J癌症2017年；8(11):2018-2025. doi:10.7150/jca.18683这个问题 引用

研究论文

PD-L1表达与FOXP3+调节性T细胞浸润软组织肉瘤和患者预后不良相关

易阙¹、魏晓¹、关元祥²、姚亮²，舒美颜^三、陈霍英¹，李巧巧⁴，徐步书¹、周志伟²，Xing Zhang¹

1.中国广州市东风东路651号中山大学肿瘤中心华南肿瘤国家重点实验室肿瘤医学黑色素瘤和肉瘤科，肿瘤医学协同创新中心，邮编510060
2.中国广州市东风东路651号中山大学肿瘤中心肿瘤医学协同创新中心华南肿瘤国家重点实验室胃肠外科，邮编510060
3.中国广州市东风东路651号中山大学肿瘤中心肿瘤医学协同创新中心华南肿瘤国家重点实验室病理科，邮编510060
4.中国广州市东风东路651号中山大学肿瘤中心肿瘤医学协同创新中心华南肿瘤国家重点实验室放射肿瘤科510060

✉ 通讯作者：张兴org.cn；电话：86-020-87343629；传真：86-020-87342021

摘要

背景：程序性死亡配体-1（PD-L1）在抗肿瘤免疫中通过不同途径发挥免疫反应的负介质作用。最近的研究表明，PD-L1在调节性T细胞（Tregs）的功能中起着关键作用。尽管FOXP3+Tregs浸润和PD-L1表达增加在一些癌症中已被发现，但它们与软组织肉瘤的相关性尚不清楚。

方法：我们纳入了163例软组织肉瘤患者，这些患者自2000年至2010年在中国广州中山大学肿瘤中心被诊断并进行了广泛根治性切除。用免疫组织化学方法检测PD-L1和FOXP3的表达。研究了其表达与临床病理特征的相关性。

结果：在163例STS样本中，19例（11.7%）表现出PD-L1阳性，41例（25.2%）表现出高FOXP3+Treg浸润。STS中PD-L1表达与FOXP3+Treg浸润之间存在显著相关性（r=0.450，p<0.001）。在单变量分析中，PD-L1的表达与高肿瘤分级和患者年龄显著相关，而肿瘤浸润性Tregs中FOXP3+的存在与患者年龄、高肿瘤分期、高肿瘤分级及肿瘤深度显著相关。多变量分析显示PD-L1和FOXP3是与OS和DFS显著相关的独立预后指标。

结论：我们的研究表明，PD-L1和FOXP3+Tregs可能协同促进软组织肉瘤肿瘤的免疫逃逸。阻断PD-L1/PD-1并同时清除Tregs的联合策略可能有助于提高这些患者的治疗效果。

关键词：软组织肉瘤，PD-L1，FOXP3+，预后

介绍

软组织肉瘤（STS）是一组罕见的间叶起源肿瘤，约占人类所有恶性肿瘤的1.5%[1]. STS的主要治疗包括手术切除加或不加辅助放疗；然而，局部复发和转移的5年概率仍然很高[2,三]. 对常规化疗和放疗的反应各不相同。一些亚型对常规化疗和放射治疗敏感，而其他亚型则具有很强的耐药性。迄今为止，免疫治疗被认为是个体化医学中最重要的方法，最近在黑色素瘤、肺癌和肾细胞癌方面取得了巨大成功[4-6]. 了解免疫学与肉瘤的关系可能会揭示免疫疗法在肉瘤治疗中有效应用的潜力。

PD-L1（也称为B7-H1）是B7家族的一个成员。PD-L1在免疫活性细胞如T细胞、B细胞、树突状细胞（DCS）和巨噬细胞上表达[7]. 研究表明，肿瘤中PD-L1的过度表达可抑制T细胞的活化和增殖，同时诱导T效应细胞的凋亡，从而导致免疫反应降低和对癌症的保护性免疫功能受损[8,9]. 因此，PD-L1在抗肿瘤免疫中通过各种途径发挥免疫反应的负介质作用。最近，PD-L1的表达已被研究用于预测几种癌症的临床反应[10-12]. 然而，其表达及其对STS患者预后的影响尚未得到很好的研究，并且仍存在争议[13,14].

调节性T细胞（Tregs）是T淋巴细胞的一个亚群，具有抑制效应T淋巴细胞增殖和细胞因子分泌的能力。这种独特的CD4+辅助T细胞亚群以CD4+CD25+表型为特征。FOXP3是一种叉头螺旋转录因子，似乎在Tregs的发育和控制中起主调节器的作用[15,16]被认为是Tregs最特异、最可靠的表面标志[17]. 此外，Tregs在许多人类肿瘤中被发现，被认为是人类恶性肿瘤的生物标志物和预后因素[18,19]

PD-L1已被证实在Tregs的开发和功能维护中发挥关键作用。Francisco证明PD-L1可以通过将原始CD4 T细胞转化为iTreg细胞来抑制T细胞反应，这表明PD-L1在调节诱导的T reg（iTreg）细胞发育和维持iTreg细胞功能方面具有关键作用[20]. Wang等人证明，在肿瘤诱导的Treg转化模型中，阻断PD-L1信号可消除诱导作用体内[21]. 尽管在胃癌、结直肠癌和乳腺癌患者中有FOXP3+Tregs浸润和PD-L1表达的报道[22-24]，它们与软组织肉瘤的关系尚未评估。

在本研究中，我们首先探讨了163例软组织肉瘤患者PD-L1和FOXP3+Tregs之间的相关性，并进一步研究了它们与临床病理特征的相关性。然后，我们评估了PD-L1和FOXP3+Tregs这两个因子在软组织肉瘤中的预后价值。

材料和方法

患者和临床信息

我们纳入了2000年至2010年在中国广州中山大学肿瘤中心诊断并进行广泛根治性切除的163例软组织肉瘤患者。每位患者都获得了书面知情同意书。中山大学癌症中心IRB医学伦理委员会给予伦理批准。对患者进行了1-176个月的随访，中位数为75个月，手术时患者的中位数年龄为39岁（范围为5-77岁）。没有患者接受过术前化疗或放疗。29名患者（17.8%）接受了辅助化疗，64名患者（39.3%）接受了辅助放射治疗。以阿霉素为基础的联合化疗方案主要用于术后化疗患者。IV期疾病和单个可切除转移的患者符合手术条件。疾病分期根据美国癌症联合委员会（AJCC）7进行分类^第个版本和肿瘤根据法国癌症中心联合会肉瘤组分级系统进行分级。

肿瘤组织的免疫组织化学染色

肿瘤组织用福尔马林固定，石蜡包埋。对标本的石蜡包埋的4-mm厚切片进行免疫组织化学染色。每个部分用二甲苯进行脱蜡和复水，并用分级酒精清洗。使用EDTA缓冲液（pH 9.0）进行抗原回收2.5分钟。将切片与PD-L1（CST，E1L3N，单克隆，1:100稀释）、FOXP3（Abcam，ab20034，单克隆）的一级抗体在4℃孵育16 h然后将切片与羊抗兔和小鼠免疫球蛋白（DAKO）二级抗体分子孵育。底物体系含有1-5%的3,3'-二氨基联苯胺四氢氯化物。

阳性表达由两位病理学家独立评估。PD-L1阳性定义为>1%的肿瘤细胞（至少100个可评价细胞）显示膜染色。FOXP3+细胞的百分比是通过将每个细胞类型的总数除以每个组织切片中存在的细胞总数来计算的。对于FOXP3，使用5%的截止值来区分高密度细胞和低密度细胞。

统计分析

所有分析均使用SPSS统计软件包进行（SPSS统计17.0）。使用χ2或Fisher精确检验评估临床和组织病理学参数与PD-L1表达或FOXP3表达之间的相关性。通过PD-L1阳性和FOXP3阳性，采用Kaplan-Meier法和log-rank检验估计DFS和OS的分布。根据Cox分析估计的危险比（HR）被报告为相对风险，具有相应的95%置信区间（CI）。采用Spearman秩相关检验评估PD-L1表达与FOXP3+Treg浸润和临床病理特征的相关性。所有测试都是双面的P（P）小于0.05的值被认为具有统计学意义。

结果

PD-L1表达与FOXP3+Treg浸润及临床病理特征的相关性

PD-L1阳性或FOXP3+Treg浸润表达与STS可变临床病理因素的关系总结见表1和表2PD-L1主要在肿瘤细胞中表达，FOXP3在肿瘤浸润淋巴细胞中表达。图中显示了各种STS中PD-L1或FOXP3免疫染色的典型阳性病例1.

163例STS样本中，19例（11.7%）PD-L1阳性，41例（25.2%）FOXP3+Treg高浸润。STS中PD-L1表达与FOXP3+Treg浸润之间存在显著相关性（r=0.450，p<0.001）（表三). 为了证实我们的发现，我们观察了肿瘤基因组阿特拉斯肉瘤标本中PD-L1的表达和FOXP3 mRNA水平的表达，发现PD-L1表达与FOXP3表达相关（斯皮尔曼秩相关系数为0.38，p<0.001；图4)

PD-L1的表达与高肿瘤分级显著相关，患者的年龄，而肿瘤浸润FOXP3+Tregs的存在与患者的年龄、高肿瘤分期、高肿瘤分级和肿瘤深度显著相关（表2).

PD-L1表达和FOXP3+Treg浸润对预后的意义

单变量分析显示PD-L1的表达或FOXP3+Tregs的浸润与OS和DFS显著相关（图2，表4). PD-L1的表达预示着更短的OS（HR:3.101，95%CI:1.570-6.125，p=0.001）和DFS（HR:2.575；95%CI:1.493-4.442，p=0.01）（表4). FOXP3+Tregs肿瘤内高浸润也预示着OS较短（HR:2.259；95%CI:1.249-4.084；p=0.007）和DFS较短（HR:1.587，95%CI:1.015-2.483，p=0.043）（表4). PD-L1/FOXP3也与OS和DFS显著相关（图2，表4). PD-L1-/FOXP3-、（PD-L1+/FOXP3-或PD-L1-/FOXP3+）和PD-L1+/FOXP3+组的五年总生存率分别为82.9%、65.8%和53.3%，而PD-L1-/FOXP3-、（PD-L1+/FOXP3-或PD-L1-/FOXP3+）和PD-L1+/FOXP3+组的五年无病生存率分别为55.0%、21.7%和13.3%。

当对STS患者亚型组进行额外分析时，未分化多形性肉瘤患者中PD-L1表达、FOXP3+Tregs浸润和PD-L1/FOXP3与OS显著相关（图三). 在单变量分析中，肿瘤分级、肿瘤大小、肿瘤深度等因素与OS和DFS均显著相关。

然后，我们对OS和DFS进行了多变量分析，包括患者年龄、性别、肿瘤分级、肿瘤大小、肿瘤部位、肿瘤深度、肿瘤分期、辅助化疗、辅助放疗和PD-L1/FOXP3表达模式等变量。多变量分析显示肿瘤分级、肿瘤大小和PD-L1/FOXP3表达模式是与OS显著相关的独立预后指标。对于DFS，肿瘤分级、肿瘤深度和PD-L1/FOXP3表达模式是独立的预后指标（表5). 在多变量分析中，PD-L1阳性且FOXP3+浸润高表达的样本与PD-L1阴性且FOXP3+Tregs低表达的样本相比，OS（HR:2.693，95%CI:1.014-7.152，p=0.047）和DFS（HR:3.321，95%CI：1.533-7.191，p=0.002）较差（表5).

讨论

肿瘤细胞可以被抗原特异性T细胞识别和攻击。PD-L1是一种共抑制分子，通过与受体PD-1结合在诱导癌细胞免疫逃逸中发挥关键作用[25]. 最近，PD-L1被认为是各种恶性肿瘤不良临床结果的预测因子[26-28]. 程序性死亡-1（PD-1/PD-L1）在STS中的作用存在争议。Kim最近报道，在表达PD-L1的STS肿瘤中，高达65%的患者预后较差，疾病进展更为严重。这些发现表明PD-L1染色可能是一种可行的预后生物标志物，并建议使用抗PD-1治疗作为一种有效的治疗策略[13]. 然而，D’Angelo报告称，在12%的肿瘤中发现PD-L1肿瘤表达，其中大多数是胃肠道间质瘤（GIST）[14]. 此外，与Kim等人的工作相反，PD-L1肿瘤表达与侵袭性特征或临床结果无关。

在我们的研究中，我们收集了额外的样本（163），并使用全组织切片进行了可靠的免疫组织化学观察。我们在11.7%的样本中观察到PD-L1的表达，并发现与临床结果显著相关。我们研究的大多数标本是转移前的原发肿瘤；因此，肿瘤免疫微环境可能不同于其他研究。此外，我们分析的子类型是不同的和异质的，这表明了不同的结果[29,30].

大量证据表明PD-L1/PD1通路与免疫微环境的维持相关。通过实时定量RT-PCR研究了骨肉瘤中PD-L1的表达，这表明PD-L1高表达与TIL的存在有关（p=0.01）[31]. 一些研究表明，PD-L1在维持iTregs在某些自身免疫性疾病中的功能方面发挥着关键作用，但在癌症中却没有。例如，PD-L1被发现上调FOXP3表达并调节信号分子，这些信号分子对原始T细胞转化为Treg细胞至关重要[32-34]. 同一研究表明PD-L1的表达与FOXP3的表达相关，提示PD-L1表达结合FOXP3表达可能是STS的独立预后指标。如我们所见，我们的研究首次显示了肉瘤细胞中PD-L1表达与FOXP3+Treg浸润的相关性。此外，我们的结果首次表明PD-1/PD-L1信号通过调节软组织肉瘤中Tregs在免疫抑制中发挥重要作用。尽管PD-1通路先前已被报道与Tregs的发育和功能相关[35,36]，精确的机制仍需阐明。

由于FOXP3+Tregs和PD-L1可以对抗抗肿瘤免疫反应，因此可以开发一种基于Tregs耗竭和PD-L1抑制的联合策略，以提高对软组织肉瘤的治疗效果。植入性纤维肉瘤小鼠模型的临床前研究表明抗PD-1治疗具有抗肿瘤活性[37]. 利用pembrolizumab对晚期骨和软组织肉瘤患者进行抗PD-1单药治疗的开放标签II期试验（SARC028）将是探索抗PD-1治疗作用的第一个临床试验，目前正在进入患者登记阶段。Ipilimumab是一种作用于抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）的药物，有助于减少调节性T细胞。对表达NY-ESO-1的晚期滑膜肉瘤患者进行了伊普利单抗II期初步研究[38]. 由于累积缓慢和缺乏免疫反应，该试验提前停止。值得注意的是，该结果可能被解释为当使用免疫检查点抑制剂时，RECIST可能不是最佳标准。此外，也许仅仅抑制CTLA-4不足以引起抗肿瘤反应，但与其他治疗方法结合可能会有所不同。

总之，我们发现PD-L1和FOXP3在软组织肉瘤预后不良的患者中均呈高表达。综合评估发现，PD-L1阳性表达和FOXP3+Treg高浸润的患者预后最差。因此，阻断PD-L1/PD-1轴并同时清除Tregs的联合策略可能有助于提高这些患者的治疗效果。

致谢

本研究得到了国家科学基金项目（No.81372887）和（No.81572403）、国家基础研究计划项目（No.2013CB910500）和广东省科技计划项目（No 2013B02180167）的支持。

竞争性利益

我们声明没有利益冲突。

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通讯作者：张兴org.cn；电话：86-020-87343629；传真：86-020-87342021

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收到日期：2016年12月9日
2017-4-1接受
2017年7月5日发布

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