引言
用细针构建组织阵列(TA)活检标本具有挑战性,以前从未有过在前列腺癌中进行。TA是一种成熟的技术,将基础研究与临床应用相结合成为重要的翻译研究工具(1,2).该工具已被证明在提供高吞吐量方面是有效的在一张幻灯片中分析数百个组织标本,而保持统一的实验条件和存在具有成本效益。从多个患者获得的组织样本为同时以相同的方式处理。组织阵列能够识别和验证功能和生理和病理生物学事件的临床意义关于基因表达失调、基因组畸变和通过探索表观遗传现象与分子信息与临床病理特征(3–7).这项技术也被应用于前列腺癌研究(8–10).
当常规组织阵列(CTA)块构建,需要在“捐赠者”块中冲孔组织芯在将块转换为“接收方”块之前。捐赠者块需要足够的组织才能被冲压出来,并且许多是外科手术病理标本,尤其是针状活检标本材料有限,不适合CTA施工。这个排除在试验研究和进一步研究之外的结果选择偏差。针活检标本可能代表从患者身上采集的样本给药前的晚期/转移性癌症治疗和/或放射治疗。我们之前报告了这些发现去势抵抗的常规免疫组化研究前列腺癌使用前列腺针活检标本是因为组织标本可以通过经直肠诊断获得仅超声引导活检(11–13).在这些研究中,我们被要求对每个幻灯片至少进行一次染色患者对每种分子进行检查。
在这种情况下,我们开发了一种新的方法,称为螺旋阵列(SA),其中每个TA核心由一个卷绕组织层作为供体水平切片块,未作为垂直气缸芯冲孔(14). 因为整个路段在SA中表示,由于组织异质性导致的取样偏差为大大减少了。使用针活检标本构建SA在我们的上一次报告(14).从前列腺穿刺活检标本构建SA是具有挑战性,因为前列腺组织比乳腺癌组织。我们在此详细描述了该结构以及使用针头生物检TA(SA的一种形式)在前列腺癌研究中。我们还评估了前列腺癌根治术的已知预后分子标志物,包括Ki-67(10,15,16),第53页(10,16–18)和bcl-2(17,19–21),确认SA作为翻译新工具的潜力前列腺癌的研究。
材料和方法
患者选择
这项研究共包括58名日本患者被诊断为临床局部或局部根据分期程序判断晚期前列腺癌在我们的机构执行,包括指直肠检查,经直肠超声检查,血清前列腺特异性抗原测量、盆腔计算机断层扫描、磁共振成像和/或骨骼扫描。患者的特点是如所示表一.的平均年龄患者年龄为68.0±4.86(平均值±标准差)岁。这个平均初始血清前列腺特异性抗原水平为24.0±25.3ng/ml(平均值±标准偏差)。患者随后接受根治性前列腺切除术和双侧盆腔闭孔窝内外淋巴结切除术1983-2008年间的髂骨区域。随访中位数为80.9个月(8.0–195.8,最小值)。局部晚期疾病患者接受新辅助雄激素剥夺。患者患有前列腺癌根治术标本手术切缘阳性接受前列腺床辅助外放射治疗和/或辅助雄激素剥夺。疾病进展定义为前列腺特异性抗原水平增加至>0.2 ng/ml或临床进展。
| 表一。的背景特征患者。 |
表一。
的背景特征患者。
特点 | n个 |
---|
年龄 | |
≤69 | 36 |
≥70 | 22 |
初始前列腺特异性抗原(ng/ml) | |
≤10 | 17 |
10.1–20 | 16 |
>20.1 | 20 |
未知 | 5 |
临床T期 | |
T1c类 | 12 |
T2段 | 20 |
T3航站楼 | 26 |
格里森活组织检查分数 | |
6 | 4 |
7 | 23 |
8 | 16 |
9–10 | 15 |
新辅助雄激素剥夺,剥夺 | |
负极 | 32 |
+ | 26 |
佐剂雄激素剥夺,剥夺 | |
− | 33 |
+ | 25 |
助剂放射治疗 | |
− | 39 |
+ | 19 |
第N页一 | |
− | 53 |
+ | 5 |
胶囊状贯穿件,贯穿件一 | |
− | 28 |
+ | 30 |
精囊入侵一 | |
− | 46 |
+ | 12 |
阳性外科手术边缘一 | |
− | 30 |
+ | 28 |
Ki-67染色指数(%) | |
0–9 | 30 |
≥10 | 18 |
第53页 | |
−, ± | 53 |
+ | 5 |
bcl-2基因 | |
−,±, + | 50 |
++ | 8 |
螺旋阵列的构造(图1)
一个容纳58个卷芯的螺旋阵列块取自前列腺腺癌病例。我们选择了福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)块固定前列腺使用根治术患者的前列腺穿刺活检富山大学病理档案中的前列腺切除术日本富山市医院。病理结果,包括前列腺穿刺活检和根治性前列腺切除术中的Gleason分级样本,根据日本通用规则进行评估前列腺癌的临床和病理研究(第4版,2010年),包括第五版TNM分类(1997). 针活检标本是随机获得的使用自动活检枪和经直肠超声检查下的18号(1.2mm)针头指导。大体上,活检包括10个外围区域。将试块表面加热至~40°C,并且30-μ使用标准切片机切割m厚切片。A类部分癌细胞区域被切除。从石蜡块中的抗原保存原来的积木被丢弃了。修剪过的组织切片在35°C下加热,压平并置于绿色中间页,共20页μ厚度和平面为m石蜡切片100μ厚度为m普通平面石蜡块(Wako,大阪,日本)。融化将温度设定为64°C。然后,组织切片,连同将石蜡板卷成纸巾卷并切割成SA处理器(樱花Finetek日本、东京、日本)。此过程产生>100片4-μm厚截面。子圆柱体在中心被切割没有进一步的偏差。每个亚圆柱形卷筒垂直插入商用组织支架由20个丙烯腈/丁二烯/苯乙烯聚合物制成的盒式磁带每个孔直径为3 mm(日本樱花Finetek)。这个塑料盒放在金属模具上(樱花FinetekJapan),其中模具的底表面覆盖有双面胶带。插入的边缘亚圆柱形卷轴粘附在胶带上。石蜡熔化(石蜡蜡II60,Sakura Finetek Japan)在65°C时倒入用盒式磁带重新埋入卷好的纸巾。此步骤之后是冷却期。最后,拆除模具和粘合剂后胶带,SA块在4μ米。
Ki-67、p53和bcl-2免疫组化染色(图2)
免疫组织化学染色采用4-μ如前所述,每个试块的m厚试样描述(7). 简单地说,以下是切片和脱蜡后,将样品加热至95°C在pH 9.0的Tris/EDTA缓冲液中水浴40分钟(目标检索解决方案,日本京都Dako)。Dako自动变速器用于所有免疫组织化学过程。克隆和每种抗体的滴定如下:Ki-67(克隆30-9,1:1,文塔纳),p53(克隆DO-7,1:1,文塔纳)和bcl-2(克隆bcl2/A4,1:50,生物SB)。EnVision公司+系统(Dako)是用于信号增强。反应产物被可视化带DAB+(二氨基联苯胺+)(达科)。这个用迈耶苏木精溶液对细胞核进行轻度复染。所有程序均在室温下进行。核能Ki-67和p53染色为阳性。Ki-67染色指数定义为用目镜网格计数细胞。p53染色强度分为阴性、弱阳性或阳性。Bcl-2染色强度分为阴性、弱阳性、,根据之前的报道,阳性或强阳性计分系统(6,7). 一名研究人员(T.Hori)计算出Ki-67阳性细胞核,对p53和bcl-2进行分级免疫组织学强度,无需事先了解患者的预后相关信息。AMACR和p63染色也用于确认前列腺癌细胞的存在SA(未显示数据)。
统计分析
所有统计分析均使用StatView 5.0软件程序(Abacus Concepts,Inc.,加州伯克利,美国)。学生t检验(连续变量)或Mann-Whitney U测试(分类变量)用于分析相关性几种临床病理因素及其表达分子标记水平。无生化进展生存率、癌症特异性生存率和总生存率根据Kaplan-Meier方法计算利率使用Wilcoxon检验来确定差异。预后使用Cox评估某些因素的重要性比例风险回归模型。概率(P)值<0.05被认为是显著的。该研究获得批准富山大学医院机构审查委员会(#24-13)并符合赫尔辛基宣言。
结果
螺旋阵列的构造
共有253个癌细胞碎片从58份FFPE针活检标本中分离接受根治性前列腺切除术的患者。中位数每个患者的癌症节段为四个(1-8个,最小-最大)。在SA上每位患者确诊的癌症碎片的中位数为4个(1-7,min-max)和224个肿瘤区域碎片(88.5%)组织学证实:5例患者中有7个节段,6例中有6个节段患者,9例患者中有5段,12例患者中4段,3段节段13例,2节段8例,1节段5名患者。AMACR/p63染色也用于确认。因此,卷取纸巾的每个芯部至少包含一个癌区碎片,一个SA块容纳20个核心卷起的纸巾。因此,我们从58例患者的样本。
组织病理学参数和螺旋阵列中的分子标记与存活
在这三个分子中,Ki-67和bcl-2是与格里森评分(GS)显著相关(表二). 单变量分析确定Ki-67、GS和辅助雄激素剥夺为生化进展的重要预测因子Ki-67、bcl-2和GS是肿瘤特异性生存和p53的重要预测因子bcl-2是总生存率的重要预测因子。其中之一显著因素,p53表达被发现为与总生存率、GS和辅助ADT独立相关根据多变量与生化进展相关分析(表III和图3).
| 表二:。分子之间的关联标志物和临床病理参数。 |
表二:。
分子之间的关联标记物和临床病理参数。
临床病理学因素 | P值
|
---|
与Ki-67相比 | 与p53相比 | 与bcl-2相比 |
---|
年龄 | 0.549 | 0.579 | 0.105 |
初始前列腺特异性抗原 | 0.055 | 0.206 | 0.369 |
临床T阶段 | 0.040b | 0.247 | 0.283 |
格里森活组织检查得分≤8或≥9 | 0.0052b | 0.454 | 0.0115b |
第N页一 | 0.146 | 0.476 | 0.078 |
胶囊状贯穿件,贯穿件一 | 0.861 | 0.586 | 0.917 |
精囊入侵一 | 0.113 | 0.236 | 0.210 |
阳性外科手术边缘一 | 0.861 | 0.586 | 0.390 |
bcl-2基因 | 0.0041b | 0.676 | |
第53页 | 0.147 | | |
| 表三。单变量和多变量分析各种参数与生物化学之间的关系无进展(A)、癌症特异性(B)和总生存率(C)在58例前列腺癌患者中前列腺切除术。 |
表三。
单变量和多变量分析各种参数与生物化学之间的关系无进展(A)、癌症特异性(B)和总生存率(C)58例前列腺癌根治术患者前列腺切除术。
A、 生物化学无进展生存
|
变量 | | 单变量分析b
| 多变量分析c(c)
|
人力资源 | 95%置信区间 | P值 | 人力资源 | 95%置信区间 | P值 |
|
年龄 | <70或≥70年 | 2.27 | 0.633–8.14 | 0.345 | | | |
初始PSA | <20或≥20纳克/毫升 | 1.20 | 0.706–2.039 | 0.505 | | | |
临床T阶段 | T1-2或T3 | 1.19 | 0.416–3.394 | 0.854 | | | |
格里森活组织检查分数 | 8或更高 | 6.03 | 2.07–17.5 | 0.0001d日 | 5.87 | 1.688–20.47 | 0.005d日 |
新佐剂自动驾驶仪 | −或+ | 0.904 | 0.312–2.618 | 0.7385 | | | |
佐剂ADT | −或+ | 0.162 | 0.036–0.733 | 0.0095d日 | 0.139 | 0.029-0.661 | 0.013d日 |
助剂放射治疗 | −或+ | 1.06 | 0.354–3.172 | 0.971 | | | |
第N页一 | 0或1 | 0.916 | 0.119–7.068 | 0.951 | | | |
胶囊状贯穿件,贯穿件一 | −或+ | 0.42 | 0.141–1.257 | 0.1032 | | | |
精囊入侵一 | −或+ | 2.42 | 0.811–7.235 | 0.080 | | | |
阳性外科手术边缘一 | −或+ | 0.742 | 0.257–2.140 | 0.828 | | | |
Ki-67染色指数 | <10或≥10% | 4.75 | 1.589–14.18 | 0.0012d日 | 2.11 | 0.607–7.30 | 0.240 |
第53页 | −、±或+ | 2.11 | 0.469–9.492 | 0.261 | | | |
bcl-2基因 | −、±、+或++ | 1.91 | 0.530–6.879 | 0.118 | | | |
|
B、 特定于癌症生存
|
变量 | | 单变量分析b
| 多变量分析c(c)
|
人力资源 | 95%置信区间 | P值 | 人力资源 | 95%置信区间 | P值 |
|
年龄 | <70或≥70年 | 1.92 | 0.268–13.67 | 0.409 | | | |
初始PSA | <20或≥20纳克/毫升 | 0.70 | 0.225–2.178 | 0.615 | | | |
临床T阶段 | T1-2或T3 | 3.43 | 0.352–33.370 | 0.318 | | | |
格里森活组织检查分数 | 8或更高 | 11.5 | 1.158–114.664 | 0.004d日 | 9.05 | 0.427–191.9 | 0.157 |
新佐剂自动驾驶仪 | −或+ | 0.891 | 0.122–6.525 | 0.982 | | | |
佐剂ADT | −或+ | 0.858 | 0.117–6.315 | 0.707 | | | |
助剂放射治疗 | −或+ | 0.668 | 0.069–6.472 | 0.417 | | | |
第N页一 | 0或1 | 4.95 | 0.448–54.604 | 0.194 | | | |
胶囊状贯穿件,贯穿件一 | −或+ | 0.288 | 0.030–2.786 | 0.278 | | | |
精囊入侵一 | −或+ | 3.92 | 0.549–27.944 | 0.086 | | | |
阳性外科手术边缘一 | −或+ | 1.05 | 0.146–7.477 | 0.826 | | | |
Ki-67染色指数 | <10或≥10% | 6.69 | 0.695–64.364 | 0.021d日 | 1.26 | 0.060–26.74 | 0.881 |
第53页 | −、±或+ | 6.45 | 0.583–71.289 | 0.079 | | | |
bcl-2基因 | −、±、+或++ | 19.4 | 2.012–186.521 | 0.0001d日 | 13.8 | 0.938–201.9 | 0.055 |
|
C、 总体生存率
|
变量 | | 单变量分析b
| 多变量分析c(c)
|
人力资源 | 95%置信区间 | P值 | 人力资源 | 95%置信区间 | P值 |
|
年龄 | <70或≥70年 | 0.763 | 0.229–2.546 | 0.068 | | | |
初始PSA | <20或≥20纳克/毫升 | 0.803 | 0.405–1.592 | 0.320 | | | |
临床T阶段 | T1-2或T3 | 1.06 | 0.312–3.596 | 0.656 | | | |
格里森活组织检查分数 | 8或更高 | 1.80 | 0.455–7.127 | 0.187 | | | |
新佐剂自动驾驶仪 | −或+ | 1.12 | 0.347–3.965 | 0.667 | | | |
佐剂ADT | −或+ | 0.925 | 0.232–3.686 | 0.566 | | | |
助剂放射治疗 | −或+ | 0.869 | 0.228–3.315 | 0.154 | | | |
第N页一 | 0或1 | 2.12 | 0.247–18.17 | 0.543 | | | |
胶囊状贯穿件,贯穿件一 | −或+ | 0.586 | 0.174–1.973 | 0.195 | | | |
精囊入侵一 | −或+ | 0.897 | 0.193–4.164 | 0.644 | | | |
阳性外科手术边缘一 | −或+ | 0.913 | 0.260–3.209 | 0.801 | | | |
Ki-67染色指数 | <10或≥10% | 1.25 | 0.364–4.314 | 0.119 | | | |
第53页 | −、±或+ | 12.8 | 2.575–63.726 | 0.0001d日 | 13.3 | 2.635–67.3 | 0.0017d日 |
bcl-2基因 | −、±、+或++ | 2.64 | 0.678–10.25 | 0.019d日 | 2.78 | 0.695–11.11 | 0.148 |
讨论
这是关于TA建设的第一份报告采用前列腺穿刺活检标本。大多数癌段从FFPE块中切下的部分在SA.前列腺分子标记物的免疫组织化学染色癌症显示出具有预测意义的结果根据之前的报道,前列腺癌根治术的结果关于Ki-67的设置(10,15,16),第53页(10,16–18)和bcl-2(17,19–21).这些分子标记通常被用作预后因素用于前列腺癌根治术后的生化进展。在目前的研究,一个单变量分析显示Gleason活检得分、辅助雄激素剥夺和Ki-67染色指数生化进展的预后因素。然而,Ki-67染色指数不能作为独立的预后指标因素。这可能是由于活检Gleason评分和Ki-67染色指数较高Gleason评分的危险比(表二). 作为预测因素肿瘤特异性生存、活检Gleason评分、Ki-67染色指数和bcl-2表达在单变量分析。可能是由于重大关联在这三个因素中,没有一个是独立的多因素分析中的预后因素。作为预测影响总生存率的因素,p53和bcl-2的表达是在单变量分析中发现具有显著性。根据多变量分析显示,只有p53的表达是独立的因子,总生存率的危险比为13.3以前文献中没有报道过。其他变量包括通常对生存很重要;然而,雄激素缺乏和放射治疗会影响结果(22,23).基于这些结果,获得了除此之外,SA还可以提供有价值的信息常规临床病理参数。此外,这个新的该技术有助于使用前列腺针进一步构建TA放射治疗患者的活检标本,局部雄激素缺乏或化疗晚期转移性或去势耐受性前列腺癌他们没有大的手术标本。
我们之前将SA作为新的解决组织异质性的高通量技术(14). 在这份原始报告中,我们证明了这种新的非劣性和优越性技术,允许改进捐赠者的代表性组织,同时保留供体块的结构细节与CTA相比完好无损。此外,形态学比较SA和CTA的特征。我们创建了两个SA25例肺腺癌和50例多发性肿瘤的CTA分析各种器官>1 cm2小于2厘米2.截面测量100-μ使用标准切割m厚用于TA构建的切片机。组织覆盖度通过观察染色范围检查异质性细胞角蛋白7和7的免疫组化强度差异表皮生长因子受体(EGFR)。形态学程度根据准确度测试保存组织病理学诊断和器官类型的预测三位病理学家(董事会认证的外科病理学家)没有参与SA的实际建设在分析之前未向小组成员披露。SA表现出更好的染色范围EGFR强度(异质性)(P=0.01)。准确性水平在SA中预测器官类型的能力明显更高与CTA相比(P=0.047)。另一方面,没有显著的SA和CTA在检测组织学诊断,尽管准确答案的数量是SA较高。因此,结果表明SA为在保存形态方面不亚于普通CTA。
由于SA只使用一个平面组织切片,剩余组织很少的块,不能用于CTA,可以包含在进一步的研究中。此外,多芯针活检样本,如乳腺活检样本或经直肠活检样本前列腺活检标本,如本研究所示常规用于使用常规方法进行CTA施工,符合SA技术。有些组织太薄了垂直取样,因为它们缺乏足够的深度来用作CTA材料。然而,这些活检标本是理想的阵列使用SA技术,因为整个活检样本可以用阵列上的卷轴表示。此过程由启用重新排列石蜡板上的小组织块卷绕前。在这种情况下,乳腺SA检查活检已经完成(14). 最多可以有30个4-mm厚的部分从SA块上切下20个乳腺癌芯针活检试样。评估诊断和针吸活检标本中的预后生物标志物具有重要意义。我们的方法允许维持供体组织块完整性,便于组织样本的收集将促进机构间合作,理想情况下,临床应用。
与此相关的一些限制研究。研究设计是回顾性的,样本量为与其他TA研究相比相对较小。癌症部分只有当它们在针头中的长度超过3毫米时才被收集活检标本。患者队列相对异质因为这项研究包括本地化和本地高级使用或不使用新佐剂或佐剂雄激素剥夺及有无佐剂放射治疗。前列腺切除标本的Gleason分级没有进行分析,因为45%的患者接受了新佐剂治疗雄激素缺乏,组织学分级不适当的。因此,如果研究设计是前瞻性的,采用了更大和更多的同质队列分析包括较小的癌段。不同样本的病理结果不同前列腺穿刺活检和根治性活检前列腺切除术(24,25). 这是选择治疗方式,通常根据活检Gleason评分、临床分期和患者状态。在在此背景下,本研究发现SA中p53的表达成为独立的预后分子标记。这意味着基于核心针的发现探索分子标记活检而非最终病理可能会进一步进行研究。SA技术的另一个潜在批评是由于样品的扭曲形状。然而,我们之前报告过SA更能代表整个肿瘤形态而不是CTA。在那项研究中,结果在统计学上更好SA在识别器官方面比CTA更重要,并且是相同的在预测组织学诊断方面(14). 在本研究中,SA在一个石蜡块中容纳20个岩芯,小于CTA块中观察到的。然而,增加的代表性肿瘤异质性的差异可能会减少多次采样的需要CTA中常规进行的一个供体块的核心其中约600–800个核心由200至300名患者组装而成。使用关于多路复用内核,一些报告表明组织异质性有合理的表现(26,27). 在本研究中,SA没有与CTA相比,与我们之前的研究不同(14). 因此,进一步的研究是需要使用根治性前列腺切除术比较这两种技术试样。
总之,在本研究中,螺旋阵列应用于前列腺癌研究。这是一种新颖的方法用于组织阵列构建,与组织阵列的常规构建,同时保持高通量阵列技术的优势。SA允许手术病理标本的纳入由于材料有限,无法进行研究。这个原始块的破坏程度可能不是问题使用小核心的组织阵列,例如1.2毫米英寸直径,通过前列腺针活检获得本研究。SA可能允许研究人员扩大对全新组织库的调查。我们相信SA有潜力成为一种新的翻译工具前列腺癌的研究。
致谢
J.Fukuoka博士获得研究基金来自Sakura Finetek Japan Inc。
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三。
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