本文中提到：

介绍

足细胞对维持正常至关重要肾小球滤过屏障的功能。几个肾脏疾病，包括微小变化疾病、局灶性节段性疾病肾小球硬化与膜性肾病(1–3),与足细胞损伤有关。因此通过保护足细胞来预防肾脏疾病已经成为一种流行研究课题。

雷公藤吊钩F（TwHF），a广泛使用的中草药，是卫矛科植物多年生类似葡萄的植物。雷公藤多苷（TG），提取从TwHF的根木质部提纯，是活性成分TwHF的。TG具有抗炎和免疫抑制作用，广泛用于治疗自身免疫和炎症疾病，包括类风湿关节炎、系统性狼疮红斑和肾病综合征(4,5).例如，TG对特发性膜性肾病是最常见的成人肾病综合征的病因。细胞的损伤和凋亡足细胞与这种典型的肾脏疾病有关(6–8).在另一项慢性肾脏病（CKD）研究中荟萃分析显示雷公藤制剂治疗显著降低患者的蛋白尿和血清肌酐水平CKD患者(9). 然而，这种治疗效果的机制仍有待研究完全阐明。

在本研究中，嘌呤霉素氨基核苷（PAN）诱导的足细胞损伤模型用于评估其效果TG对足细胞损伤的影响。这项研究旨在验证这一假设TG通过以下途径保护PAN诱导的足细胞损伤磷脂酰肌醇3-激酶上调自噬（PI3K）/AKT途径。

材料和方法

试剂和抗体

TG购自浙江德德制药有限公司（中国浙江；目录号14002219121）。膜联蛋白V凋亡检测试剂盒购自eBioscience，Inc.（San迭戈，加利福尼亚州，美国；猫。编号88-8007）。细胞计数试剂盒-8（CCK-8）从Beyotime生物技术研究所（上海，中国；猫。编号C0038）。氯喹（CQ）购自Sigma-Aldrich（默克公司，德国达姆施塔特；产品目录号C6628）和LY294002购自Selleck Chemicals（Selleck，Houston，德克萨斯州，美国；猫。编号S1105）。本研究中使用的抗体包含抗微管相关蛋白的抗体1A/1B-轻链3（LC3）II（目录号12135-1-AP），第62页（目录号。18420-1-AP）（均来自中国武汉三鹰生物科技有限公司），PI3K[目录号Ab151549；Abcam贸易（上海）有限公司。，中国上海]，AKT（目录号：Sc-5298；圣克鲁斯生物技术，公司，德克萨斯州达拉斯，美国），磷酸化（p-）AKT（目录号AF0908），半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（分类号19677-1-AP）和裂解半胱氨酸蛋白酶-3（类别号。25546-1-AP）（均来自武汉三鹰生物科技有限公司）。

细胞培养和药物治疗

条件永生化分化小鼠足细胞（MPC5）由中国上海生物科学研究所科学院（中国上海）。培养足细胞罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI）-1640中型（目录号。第30809.01B页；HyClone；GE Healthcare Life Sciences，美国犹他州洛根）补充10%胎牛血清（FBS；目录号16000-044；吉布科；Thermo Fisher Scientific，Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆），100 U/ml青霉素G和100 mg/ml链霉素。足细胞是用100 U/ml干扰素-γ在33°C下维持和扩增中等。足细胞获得分化表型时细胞在37°C的“限制条件”下生长。诱导损伤后，用PAN（50µg/ml）持续24小时。不同浓度的TG（0.31、0.63、1.25、2.5、5和10µg/ml），在PAN处理前1 h添加。CQ（20µmol/l）和LY294002（20µmol/l）预处理在PAN处理前1小时执行。

细胞活力测定

使用CCK-8分析测定细胞活力（分类号C0038；贝尤泰姆生物技术研究所）。这个足细胞接种在96个培养皿中，浓度为105细胞/ml。用不同的TG浓度（0.31、0.63、1.25、2.5、5和10µ克/毫升）37°C时，5%CO2TG处理后24小时，10微米在每个孔中加入1个CCK-8，细胞为在33°C下培养1小时。在450 nm处检测吸光度使用微孔板阅读器（Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，马萨诸塞州，美国）。

蛋白质印迹分析

细胞用冰冷的水洗涤三次磷酸盐缓冲液（PBS）并用细胞裂解缓冲液进行裂解（放射免疫沉淀分析；分类号R0010；北京Solarbio中国北京科技有限公司），以及总计提取蛋白质进行westernblot分析。BCA蛋白该试验（Thermo Fisher Scientific，Inc.）用于蛋白质定量。可溶性物质（50µg） 受到用7.0%丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，并转移到硝化纤维素膜的电泳转吸90min使用Trans-Blot SD（加州Hercules生物实验室有限公司，美国）。在室温下用5%的脱脂液堵塞膜牛奶在Tris-buffered生理盐水吐温-20中浸泡1小时，然后在4°C过夜，使用以下主要抗体：抗-LC3II（1:1000），抗p62（1:500）；抗PI3K（1:600）、抗AKT（1:1000）、，抗p-AKT（1:1000）和抗Caspase-3（1:500）。这些膜是然后与辣根过氧化物酶结合山羊孵育抗兔二级抗体（1:1000；目录号A0208；Beyotime生物技术研究所）在室温下放置1小时。以下增强化学发光检测，剥离膜用抗β-肌动蛋白抗体（1:1000，猫。4970号）或抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（1:1000；目录号5174）（均来自CST Biological试剂有限公司，中国上海）。蛋白质水平为确定为蛋白质/β-肌动蛋白或蛋白质/GAPDH与尽量减少样品装载的差异。使用ImageJ软件版本1.8.0–112（美国国家研究院Health，Bethesda，MD，美国）。

细胞凋亡的流式分析细胞术

异硫氰酸荧光素膜联蛋白V细胞凋亡检测试剂盒（BD Biosciences，San Diego，CA，USA）用于分析足细胞凋亡。细胞冷洗两次PBS，其后为1×106195年，细胞被悬置µl Annexin V-APC结合缓冲液。随后将溶液转移到5ml培养管中µ第1页，共页膜联蛋白V和5µ添加1碘化丙啶（PI）；这个将混合物轻轻旋涡并在室内培养15分钟温度（25°C）。随后的流式细胞术分析（BD Biosciences）在1小时内完成。

透射电子显微镜

细胞培养基离心10分钟在714×g和25°C条件下，丢弃上清液固定在2.5%戊二醛中，用分级乙醇脱水，并使用标准实验室程序嵌入Epon 812中。超薄切片（1µm） 随后被切割、安装在镍格栅，柠檬酸铅染色用于传输电子显微镜（JSM-IT300LV；JEOL有限公司，日本东京）。

统计分析

使用SPSS进行所有统计分析19.0软件（IBM SPSS，Armonk，NY，USA）。结果是表示为平均值±标准偏差。组平均值为使用单向方差分析和最小方差分析进行比较独立数据的显著性差异检验。所有P值均为双尾，P＜0.05被认为表明具有统计学显著性差异。

结果

甘油三酯对足细胞的细胞毒性作用

CCK-8和Annexin V/PI分析用于检测TG对培养足细胞的细胞毒作用。这个结果表明，足细胞活性随着增加而下降TG浓度。浓度为2.5µ克/毫升，足细胞活性显著降低(图1A). 同样2.5甘油三酯处理后凋亡细胞增加µ克/毫升(图1B). 否TG对细胞增殖或凋亡的明显影响足细胞的浓度低于2.5µ克/毫升。

图1 甘油三酯对培养细胞的细胞毒性作用足细胞。（A） MPCs细胞计数试剂盒-8检测结果不同TG浓度处理。在TG浓度下2.5µg/ml时，细胞活力显著降低（P<0.01；红色箭头）。（B） MPC的凋亡率不同TG浓度的处理Annexin V/碘化丙啶检测。凋亡细胞百分比TG浓度为2.5µg/ml时显著增加（P<0.001；红色箭头）。数据以平均值±标准表示偏差（n＝3）**P<0.01和***与0µg/ml组相比，P<0.001。MPC、鼠标足细胞；TG、雷公藤多苷。

甘油三酯对PAN诱导的脑损伤的保护作用足细胞凋亡

观察TG对PAN诱导足细胞的影响在本研究中，检测足细胞凋亡治疗后应用流式细胞术和western blot分析PAN和不同浓度的TG在体外实验表明，与对照组相比PAN中凋亡细胞的数量显著增加组（P<0.001）。在PAN+TG组，细胞凋亡被抑制当添加的TG剂量≥0.63时，通过TGµg/ml，比较PAN组中的(图。2安培和B）。裂解caspase-3和caspase-2的水平为western-blot分析也检测到细胞凋亡各组足细胞。如所示图2C–E，劈开的洞穴水平-3与与对照组相比，TG治疗效果显著降低PAN治疗组的裂解caspase-3水平足细胞。

图2 TG对PAN处理足细胞的凋亡。（A） 流式细胞仪斑点图Annexin V和碘化丙啶染色。（B） 条形图显示细胞早期凋亡的百分比。（C）切割型caspase-3和caspase-3in的典型western印迹每组。（D） 条形图，显示半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3。各组之间无显著差异观察。（E） 显示相对表达式的条形图劈开的纸巾-3。裂解的胱天蛋白酶-3的表达显著与对照组相比，PAN组增加在PAN+0.63µg/ml时显著降低TG组和PAN+1.25µg/ml TG组与PAN组。数据表示为平均值±标准偏差（n=3）***与对照组相比P<0.001；##与PAN组相比，P＜0.01和P＜0.001。雷公藤多苷；PAN，嘌呤霉素氨基核苷。

TG通过以下途径保护足细胞免受损伤上调细胞自噬

评估自噬在保护中的作用TG对PAN诱导足细胞损伤的影响足细胞中的自噬标记物LC3II和p62通过PAN、TG和氯喹（CQ），一种广泛使用的自噬抑制剂。如所示LC3II和p62（一种通过自噬降解的蛋白质）的水平路径，自噬在足细胞中被激活TG治疗，CQ治疗抑制(图3).

图3 TG对细胞自噬的影响足细胞。自噬标记物的水平通过蛋白质印迹分析。（A） LC3和p62的代表谱带单个组。条形图显示相对蛋白质LC3II和p62的表达。（B） TG和CQ促进表达足细胞中的LC3II。（C） p62的表达显著降低PAN+TG组和PAN+CQ+TG各组与PAN组和PAN+CQ组。数据表示为平均值±标准偏差（n=3）*P<0.05和***与PAN组相比P<0.001###P<0.001与PAN+CQ组相比。雷公藤多苷；PAN、嘌呤霉素氨基核苷；CQ，氯喹。

Annexin检测足细胞凋亡用PAN、TG和CQ处理后的V/PI。如所示图4，细胞凋亡率足细胞与自噬水平呈负相关。PAN处理诱导的足细胞凋亡被逆转TG处理。添加CQ后，TG的保护作用为抑制。因此，细胞凋亡明显增加观察PAN+CQ+TG组。这些结果表明TG上调足细胞凋亡自噬。

图4 TG保护足细胞免受凋亡通过上调自噬。（A） 流式细胞仪斑点Annexin V和碘化丙啶染色图。（B） 条形图显示个体足细胞的凋亡率组。PAN+TG组足细胞凋亡率降低组和PAN+CQ+TG组，与PAN中的比率进行比较组和PAN+CQ组。数据显示为平均值±标准偏差（n=3）*P<0.05，**与PAN组相比，P<0.01和***P<0.001；#P<0.05，##P<0.01和###与PAN+CQ组相比，P<0.001。TG，雷公藤糖苷；PAN，嘌呤霉素氨基核苷；CQ，氯喹。

自噬体的评估透射电子显微镜

透射电子显微镜用于观察PAN和TG对自噬的影响。如所示图5，在对照组中足细胞膜表面有突起，细胞核为不规则，内质网结构清晰细胞质中可见自噬体。然而，在PAN处理足细胞后，细胞质中含有大量液泡和少量自噬体。自噬体的数量当用TG处理时，足细胞的细胞质增加。

图5 由检测到的自噬体个体足细胞的透射电镜观察组。透射电子检测到自噬体显微镜（放大倍数，×20000）。（A） 大量自噬体对照组足细胞胞浆中可见。（B） 与对照组相比，自噬体的数量在PAN处理的足细胞中显著降低。（C） 与相比对照组自噬体数量明显增加TG处理后增加。（D） 与PAN组相比，TG处理后自噬体的数量增加。雷公藤多苷；PAN，嘌呤霉素氨基核苷。

TG通过激活PI3K III信号通路

III类PI3K抑制剂LY294002用于评估PI3K途径激活在保护性蛋白质印迹分析结果表明：PAN处理降低了p-AKT的水平TG处理。p-AKT水平显著降低LY294002处理(图6A和B） LY294002+PAN和LY29400 2+TG+PAN组。然而，没有AKT水平存在统计学显著差异当用PAN和TG处理足细胞时(图6A和C）。自噬水平标记物LC3II和p62也通过western blot分析测定。PAN治疗也降低了自噬水平通过TG治疗抢救。使用LY294002治疗也会降低足细胞自噬水平(图6A、D和E）。的级别通过Annexin V/PI分析检测足细胞凋亡。TG对PAN诱导足细胞损伤的保护作用是被LY294002治疗抵消(图6F).

图6 TG促进足细胞损伤过程中PI3K信号的自噬。（A）中AKT、p-AKT、LC3和p62蛋白的代表性条带个人团体。（B）水平的定量评估单个组中的p-AKT、（C）AKT，（D）LC3和（E）p62。这个LY294002显著抑制p-AKT的表达。这个p-AKT在TG+PAN和LY294002+TG+PAN组，与PAN中的表达相比组和LY294002+PAN组。TG促进了表达LC3II并降低p62的表达。（F）各组的凋亡率。数据表示为平均值±标准偏差（n=3）**P＜0.01***与对照组相比P<0.001#P<0.05，##与PAN组相比，P<0.01和###P<0.001；&P<0.05和&&P<0.001与LY294002+PAN组相比。TG、雷公藤苷；PAN、嘌呤霉素氨基核苷；磷脂酰肌醇3-激酶；p-，磷酸化；LC3，微管相关蛋白1A/1B-轻链条3。

讨论

先前的研究表明TG具有对各种肾病的治疗效果，包括IgA肾病、糖尿病肾病和膜性肾病。已有报道用自噬激活剂雷帕霉素治疗减少蛋白尿的进展，减轻病理IgA肾病大鼠的病变(10).

足细胞，作为有丝分裂后分化的细胞，一旦受损，显示出有限的再生能力。足细胞损伤可导致明显的蛋白尿，并导致肾小球疾病，始于肾小球硬化和慢性进展，最终导致终末期肾病。这个保护足细胞是最重要的治疗方法之一肾病综合征的靶点。一些研究已经检测TG对足细胞的治疗作用受伤(8,11); 然而，机制仍然是被充分阐明。

在本研究中，经典的PAN诱导的用足细胞损伤模型评价TG对大鼠足细胞损伤的影响足细胞。如之前的研究所示(12)，PAN诱导细胞凋亡足细胞。TG治疗导致足细胞减少细胞凋亡。进一步的研究表明TG治疗有效上调自噬并增加自噬体。此外，PI3K/AKT路径相关的水平在不同组中检测到蛋白质，结果显示TG治疗显著提高了p-AKT公司。这表明PI3K/AKT途径的激活可能在自噬调节和保护中发挥重要作用TG在足细胞损伤中的作用。

自噬，一种主要的细胞内溶酶体降解系统，执行与新陈代谢和细胞器更新。肾保护功能足细胞的自噬主要由清除介导受影响的线粒体和蛋白质聚集体的清除，可能引发炎症和细胞死亡(13). 之前的一项研究表明足细胞足突在小鼠肾单位正常自噬途径的预防(14). 另一项研究表明自噬激活改善足细胞损伤高糖诱导(15). 在目前的研究表明，TG保护足细胞免受凋亡，伴随自噬活性增加，LC3水平的增加和p62的水平(图3和4). TG在传输电子证实自噬上调显微镜检查。如所示图5,足细胞细胞质中自噬体的数量TG处理后细胞数显著增加。

本研究还表明TG治疗后细胞凋亡减少安全浓度范围内的剂量依赖方式(图1和2). 足细胞用不同浓度的TG对细胞凋亡无明显诱导作用在正常足细胞中观察到TG浓度小于2.5微米g/ml，而TG显著抑制PAN诱导的足细胞凋亡。这些结果表明，最佳剂量TG能够改善PAN引起的损伤。CQ，一个众所周知的自噬抑制剂被用来验证TG诱导的自噬。LC3-II和p62显示CQ抑制TG诱导的自噬。TG和CQ提高LC3水平；然而，CQ抑制了这种结合自噬体及其底物蛋白的过程在p62的积累中。此外，当CQ在24小时时抑制PAN组的自噬，早期凋亡显著增加，这可能与随着培养时间的延长。然而，细胞凋亡率TG显著减轻坏死，并伴有自噬激活。据报道，自噬消除功能失调的线粒体以减少细胞色素c（c）激活细胞凋亡(16). 自噬维持通过蛋白质聚集体的消化形成内质网和错误折叠的蛋白质，从而抑制细胞凋亡(17). 未来，调查的目的是研究TG如何上调自噬并防止其足细胞凋亡。

PAN增加了活性氧的生成物种和激活细胞色素c（c）-caspase-9-caspase-3凋亡信号通路(18,19). 天冬氨酸半胱氨酸特异性蛋白酶（caspase）家族在凋亡的执行。它们起着启动器和在细胞凋亡过程中的刽子手。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3，一种典型的效应器caspase负责许多死亡底物和导致细胞死亡(20). 目前的研究表明浓度为1.25µg/ml明显缓解PAN诱导足细胞凋亡，伴随劈开的纸巾-3。这表明抑制caspase-3可能参与TG的抗凋亡作用。

PI3K/AKT信号通路，一种众所周知的细胞生存途径对细胞自噬的调节至关重要和凋亡(21,22). 确定TG介导的抗凋亡药物中的PI3K/AKT信号通路本研究检测了足细胞的磷酸化作用AKT的表达。结果表明PAN下调p-AKT水平，伴随LC3和p62增加，而TG显著上调p-AKT与自噬激活(图6). LY294002，经典PI3K抑制剂，显著下调PI3K、AKT和p-AKT，并抑制足细胞的自噬活性。展望未来，TG显著改善了自噬和减少足细胞凋亡(图6). 这些数据表明PI3K/AKT通路在TG介导的足细胞自噬。在本研究中，没有显著差异在TG处理的细胞中发现总AKT水平和未经处理的细胞。这表明TG促进了AKT磷酸化，而不是促进AKT的形成，当它介导足细胞的自噬时。

总之，本研究的结果表明TG通过细胞凋亡，这种效应是由伴随的自噬激活。PI3K/AKT途径显示为在自噬和凋亡的调节中很重要。这些研究结果为理解TG。除了抗炎作用外，TG还可以减少CKD患者的蛋白尿和血清肌酐水平；的结果目前的研究确定了新的治疗靶点足细胞病和肾小球疾病的治疗。

鸣谢

不适用。

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