慢病毒GFP1–10表达盒转导HEK293T细胞。通过限制稀释建立克隆细胞系，并通过mCherry-GFP-11瞬时转染验证GFP1-10插入。保存了四个成功的克隆，其中一个用于所有进一步的实验。为了标记TMEM41B，用pCS651（共表达Cas9-T2A-BFP，sgTMEM41B）和oVD6217（含有5′同源臂-GFP11-linker-3′同源臂的寡核苷酸）转染细胞。成功的整合子由FACS识别和分类。

AAVS1集成

用pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9-AAVS1-gRNA和AAVS1-tfReporter模板载体共同转染细胞株。转染后48小时，用适当的选择培养基培养细胞并传代14天。对红/绿+细胞进行分选和繁殖。

慢病毒生成

使用Lipofectamine 3000在HEK293T细胞中生成慢病毒。细胞在OptiMEM培养基（5%FBS，无抗生素）（#31985062，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）中培养过夜，达到90%的融合率。然后以1:3:4的比例用pVSV-G、pSPAX2和包装构建物转染细胞。转染持续6至8小时，然后刷新培养基。在转染后24和48小时收集病毒并汇总。将病毒在1000 g 2×10分钟下制成丸状，等分，并冷冻在一次性等分试样中。对于逆转录病毒的生产，除了pUMVC与pSPAX2交换外，所有方法都相同。

病毒转导

细胞在含有8μg/ml聚Brene且缺乏青霉素/链霉素的适当培养基中培养。隔夜转导细胞。在选择抗生素之前，将培养基换成不含聚brene的培养基24小时。

蛋白酶保护试验

我们的哺乳动物蛋白酶保护试验方案基于Zhao及其同事[36]. 接种细胞，使其在下午5点融合75%。然后将培养基交换到含有100 nM BafA1的培养基中。培养细胞15小时。培养后，将细胞胰酶化并制成颗粒。用冷PBS清洗细胞1次，并将其重新悬浮在预冷的裂解缓冲液中（20 mM Hepes KOH[pH7.4]，0.22 M甘露醇，0.07 M蔗糖）。通过26号针头挤压20次，将细胞溶解。在4°C下，将样品在500 g的温度下2次造粒10分钟，以造粒碎片。如有指示，将样品与1X胰蛋白酶（T1426-100MG[MilliporeSigma，Burlington，MA]；100X储备液：1 mg/ml）和/或0.5%Triton X-100在30°C下孵育35分钟。反应在1X热Laemmli样品缓冲液中淬火，并在65°C下保持10分钟。

差速离心

从两到四个15厘米的培养皿中以95%的汇合率收集细胞，在冷藏室中用5毫升冷PBS每个培养皿进行刮洗。细胞在4°C下以150 g的浓度造粒10分钟。去除PBS，将细胞重新悬浮在3倍体积的低渗裂解缓冲液中（10 mM HEPES、10 mM KOAc、1.5 mM Mg（OAc））2，1X蛋白酶抑制剂片）。细胞在冰上培养20分钟，然后造粒。将颗粒细胞重新悬浮在缓冲液E中（2倍体积的填充细胞颗粒；20 mM HEPES[pH7.4]，250 mM蔗糖，1 mM EDTA，1X蛋白酶抑制剂片）。使用1 mL注射器（在−20°C下预冷）在冰上通过26 gaug针头对细胞进行机械裂解（向上/向下8次，让细胞在其间沉淀）。在造粒之前，将裂解液在缓冲液E中稀释2倍。在1000℃下，通过造粒清除裂解液中的细胞碎片和细胞核克在4°C下保持10分钟。在3000时进行连续造粒克持续10分钟，20000克20分钟，100000克60分钟。将所有颗粒重新悬浮在缓冲液E中。

免疫沉淀

收集细胞并将其重新悬浮在IP缓冲液中（50 mM HEPES[PH7.4]，150 mM NaCl，2 mM EDTA，1%Triton X-100）。细胞在冰上培养30分钟，并在4°C下在5000 g下两次造粒5分钟。将上清液应用于预清洗的GFP-Trap或RFP-Trap磁性琼脂糖（德国普莱内格马丁塞德Chromotek），并在4°C下培养1 h。清洗珠子4×5 min，换两次试管。蛋白质在70°C下在1X SDS缓冲液中煮沸以洗脱。

凝胶电泳和western印迹

细胞在75%的汇合度下进行胰蛋白酶消化，并在等量的培养基中淬灭。细胞在裂解缓冲液（50 mM HEPES[pH 7.4]，150 mM NaCl，2 mM EDTA，1%Triton X-100，2X完整蛋白酶抑制剂片[Roche，Basel，Switzerland]）中的冰上裂解15分钟。为了进行磷酸化分析，裂解缓冲液中添加了磷酸酶抑制剂（10X:100 mM NaF，10 mM Na三VO（旁白）4，100 mM NaPP我). 将1000 g的裂解液清除2倍，持续5分钟。使用旋后上清液作为输入。使用BCA蛋白质分析（#23227，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）对上清液中的蛋白质水平进行标准化。将归一化样品在1X（最终浓度）Laemmli加载缓冲液中煮沸（3X储备液：189 mM Tris[pH6.8]，30%甘油，6%十二烷基硫酸钠，10%β-巯基乙醇，溴酚蓝）。在Novex 4%–20%三甘醇凝胶中，在195 V下进行凝胶电泳70分钟。根据制造商的建议（短方案），使用SYPRO Ruby（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）进行总蛋白分析。对于western blotting，使用半干转移细胞（加利福尼亚州赫拉克勒斯市Bio-Rad）将样品转移到0.2μm PVDF膜（#ISEQ00010，MilliporeSigma，马萨诸塞州伯灵顿）中60分钟。在含5%牛奶的TBS-T中封闭膜20分钟。初级抗体在4°C下培养过夜。然后将斑点漂洗3×5 min。在室温下培养次级抗体1 h。在TBS-T中冲洗印迹4×10 min，并使用荧光（Typhoon Trio Imager，GE Healthcare，Chicago，IL）或化学发光（SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate，#34095，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）成像。如有必要，使用Restore Western Blot剥离缓冲液（#21059，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）进行10分钟的膜剥离。

IF与免疫细胞化学

根据制造商的建议，将盖玻片（#12-548A，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）放置在6孔组织培养板（#62406–161，VWR，Radnor，PA）中，并涂上聚-L-赖氨酸（#P4707，MilliporeSigma，Burlington，MA）。将细胞接种在盖玻片上过夜，以便在固定时达到15%的融合率。据报道，细胞在固定前用250 nM托林处理1至3小时。新鲜16%PFA（#15710，电子显微镜科学，宾夕法尼亚州哈特菲尔德）在1X Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水中用氯化钙和氯化镁稀释至4%（#14080–055，Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆）。用镊子取出盖玻片，放入4%PFA中15分钟。抽吸PFA并用PBS清洗两次（D8537，MilliporeSigma，Burlington，MA）。对于LC3 IF，将细胞转移到含有预冷（−20°C）甲醇的微孔中5分钟。将载玻片返回PBS并清洗2×5分钟。在RT下将载玻片在封闭缓冲液（0.3%Triton X-100，PBS中5%NGS）中封闭1小时，然后在PBS中清洗一次。用材料和方法中其他地方描述的稀释液在5%NGS中稀释初级抗体。在加湿室的副膜上发现75 ul抗体混合物，倒置盖玻片与抗体在4°C下孵育过夜。孵育后，将盖玻片在PBS中清洗3×10 min。将二级抗体在5%NGS中稀释1:500，并将倒置盖玻片与抗体混合物孵育45 min。细胞用1:10000稀释的Hoechst 33342（H3570，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）染色5 min。在PBS中清洗盖玻片4×10 min，并使用Prolong Diamond（P36965，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）将其安装在盖玻片上（#294875X25，Corning，Corning，NY）。

共焦显微镜

荧光图像是使用带有Airyscan探测器的共焦显微镜（LSM880带有Airyscon，Zeiss）和63X PlanAPO油浸物镜（Zeiss，Oberkochen，Germany）获得的，并使用Zeiss Blue软件（蔡司，Obercochen，德国）进行处理。

图像分析

荧光显微镜图像使用围绕pyto_segmenter分析包构建的新开发的Python分析管道进行处理[70]. 首先，识别包含细胞的图像区域。为此，我们首先将高斯分布拟合到来自空场的平滑绿色通道（488nm激发）z堆栈的荧光强度分布。使用这种高斯拟合，我们预测了每个场的平滑绿色通道z堆栈中的每个像素对应于背景（非单元格）或前景（单元格）的概率。我们为每个像素指定了一个第页（背景）<10−5在去除小斑点（体积<100000像素）以消除碎片后，我们使用支持向量机（SVM）分类器从细胞掩模中去除离焦平面，如前所述[71]. 接下来，通过切片-切片相对阈值法从蓝色（DAPI）通道中分割细胞核，然后使用pyto_segmenter包进行分水岭分割。使用分水岭分割法从细胞核种子中分割细胞。细胞边缘被侵蚀，以消除在第页-价值转换。与视野边缘接触的细胞从分析中去除。接下来，使用具有经验确定的Canny边缘检测阈值的pyto_segmenter包在绿色和红色（561 nm）通道中分割puntae。统计其他荧光通道中与物体重叠的点状物和点状物的总数，并以.csv格式保存表格数据。使用R和ggplot2包进行绘图。有关详细信息，请参阅图像分析包。图像分析和数据绘图的脚本可以在https://github.com/deniclab/csth-imaging/tree/pub_version.

样本量估计和实验复制细节

对于显微镜实验，收集了40张图像，并使用分割脚本计算每个样本中的细胞数。细胞计数显示在每个定量的上方。在数据收集之前对样本进行屏蔽，并使用自动脚本进行分析，以消除量化过程中的偏差。复制品代表生物复制品，其中菌株在不同的日子接受相同的制备。

对于测序实验，重复次数（2-4）以S2数据每个复制品都是一个生物复制品，其中的菌株被转染，并在单独的几天内完成整个实验。

对于流式细胞术实验，n个图图例中显示了每个实验；>每个实验使用1000个细胞。

图书馆传播

布鲁内洛文库（双载体系统）购自addgene（品目号73178）。将50 ng文库电穿孔成25μl Endura电竞争细胞（60242-2，Lucigen，Middleton，WI）。收集来自8个电穿孔的细胞，并在37°C的8 ml救援培养基中抢救1 h。8毫升SOC（2%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM-MgCl2，10 mM硫酸镁4将200μl最终溶液涂布在含有50μg/ml羧苄青霉素（共80片）的10cm LB板上。通过稀释系列，估计了5亿个菌落，代表了图书馆7000倍的覆盖面。手动从平板上刮下细胞，并使用GenElute Megaprep试剂盒（NA0600-1KT，MilliporeSigma，Burlington，MA）纯化质粒DNA。

文库慢病毒生成

通过对HEK293T细胞进行脂质感染（Lipofectamine 3000）产生慢病毒，每10 cm平板含有5μg psPAX2（Addgene Plasmid#12260）、1.33μg pCMV-VSV-g（Addgene-Plasmid#8454）和4μg文库载体。根据制造商的规范进行转染。简言之，转染时，低通量HEK293T细胞在OptiMEM+5%FBS培养基中生长至95%融合。转染细胞6小时，然后用新鲜OptiMEM+5%FBS替换培养基。转染后24小时，收集上清液并替换。在转染后48小时，再次收集上清液，与24小时上清液混合，澄清2×1000 g，持续10分钟。使用Macherey Nagel病毒RNA纯化试剂盒（德国杜伦市Macherey-Nagel）纯化病毒RNA。使用Lenti-X qRT-PCR滴定试剂盒（Clontech，Mountain View，CA）定量病毒RNA。使用849拷贝/IFU的值计算病毒滴度，该值来自表达BFP的对照病毒。

转导和细胞生长

对于CRISPR筛选实验，将K562细胞传代以保持细胞密度在500000到200万个/ml之间。细胞在IMDM+10%FBS+青霉素/链霉素+适当的抗生素（急速杀菌素5μg/ml，玉米霉素50μg/ml）中增殖，直到获得2亿个细胞（约8-10天）。对于感染，2亿个细胞被造粒，并重新悬浮在IMDM+10%FBS+8μg/ml聚乙烯中。感染日期为第0天。使用0.4的MOI来最小化每个细胞的多重感染事件。细胞被感染过夜，造粒，并交换到新鲜培养基中。24小时后，细胞分裂，并加入2μg/ml嘌呤霉素。细胞在嘌呤霉素中持续传代。第10天，从嘌呤霉素中取出细胞，第12天，将细胞分类为红色：绿色荧光。将100 M个未分类的细胞造粒并作为输入进行处理。取顶部和底部30%的细胞（基于红绿比）；每种实验条件下都有1亿个细胞被分类。使用FACSAria（Becton Dickinson，Franklin Lakes，New Jersey）或BioRad S3（Bio-Rad，Hercules，CA）分选机进行细胞分选。细胞造粒并在−80°C下储存，直至处理。

CRISPR屏幕处理

根据制造商的说明，使用NucleoSpin Blood XL试剂盒（#740950.1，德国杜伦市马切里纳格尔）从收集的细胞中纯化gDNA。通过PCR扩增基因组整合的sgRNA序列，建立了Illumina测序文库。所有gDNA用于每个PCR。在每个PCR反应中使用8个交错长度的正向引物，以避免在Illumina测序期间出现单模板。反向引物包含独特的条形码，设计用于在Illumina测序期间对单个芯片上的多个库进行测序和区分。每个50μL PCR反应包含0.4μM每个正向和反向引物混合物（Integrated DNA Technologies）、1X Phusion HF反应缓冲液（NEB、Ipswich、MA）、0.2 mM dNTPs（NEB，Ipswich，MA）、40 U/mL Phusion高频DNA聚合酶（NEB）、5μg gDNA和3%v/v DMSO。采用以下PCR循环条件：1X 98°C 30 s；25X（98°C持续30秒，56°C持续30s，72°C持续30ms）；1X 72°C和10分钟。将所得产物混合以获得sgRNA文库。按照DeAngelis及其同事的概述，通过添加0.95X磁珠浆料来选择聚合PCR产物的大小[72]. 使用高灵敏度D1000屏幕胶带系统（安捷伦科技公司，加利福尼亚州圣克拉拉）确认纯化后不存在引物二聚体。使用用于Illumina的NEBNext文库定量试剂盒（NEB，Ipswich，MA）通过qPCR对样品文库进行定量。将四到五个文库汇集到一起，总浓度为10 nM，以便在单个芯片上同时对Illumina进行测序。使用HiSeq 2000或2500系统（Illumina）对这些库进行测序。HiSeq 2000系统使用TruSeq SBS版本3套件（Illumina，San Diego，CA）在高输出运行模式下运行。HiSeq 2500系统使用HiSeq Rapid SBS版本2工具包在快速运行模式下运行（加利福尼亚州圣地亚哥Illumina），或使用HiSeqSBS版本4工具包在高输出运行模式下（加利福尼亚州圣迭戈Illuminia）。按照制造商的建议，使用定制测序和索引引物（Integrated DNA Technologies，Coralville，IA）进行测序。有关引物序列，请参见S4表.

NGS数据分析

使用Cutadapt将NGS的5′端读数修剪为5′-CACCG-3′。MAGeCK（版本0.5.3）的计数函数用于提取每个sgRNA的读取计数。原始读取计数可在S2数据。使用mle函数比较显示红绿比增加和减少的细胞的读取计数。结果包括测试分数和错误发现率。所有beta评分都可以在S3数据在2到4个实验中，对每个tfReporter的每个sgRNA的β得分进行平均。在所有实验中，每个sgRNA的平均读取计数为200到400。，图2)，每个基因的β得分通过ATG9A的β得分标准化。

流式细胞术

分析前，将所有样品制成丸粒，在冷PBS中洗涤1倍，并通过过滤帽管（21008–948，VWR，Radnor，PA）过滤。在LSRII流式细胞仪上收集流式细胞术数据。对FlowJo（俄勒冈州阿什兰市FlowJoLLC）和R的数据进行了分析。使用FlowJo中的BifurGate工具以无偏见的方式确定了种群的生物多样性。所有样本至少采集了1000个细胞。

CLEM公司

对于CLEM，HEK293TTMEM41B公司科或稳定表达GFP-mCherry-LC3的野生型细胞生长在带照片的盖玻片上（宾夕法尼亚州哈特菲尔德电子显微镜科学）。将细胞固定在4%甲醛、0.1%戊二醛/0.1M PHEM（240 mM PIPES、100 mM HEPES、8 mM MgCl）中2用0.1 M PHEM缓冲液清洗盖玻片，并用含1μg/ml Hoechst 33342的Mowiol进行安装。使用蔡司LSM780共焦显微镜（德国耶拿卡尔蔡司显微成像有限公司），利用激光二极管405–30 CW（405 nm）和氩激光多线（488 nm）对细胞进行检查。通过荧光显微镜鉴定感兴趣的细胞；获得了覆盖整个细胞体积的z堆栈（体素大小：83nm×83nm×438nm）。通过拍摄低倍DIC图像，确定了带照片的盖玻片上细胞的相对位置。从物体玻璃上取下盖玻片，用0.1 M PHEM缓冲液清洗，并在2%戊二醛/0.1 M PHEM-中固定过夜。细胞在四氧化锇和氰化钾中后固定，用单宁酸和乙酸铀酰染色，然后逐步脱水到100%乙醇，然后平包埋在Epon中。连续切片（200 nm）在Ultracut UCT超薄切片机（德国威兹拉莱卡）上切割，并收集在formvar涂层的槽栅上。

在200 kV的Thermo Scientific Talos F200C显微镜下观察断面，并使用Ceta 16M相机进行记录。连续切片用于将电子显微照片与X、Y和Z的荧光图像对齐。对于层析照片，图像序列在−60°和60°倾角之间以2°增量拍摄。使用Ceta 16M相机记录单轴序列。使用IMOD软件包，使用加权反投影计算断层图。断层图像的显示、分割和动画制作也使用IMOD软件版本4.9进行[73].

支持信息

S1图。（与相关图1)tf受体自噬报告子的产生和验证。

（A） 本研究中用于表达所有tf蛋白的基因盒示意图。显眼的盒式磁带功能采用彩色编码。下面显示的是以N-末端tf融合表达的ATG因子，其长度、通用名称和RefSeq登录号从左到右列出。所有插入物均位于KpnI限制位置。（B） 表达AAVS1基因座tf表达盒的HEK293T细胞在基础条件下和用250 nM托林处理18 h后通过流式细胞仪进行分析。图中显示红绿比中值、内四分位数（方框区域）以及第10和90百分位数（胡须）。所有样本均归一化为基本红绿比。（C） 表达AAVS位点所示tf蛋白的HEK293T细胞在基础条件下生长或用都灵处理。显示GFP和RFP荧光（任意单位）的流式细胞术痕迹，以单个信号和比率（红：绿）表示。（D） 来源于具有指示基因型的细胞的提取物使用BCA测定法通过总蛋白水平进行标准化，并通过SDS-PAGE进行解析，然后用指示抗体进行IB。（E） 如B部分所述，对来自AAVS1基因座表达tfSQSTM1的野生型和指示型HEK293T敲除细胞进行处理和分析。所有汇总统计的基础数据可在S1数据AAVS1，AAVS同源臂；ATG，自噬相关；牛生长激素多聚腺苷化信号；CAG、CAG启动子序列；绿色荧光蛋白；免疫印迹法；P2A，自切割肽；Puro公司R（右）/BSD公司R（右）、嘌呤霉素或杀囊虫素抗性盒；RFP，红色荧光蛋白；SA，剪接受体；tf，标准荧光。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2007044.s001

（畅通节能法）

S2图。（与相关图3)新型自噬因子作用的确认。

（A–D）共同表达Cas9和指示tfReporter的K562细胞与针对所示基因的单个sgRNA或非靶向sgRNA对照物一起转导。细胞按照图3A。这些数据表示为中热图的一部分图3B.n个>每个5000个电池。（E） 共同表达Cas9和tfLC3的K562细胞用sgRNAs针对指定基因或阴性sgRNA对照转导。图示为GFP和RFP荧光的流式细胞术痕迹（以任意单位表示），既作为单个信号，也作为比率（红：绿）。单元格按照面板A中的方法进行处理和分析。所有汇总统计数据的基础数据可以在S1数据Cas9，CRISPR相关蛋白9；绿色荧光蛋白；RFP，红色荧光蛋白；sgRNA，单导向RNA；tf，标准荧光。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2007044.s002

（畅通节能法）

S3图。（与相关图4)TMEM41B是自噬所必需的。

（A） TMEM41B的预测拓扑。TMEM41B对应于pfam09335（螺旋3-5）的区域用绿色表示。图像是用protter生成的。（B） 通过BCA分析对来自表达所示tf结构的野生型HEK293T细胞的提取物进行标准化，并在4°C下与GFP-trap珠培养1h。样品清洗5次，在1X SDS加载缓冲液中洗脱，然后用SDS-PAGE和IB用指示抗体进行分离。（C） 野生型HEK293T细胞（顶部）或表达内源性TMEM41B并带有N末端GFP11标签（底部）的细胞被表达GFP1-10的慢病毒转导，并通过共焦显微镜进行分析。图示为GFP荧光和calnexin IF的共焦切片显微照片，两者均为单独信号和合并信号。（D） 图示中出现的病变TMEM41B公司科HEK293T细胞。（E） 源自野生型和TMEM41B公司科HCT116细胞通过SDS-PAGE分离，然后用指示抗体进行IB分离。在装载之前，使用BCA分析通过总蛋白对所有样品进行标准化。I和II表示LC3的未修饰和修饰形式。野生型细胞中的蛋白质水平标准化为1。（F） 表达tfSQSTM1的野生型和指示型HEK293T敲除细胞在基础条件下以及用100 nM BafA1或250 nM托林处理18 h后通过流式细胞仪进行分析。图中显示了红绿比中位数、内四分位数（方框区域）以及第10和第90百分位数（胡须）。n个>每个样品4000个细胞。（G） 表达tfLC3的野生型和指示型HEK293T敲除细胞在基础条件下，用100nM BafA1或250nM鸟嘌呤处理18小时后，通过流式细胞术进行分析。图显示红绿比中值、内四分位数（方框区域）以及第10和第90百分位数（须）。n个>每个样本1000个细胞。所有汇总统计的基础数据都可以在中找到S1数据BafA1、Bafilomycin A1；BCA，双钦酸；绿色荧光蛋白；HEK，人胚胎肾；免疫印迹法；微管相关蛋白1轻链3B；SQSTM1，固位体1；tf，串联荧光；TMEM41B，跨膜蛋白41B。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2007044.s003

（畅通节能法）

S4图。（与相关图5)在吞噬细胞成熟之前，如果没有TMEM41B公司.

（A） 野生型和指示型HEK293T敲除细胞用250 nM托林处理3小时或不处理。相应的细胞提取物通过SDS-PAGE进行解析，并用针对指示蛋白质或特定磷酸化位点的抗体分析IB。在加载之前，使用BCA分析将所有样品的总蛋白归一化，并通过监测微管蛋白水平验证均匀加载。I和II表示LC3的未修饰和修饰形式。（B） 检测封闭自噬体的蛋白酶保护试验示意图。脂溶性LC3（LC3-II）显示在自噬体膜上。虚线表示蛋白质水解的LC3。（C） 野生型和指示型HEK293T敲除物在中性粒细胞机械裂解之前用BafA1处理18小时。在通过SDS-PAGE解析之前，按照指示处理相应的细胞提取物，并通过IB用指示的抗体进行分析。I和II表示LC3的未修饰和修饰形式。（C） B.条形图中实验所得蛋白酶保护数据的定量显示了来自≥4个独立实验的每个样本的平均值±SD；第页-值是由一名学生确定的t吨测试**第页< 0.01. 所有汇总统计的基础数据都可以在中找到S1数据.BCA，双茚二酸；HEK，人胚胎肾；免疫印迹法；LC3，微管相关蛋白1轻链3B；TMEM41B，跨膜蛋白41B。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2007044.s004

（畅通节能法）

S5图。（与相关图4)TMEM41B缺失在吞噬细胞成熟之前阻止自噬途径。

（A） 野生型和TMEM41B公司科HEK293T细胞。显微照片的选定区域（白框）显示为IF针对指示蛋白质的单个和合并通道的插图。LC3，洋红；SQSTM1，绿色；合并，白色；赫斯特，蓝色。比例尺：大面板，5μm；小面板，1μm。（B） 显示LC3方法的绘图+/SQSTM1系列+野生型和TMEM41B公司科HEK293T细胞在A部分成像，显示内四分位数（方框区域）、1.5个四分位数范围（胡须）和异常值（点）。样本大小(n个)对于每个样品，都有指示。（C） 提取自野生型并指示HEK293T单敲除和DKO的提取物(TMEM41B公司科/RB1CC1型科)通过SDS-PAGE解析细胞，并通过IB分析指示的蛋白质。I和II表示LC3的未修饰和修饰形式。还显示了用于确认TMEM41B基因敲除的T7内切酶分析的PCR结果。（D） 表达GFP-STX17TM的野生型和指示型HEK293T敲除细胞在共聚焦显微镜前用250 nM托林处理1小时或不处理（模拟）。所示为典型共焦显微照片（作为最大强度投影）。显微照片的选定区域（白盒）显示为内在GFP荧光或IF对指示蛋白质的单一和合并通道的插图。LC3，洋红；STX17，绿色；合并，白色；赫斯特，蓝色。比例尺：大面板，5μm；小面板，1μm。（E） 图中显示了野生型和HEK293T基因敲除细胞中指示点状突起的平均值，在A部分中显示了内四分位数（方框区域）、1.5个四分位数范围（胡须）和离群值（点）。样本大小(n个)对于每个样品，都有指示。所有汇总统计的基础数据都可以在中找到S1数据.DKO，双淘汰赛；绿色荧光蛋白；HEK，人胚胎肾；免疫印迹法；IF，免疫荧光；微管相关蛋白1轻链3B；STX17，突触蛋白17；TMEM41B，跨膜蛋白41B。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2007044.s005

（畅通节能法）

S6图。（与相关图7)TMEM41B的TEM分析科细胞识别未指明（约140nm）的囊泡积聚和未成熟的自噬体膜中间体。

（A） HEK293T分析TMEM41B公司科TEM显示细胞聚集了约140-nm的单膜囊泡簇，来源不明。白色箭头划分出具有代表性的囊泡簇。白色方框表示图像序列中下一个图像的放大区域。由绿色箭头划分的图像序列。显示比例尺。（B） 重建结构的备选视图如所示图7B.每个图像的空间关系（相对于图7B)如插图X、Y、Z坐标（C）所示，HEK293T中GFP+膜结构的替代代表性3D模型TMEM41B公司科表达tfLC3的细胞。白色箭头代表了感兴趣的结构。白色框表示图像序列的下一个图像的放大区域。由绿色箭头划分的图像进程。蓝色，赫斯特33342。绿色荧光蛋白；HEK，人胚胎肾；LC3，微管相关蛋白1轻链3B；透射电镜；TMEM41B，跨膜蛋白41B。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2007044.s006

（畅通节能法）

S7图。（与相关图8)TMEM41B是VMP1的同源物。

（A） 人类（Hs）中Pfam09335蛋白中Pfam 09335区域的比对，酿酒酵母（Sc），以及大肠杆菌（Ec）。TMEM41B中预测的跨膜段显示为黑色条。（B） 指示的tf蛋白表达结构整合在野生型的AAVS1位点，并指示HEK293T敲除细胞。蛋白质水平在SDS-PAGE和IB与所示抗体分离之前通过BCA标准化。使用ImageQuant量化蛋白质水平。AAVS1，腺相关病毒整合位点1；BCA，双钦酸；HEK，人胚胎肾；免疫印迹法；tf，串联荧光；TMEM41B，跨膜蛋白41B；VMP1，液泡膜蛋白1。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2007044.s007

（畅通节能法）

S1数据。所有报告的汇总统计信息的基础值。

所有报告的汇总统计数据的原始数据。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2007044.s008

（XLSX）

S2数据。从所有屏幕读取计数。

每个测序实验的标准化读取计数。有关样本标识，请参阅“read_me”选项卡。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2007044.s009

（XLSX）

S3数据。所有屏幕上的Beta分数。

每个实验的个体贝塔得分按基因列出。对所有重复的β值进行平均并显示出来。平均值的颜色编码从红色（抑制器）到白色（中性）再到蓝色（增强器）。查看给定报告者的每个复制的潜在beta值；单击列顶部的“+”展开所需的列。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2007044.s010

（XLSX）

S1表。sgRNA寡核苷酸。

用于克隆单个sgRNAs的20-核苷酸寡核苷酸（加悬链）列表。寡核苷酸；sgRNA，单导向RNA。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2007044.s011

（XLSX）

S2表。其他寡聚物。

用于T7内切酶分析以确认TMEM41B缺失的寡核苷酸列表，以及用于用GFP第11β链内源性标记TMEM41B的寡核苷酸。绿色荧光蛋白；寡核苷酸；TMEM41B，跨膜蛋白41B。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2007044.s012

（XLSX）

S3表。用于克隆tfReporters的引物列表。

用于将LC3B和受体克隆到tfEmpty的KpnI位点以生成每个tfReporter的引物列表。LC3，微管相关蛋白1轻链3B；tf，标准荧光。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2007044.s013

（XLSX）

S4表。布鲁内洛文库的Illumina引物。

布鲁内洛文库Illumina测序所用引物列表。在PCR扩增之前，将交错的寡聚体合并。相反，每个样品都使用了一个独特的条形码引物。绿色、Illumina P5或P7序列；蓝色，测序引物退火区；下划线，交错；红色，与载体主干互补的区域（用于PCR）；紫色，独特的条形码（6-mer）。寡核苷酸、寡核苷酸。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2007044.s014

（XLSX）

致谢

我们感谢Bauer核心设施的成员为流式细胞术和Illumina测序提供技术支持，感谢B.Huang和J.Weissman提供材料，感谢Ulrikke Dahl Brinch为EM样品制备提供帮助，感谢J.Weisman和A.Murray批判性阅读手稿，感谢Denic实验室的成员提供科学建议。

工具书类

  1. 1Tsukada M，Ohsumi Y.酿酒酵母自噬缺陷突变体的分离和鉴定。FEBS信函。1993年10月25日；333(1–2):169–74. pmid:8224160
  2. 2Thumm M、Egner R、Koch B、Schlumpberger M、Straub M、Veenhuis M等。酿酒酵母自噬细胞突变株的分离。FEBS信函。1994年8月1日；349(2):275–80. pmid:8050581
  3. 三。Harding TM，Morano KA，Scott SV，Klinsky DJ。细胞质到液泡蛋白靶向途径中酵母突变体的分离和表征。细胞生物学杂志。1995年11月；131(3):591–602. pmid:7593182
  4. 4Nakatogawa H、Suzuki K、Kamada Y、Ohsumi Y。自噬机制的动力学和多样性：酵母的教训。Nat Rev Mol细胞生物学。2009年7月；10（7）：458–67。采购订单编号：19491929
  5. 5细川N、佐佐木T、家村S、夏目漱石T、原田T、水岛N。Atg101，一种与Atg13相互作用的新型哺乳动物自噬蛋白。自噬。2009年10月；5(7):973–9. pmid:19597335
  6. 6田毅，李忠，胡伟，任赫，田娥，赵毅，等。秀丽线虫筛选鉴定多细胞生物特有的自噬基因。细胞。2010年6月11日；141(6):1042–55. 采购订单编号：20550938
  7. 7Ropolo A、Grasso D、Pardo R、Sacchetti ML、Archange C、Lo-Re A等。胰酶诱导的空泡膜蛋白1在哺乳动物细胞中触发自噬。生物化学杂志。2007年12月21日；282(51):37124–33. 采购经理编号：17940279
  8. 8Mercer CA、Kaliappan A、Dennis PB。一种新的人类Atg13结合蛋白，Atg101，与ULK1相互作用，对大分子自噬至关重要。自噬。2009年7月；5(5):649–62. pmid:19287211
  9. 9Ge L，Melville D，Zhang M，Schekman R。ER-Golgi中间隔室是自噬体生物发生LC3脂质化步骤的关键膜源。电子生活。2013年8月6日；2:e00947。采购订单编号：23930225
  10. 10Graef M、Friedman JR、Graham C、Babu M、Nunnari J.ER出口位点是物理和功能核心自噬体生物发生成分。分子生物学细胞。2013年9月；24(18):2918–31. 采购订单编号：23904270
  11. 11滨崎M、古田N、松田A、内祖A、山本A、藤田N等。自噬体在ER-mitochondria接触部位形成。自然。2013年3月21日；495(7441):389–93. pmid:23455425
  12. 12Nascimbeni AC、Giordano F、Dupont N、Grasso D、Vaccaro MI、Codogno P等。ER-plasma膜接触位点通过调节局部PI3P合成促进自噬体生物发生。EMBO J.2017年14月；36(14):2018–33. 采购经理编号：28550152
  13. 13Nishimura T、Tamura N、Kono N、Shimanaka Y、Arai H、Yamamoto H等。在富含磷脂酰肌醇合成酶的内质网亚结构域开始形成自噬体。EMBO J.2017年14月；36(12):1719–35. 采购经理编号：28495679
  14. 14Itakura E，Mizushima N.通过哺乳动物Atg蛋白的分级分析对自噬体形成位点的表征。自噬。2010年8月；6(6):764–76. 采购订单编号：20639694
  15. 15Kishi-Itakura C、Koyama-Hnda I、Itakura E、Mizushima N。利用哺乳动物自噬缺陷细胞对自噬体组织进行超微结构分析。细胞科学杂志。2014年9月15日；127（第18部分）：4089–102。采购经理编号：25052093
  16. 16Koyama-Hnda I，Itakura E，Fujiwara TK，Mizushima N。哺乳动物ATG蛋白向自噬体形成位点募集的时间分析。自噬。2013年10月25日；9(10):1491–9. pmid:23884233
  17. 17Dooley HC、Razi M、Polson HEJ、Girardin SE、Wilson MI、Tooze SA。WIPI2通过招募Atg12–5-16L1将LC3与PI3P结合、自噬体形成和病原体清除联系起来。分子细胞。2014年7月17日；55(2):238–52. 采购订单编号：24954904
  18. 18Kihara A，Noda T，Ishihara N，Ohsumi Y。酿酒酵母中两种不同的Vps34磷脂酰肌醇3-激酶复合物在自噬和羧肽酶Y分选中起作用。细胞生物学杂志。2001年2月5日；152(3):519–30. 采购订单编号：11157979
  19. 19Vaites LP、Paulo JA、Huttlin EL、Harper JW。对缺乏ATG8蛋白的人类细胞的系统分析揭示了GABARAPs和CCZ1/MON1调节器C18orf8/RMC1在宏观和选择性自噬流量中的作用。分子细胞生物学。2017年10月16日；MCB.00392-17。
  20. 20Tsuboyama K、Koyama-Hnda I、Sakamaki Y、Koike M、Morishita H、Mizushima N。ATG结合系统对内自噬体膜的降解很重要。科学。2016 25;354(6315):1036–41. 采购订单编号：27885029
  21. 21Nguyen TN、Padman BS、Usher J、Oorschot V、Ramm G、Lazarou M.Atg8家族LC3/GABARAP蛋白对PINK1/Parkin有丝分裂和饥饿期间的自噬体融合至关重要，但对自噬体形成至关重要。细胞生物学杂志。2016年12月19日；215(6):857–74.
  22. 22Stolz A、Ernst A、Dikic I。选择性自噬中的货物识别和贩运。自然细胞生物学。2014年6月；16(6):495–501. pmid:24875736
  23. 23Kimura S，Noda T，Yoshimori T。用新型报告蛋白串联荧光标记LC3剖析自噬体成熟过程。自噬。2007年10月；3(5):452–60. pmid:17534139
  24. 24Pankiv S、Clausen TH、Lamark T、Brech A、Bruun J-A、Outzen H等。p62/SQSTM1直接与Atg8/LC3结合，以通过自噬促进泛素化蛋白聚集体的降解。生物化学杂志。2007年8月17日；282(33):24131–45. 采购经理编号：17580304
  25. 25Doench JG、Fusi N、Sullender M、Hegde M、Vaimberg EW、Donovan KF等。优化sgRNA设计，以最大限度地提高CRISPR-Cas9的活性并最小化其离靶效应。国家生物技术。2016年2月；34(2):184–91. 电话：26780180
  26. 26Li W，Xu H，Xiao T，Cong L，Love MI，Zhang F，et al.MAGeCK能够从基因组规模的CRISPR/Cas9敲除筛选中稳健地鉴定关键基因。基因组生物学。2014;15(12):554. pmid:25476604
  27. 27Li W，Köster J，Xu H，Chen C-H，Xiao T，Liu JS等。使用MAGeCK VISPR对CRISPR屏幕进行质量控制、建模和可视化。基因组生物学。2015年12月16日；16:281. 采购订单编号：26673418
  28. 28Nishida Y、Arakawa S、Fujitani K、Yamaguchi H、Mizuta T、Kanaseki T等。Atg5/Atg7非依赖性替代性巨自噬的发现。自然。2009年10月1日；461（7264）：自然08455。
  29. 29Ra EA、Lee TA、Won Kim S、Park A、Choi HJ、Jang I等。TRIM31促进肠细胞中Atg5/Atg7非依赖性自噬。国家通讯社。2016年5月24日；7:11726. 采购订单编号：27216961
  30. 30Chang T-K、Shravage BV、Hayes SD、Powers CM、Simin RT、Harper JW等。Uba1在Atg7-和Atg3-独立自噬中的作用。自然细胞生物学。2013年7月21日；15（9）：ncb2804。
  31. 31Jackson MR、Nilsson T、Peterson PA。鉴定内质网中跨膜蛋白保留的共识基序。EMBO J.1990年10月；9(10):3153–62. 采购订单编号：2120038
  32. 32Itzhak DN，Tyanova S，Cox J，Borner GH。蛋白质亚细胞定位的全局、定量和动态映射。电子生活。2016年6月9日；5:e16950。电话：27278775
  33. 33Hara T、Takamura A、Kishi C、Iemura S-I、Natsume T、Guan J-L等。FIP200是ULK相互作用蛋白，是哺乳动物细胞自噬体形成所必需的。细胞生物学杂志。2008年5月5日；181(3):497–510. 采购经理编号：18443221
  34. 34Joo JH、Dorsey FC、Joshi A、Hennessy-Walters KM、Rose KL、McCastlain K等。Hsp90-Cdc37伴侣复合物调节Ulk1-和Atg13介导的有丝分裂。分子细胞。2011年8月19日；43(4):572–85. 采购订单编号：21855797
  35. 35Petherick KJ、Conway OJL、Mpamhanga C、Osborne SA、Kamal A、Saxty B等。ULK1激酶的药理抑制阻断了Rapamycin（mTOR）依赖性自噬的哺乳动物靶点。生物化学杂志。2015年5月1日；290(18):11376–83. 电话：25833948
  36. 36Zhao H，Zhao YG，Wang X，Xu L，Miao L，Feng D，等。Epg5缺陷小鼠表现出选择性神经元易变性。细胞生物学杂志。2013年3月18日；200(6):731–41. 采购经理编号：23479740
  37. 37Polson HEJ、de Lartigue J、Rigden DJ、Reedijk M、UrbéS、Clague MJ等。哺乳动物Atg18（WIPI2）定位于ω-锚定吞噬细胞并积极调节LC3脂质氧化。自噬。2010年5月；6(4):506–22. 电话：20505359
  38. 38Itakura E、Kishi-Itakura C、Mizushima N。发夹型尾锚定SNARE syntaxin 17靶向自噬体，与内切体/溶酶体融合。细胞。2012年12月7日；151(6):1256–69. pmid:23217709
  39. 39Finn RD、Coggill P、Eberhardt RY、Eddy SR、Mistry J、Mitchell AL等。Pfam蛋白质家族数据库：走向更可持续的未来。核酸研究。2016年1月4日；44（D1）：第279-285页。采购订单编号：26673716
  40. 40Calvo-Garrido J、Carilla-Latorre S、Lázaro-Dieguez F、Egea G、Escalante R.液泡膜蛋白1是器官生物发生、蛋白质分泌和发育所需的内质网蛋白。分子生物学细胞。2008年8月；19（8）：3442–53。采购经理编号：18550798
  41. 41赵YG，陈毅，缪G，赵H，瞿W，李D，等。ER-Localized Transmembrane Protein EPG-3/VMP1调节SERCA活性以控制ER-Isolation膜接触形成自噬体。分子细胞。2017年9月21日；67（6）：974–989.e6。pmid:28890335
  42. 42袁伟（Yuan W）、塔特尔（Tuttle DL）、史义杰（Shi YJ）、拉尔夫（Ralph GS）、邓恩（Dunn WA）。毕赤酵母中葡萄糖诱导的微自噬需要磷酸果糖激酶的α亚单位。细胞科学杂志。1997年8月；110（第16部分）：1935年至1935年。
  43. 43Sakai Y、Oku M、van der Klei IJ、Kiel JAKW。Pexophagy：过氧化物酶体的自噬降解。Biochim Biophys Acta BBA-Mol Cell Res.2006年12月；1763(12):1767–75.
  44. 44Mukaiyama H、Oku M、Baba M、Samizo T、Hammond AT、Glick BS等。Paz2和13种其他PAZ基因产物在微吞噬过程中调节过氧化物酶体的液泡吞噬。基因细胞吞噬Mol细胞机制。2002年1月；7(1):75–90.
  45. 45Titorenko VI，Keizer I，Harder W，Veenhuis M.酵母Hansenula polymorpha中过氧化物酶体选择性降解受损突变体的分离和表征。细菌杂志。1995年1月；177(2):357–63. pmid:7814324
  46. 46Sun L-L，Li M，Suo F，Liu X-M，Shen E-Z，Yang B等。裂解酵母交配基因的全球分析揭示了新的自噬因子。公共科学图书馆-遗传学。2013年8月8日；9（8）：e1003715。采购订单编号：23950735
  47. 47Zaffagnini G，Martens S.选择性自噬机制。分子生物学杂志。2016年5月8日；428（9，A部分）：1714–24。
  48. 48DeJesus R、Moretti F、McAllister G、Wang Z、Bergman P、Liu S等。功能性CRISPR筛查确定ufmylation途径是SQSTM1/p62的调节器。电子生活。2016年6月28日；5
  49. 49O’Prey J、Sakamaki J、Baudot AD、New M、Van Acker T、Tooze SA等。CRISPR/Cas9在自噬研究中的应用。方法酶制剂。2017;588:79–108. pmid:28237120
  50. 50Tábara L-C，Escalante R.VMP1建立调节膜接触位点和自噬的ER-微域。《公共科学图书馆·综合》。2016;11（11）：e0166499。采购订单编号：27861594
  51. 51Calvo-Garrido J、King JS、Muñoz-Braceras S、Escalante R.Vmp1在盘基网柄菌自噬体形成过程中调节PtdIns3P信号。Den交通中心。2014年11月；15(11):1235–46.
  52. 52Tenenboim H、Smirnova J、Willmitzer L、Steup M、Brotman Y。VMP1缺陷衣原体表现出严重的细胞形态异常和胞质分裂紊乱。BMC植物生物学。2014年5月6日；14:121. 采购订单编号：24885763
  53. 53Morita K、Hama Y、Izume T、Tamura N、Ueno T、Yamashita Y等。全基因组CRISPR筛查将TMEM41B确定为自噬体形成所需的基因。细胞生物学杂志。2018年8月9日；217(11):3817–3828. 采购订单编号：30093494
  54. 54Moretti F、Bergman P、Dodgson S、Marcellin D、Claerr I、Goodwin JM等。TMEM41B是一种新型的自噬和脂质动员调节剂。EMBO代表，2018年9月；19(9).
  55. 55Van Alstyne M、Lotti F、Dal Mas A、Area-Gomez E、Pellizzoni L.Stasimon/Tmem41b定位于线粒体相关内质网膜，对小鼠胚胎发育至关重要。生物化学生物物理研究公社。2018年11月30日；506(3):463–70. 采购订单编号：30352685
  56. 56Doerrler WT，Sikdar R，Kumar S，Boughner LA。古代DedA膜蛋白家族的新功能。细菌杂志。2013年1月1日；195（1）：3-11。采购经理编号：23086209
  57. 57Khafizov K，Staritzibichler R，Stamm M，Forrest LR。使用AlignMe研究LeuT折叠转运蛋白的反向拓扑重复的进化。生物化学。2010年12月21日；49(50):10702–13. 采购订单编号：21073167
  58. 58Sikdar R、Simmons AR、Doerrler WT。DedA膜蛋白家族两个成员突变的大肠杆菌菌株中激活了多包膜应激反应途径。细菌杂志。2013年1月1日；195(1):12–24. 采购订单编号：23042993
  59. 59Kumar S，Doerrler WT。保守DedA家族的成员可能是膜转运蛋白，在大肠杆菌中是耐药性所必需的。抗菌剂化学疗法。2014;58（2）：923–30。采购订单编号：24277026
  60. 60邓Z，Purtell K，Lachance V，Wold MS，Chen S，Yue Z。自噬受体与神经退行性疾病。趋势细胞生物学。2017;27(7):491–504. 电话：28169082
  61. 61Dikic I，Elazar Z。哺乳动物自噬的机制和医学意义。Nat Rev Mol细胞生物学。2018年6月；19（6）：349–64。采购订单编号：29618831
  62. 62Evans TD，Sergin I，Zhang X，Razani B.目标获得：心脏代谢疾病中的选择性自噬。科学信号。2017年2月28日；10（468）：eaag2298。采购订单编号：28246200
  63. 63Lotti F、Imlach WL、Saieva L、Beck ES、Hao LT、Li DK等。一种对电机电路功能至关重要的依赖SMN的U12剪接事件。细胞。2012年10月12日；151(2):440–54. pmid:23063131
  64. 64Asiedu MK、Thomas CF、Dong J、Schulte SC、Khadka P、Sun Z等。肺癌类肿瘤基因组改变影响的途径。《临床癌症研究》2018年1月19日；24(7):1691–1704. 采购订单编号：29351916
  65. 65Wong HH，Kumar P，Tay FPL，Moreau D，Liu DX，Bard F.基因组宽屏幕显示冠状病毒从内切体中退出所需的含缬氨酸蛋白质。《维罗尔杂志》。2015年11月；89(21):11116–28. 采购订单编号：26311884
  66. 66Rusten TE，Stenmark H。ESCRT蛋白如何控制自噬？细胞科学杂志。2009年7月1日；122（第13部分）：2179–83。pmid:19535733
  67. 67Lefebvre C、Legouis R、Culetto E.ESCRT和自噬：内体功能及其以外。Semin细胞开发生物学。2018年2月1日；74:21–8. 采购订单编号：28807884
  68. 68Gibson DG、Smith HO、Hutchison CA、Venter JC、Merryman C.小鼠线粒体基因组的化学合成。自然方法。2010年11月；7（11）：901-3。采购订单编号：20935651
  69. 69Labun K、Montague TG、Gagnon JA、Thyme SB、Valen E.CHOPCHOP v2：下一代CRISPR基因组工程的网络工具。核酸研究，2016年7月8日；44（W1）：W272–276。采购订单编号：27185894
  70. 70Weir NR、Kamber RA、Martenson JS、Denic V.AAA蛋白Msp1介导过氧化脂质体膜上多余尾锚定蛋白的清除。电子生活。2017年9月14日；6:e28507。采购订单编号：28906250
  71. 71徐鹏，陈伯英。模糊图像检测与分类。摘自：第14届多媒体建模进展国际会议论文集。柏林，海德堡：斯普林格·弗拉格；2008年，第277-286页。（2008年3月）。
    • 72DeAngelis MM，Wang DG，Hawkins TL。PCR产物分离的固相可逆固定化。《核酸研究》，1995年11月25日；23(22):4742–3. pmid:8524672
    • 73Kremer JR、Mastronarde DN、McIntosh JR。使用IMOD对三维图像数据进行计算机可视化。结构生物学杂志。1996年2月；116（1）：71–6。pmid:8742726