结果
兴奋毒性NMDA刺激增加培养神经元PTEN核转位
为了确定兴奋毒性刺激是否会增加PTEN的核转位,我们在培养的皮层神经元中使用NMDA诱导的兴奋毒性方案在体外使用两种独立的神经元死亡分析、核染色和LDH释放(图1A类,B类). 神经元的核染色可以显示细胞核浓缩/碎裂,这是细胞凋亡最常用的指标之一(Hardingham等人,2002年;Wang等人,2004年)而LDH分析可以对凋亡和坏死神经元损伤进行无偏见的定量鉴定(Koh和Choi,1987年;Liu等人,2007年). 如前所述(Liu等人,2007年;Taghibiglou等人,2009年),NMDA(25μ米; 1 h)导致显著的神经元损伤,表现为核浓缩/碎裂的神经元数量增加(图1A类,2C类刺激后6小时,细胞外LDH水平升高(Kruskal–Wallis等级单向分析,h三= 15.217,第页= 0.002) (图1B类). NMDA诱导的神经元损伤是通过NMDARs介导的,因为NMDAR拮抗剂AP5(50μ米)(NMDA为对照组的212.6±29.0%,n个=每组7个培养皿,来自7个独立实验,邓恩法,与对照组相比,第页< 0.01; AP5+NMDA,100.9±11.9%,n个=7,与对照组相比,第页> 0.05) (图1B类).
图1。 兴奋毒性NMDA刺激增加培养神经元PTEN核移位。A类,B类在浴液中应用NMDA(25μm,持续1小时,再加上6小时的恢复)会导致显著的神经元死亡,表现为核浓缩/碎片化的神经元数量增加。比例尺,20μm。(图2C类以及细胞外LDH水平升高(B类,n个=每组7个培养皿,来自7个独立实验)。NMDAR拮抗剂AP5(50μ米).C类细胞质和细胞核组分的Western blotting显示,NMDA刺激(25μm刺激1 h,再加上6 h恢复)可增强PTEN向细胞核的转运,这一过程可被AP5(50μm)抑制米). 我们通过依次用细胞质标记Hsp90和核标记层粘连蛋白B1重制印迹来确认细胞质/细胞核分馏的质量。底部的条形图总结了四个独立实验的数据。D类核(N-PTEN)和细胞质(C-PTEN)组分的Western blotting表明,PTEN核转位增强主要由含NR2B的NMDARs(NR2BR)介导,因为NR2B拮抗剂Ro25-6981(Ro;0.5μ米)但不含NR2A的NMDAR偏好拮抗剂NVP-AAM077(NVP;0.4μ米).E类对PTEN(N-PTEN)和核标记物(TBP)的核组分进行序贯检测表明,NMDA诱导的PTEN核转位具有时间依赖性,在刺激后6~9 h达到峰值,24 h内恢复到基线水平;n个=每组2个培养皿,来自两个独立实验。值得注意的是,NMDA诱导的PTEN核移位的时间进程与缺血诱导的时间进程略有不同(图3A类)可能是由于刺激强度不同。F类PIP核组分的顺序斑点印迹三(N-PIP三)核蛋白NeuN(NeuN)显示NMDA刺激(25μm持续1小时,再加上6小时恢复)导致PIP核水平显著下降三PTEN的主要生理底物;n个=每组5个培养皿。G公司,磷酸-Akt核组分的顺序印迹Ser473系列(N-p-Akt)和总Akt(N-total-Akt)表明,NMDA处理(25μm,1 h,加上9 h恢复)导致磷酸化Akt的核水平显著降低Ser473系列;n个=每组3个培养皿。H(H),核PTEN活性对NMDA诱导的神经元损伤至关重要。神经元死亡的图像(左)和量化(右)显示,NMDA刺激后6小时(1小时内25μm)的核浓缩分析表明,核靶向磷酸酯酶死亡PTEN突变(NLS-GFP-PTEN)的过度表达显著降低了NMDA诱导的神经元死亡C124S型)但不是通过GFP或核靶向野生型PTEN(NLS-GFP-PTEN)的过度表达重量);n个=每组12个培养孔,从三个独立的实验中计数每个培养孔中的25个神经元。比例尺,20μm。条形代表组平均值,误差条形代表SD。后hoc通过显著的单因素方差分析或Kruskal–Wallis等级分析,将治疗组与对照组进行比较,显著性定义为*第页< 0.05, **第页< 0.01.
图2。 PTEN K13在NMDA诱导的培养神经元PTEN核移位和神经元死亡中的关键作用。A类PTEN的残基对神经元中PTEN核的积累至关重要。图像(顶部面板)和核荧光强度鉴定(底部条形图;n个=每组33个细胞,来自三个独立实验)证明GFP-PTEN的GFP信号K13R系列突变体主要是细胞质的,被排除在细胞核之外,而两种类型PTEN(GFP-PTEN)的GFP信号重量)或K289R突变型(GFP-PTENK289R公路)在细胞核和细胞质中分布相对均匀。比例尺,20μm。B类,用干扰肽Tat-K13(10μ米),但不是Tat-K289(10μ米),完全阻断NMDA刺激的PTEN核转位,如核部分的免疫印迹所示(n个=每组4个培养皿,来自四个独立实验)。NMDA刺激后6 h进行细胞核分馏(25μm持续1 h)。C类,D类,Tat-K13可防止NMDA诱导的兴奋毒性。Tat-K13(10μ米),但不是对照肽Tat-K289(10μ米),减少显示细胞核凝聚/分裂的神经元数量(C类,n个=每组8个培养孔,从三个独立实验中,从每个培养孔中随机选择四个视野并取平均值;标尺,20μm)和减少的LDH释放(D类,n个=每组27个培养孔,来自三个独立的实验)。两种分析均在NMDA刺激后6 h进行(25μm持续1 h)。E类,体外PTEN脂质磷酸酶活性测定显示,在测试浓度(10μ米)干扰肽Tat-K13和对照肽Tat-K289均未对脂质底物PIP产生游离磷酸盐产生显著影响三通过重组PTEN(n个= 3). 条形代表组平均值,误差条形代表SD。后hoc在进行显著的单因素方差分析或Kruskal–Wallis排名后,分析将治疗组和对照组进行比较,显著性定义为*第页< 0.05, **第页< 0.01.
接下来,我们使用细胞质/细胞核分馏技术和Western blotting研究NMDA激发是否导致PTEN核易位增加。为了证实各自细胞质和核组分的成功分离,分别用相应的细胞质和细胞核蛋白标记、热休克蛋白90(Hsp90)和层粘连蛋白B1重制了印迹(图1C类). 结果表明,NMDA刺激培养神经元可显著增加细胞核PTEN水平,这一过程可通过NMDAR拮抗剂AP5(50μ米)(单向方差分析,F类(3,12)= 50.318,对< 0.001; NMDA,控制的345.9±50.0%,n个=每组4个培养皿,来自四个独立实验、Tukey HSD测试和对照,第页< 0.001; AP5+NMDA,103.7±36.3%,n个=4与对照相比,第页= 0.999) (图1C类). 这种增强的PTEN核转位主要由神经元死亡相关NR2B相关NMDA受体(NR2BR)介导,因为PTEN核易位被NR2BR拮抗剂Ro25-6981(0.5μ米)但不受NR2AR拮抗剂NVP-AAM077(0.4μ米) (图1D类) (Liu等人,2007年;Okamoto等人,2009年;Tu等人,2010年;Lai等人,2011年). 这与NMDAR诱导的PTEN核转位在介导兴奋毒性神经元损伤中的潜在作用一致。此外,一项详细的时间进程研究表明,NMDA诱导的PTEN核转位具有时间依赖性,在治疗后6-9小时达到峰值,并在24小时内恢复到控制水平(n个=每组2个培养皿,来自两个独立实验)(图1E类). 因此,PTEN核转位似乎是NR2B相关NMDAR激活下游的延迟信号级联。
PTEN核移位是导致NMDAR介导的神经元死亡的重要步骤
作为一种脂类磷酸酶,PTEN的主要功能是转换PI(3,4,5)P三进入PI(4,5)P2从而拮抗PI3激酶/Akt细胞存活信号通路(Maehama和Dixon,1998年;Lee等人,1999年). 因此,可以预期NMDA诱导的PTEN核移位可能导致PIP核水平的改变三和Akt活性(可以通过磷酸化Akt的水平来衡量)。与这个推测一致,我们观察到核PIP显著下降三NMDA治疗6 h后的水平(NMDA,58.7±14.6%的对照,n个=5种培养皿,Mann–Whitney秩和,U=0.000,T=40.000,第页= 0.008) (图1F类)以及磷酸化Akt核水平的大幅降低Ser473系列与NMDA刺激后9小时的总Akt相比(NMDA,对照组的33.2±12.4%,n个=3个培养皿,t吨测试,t吨=6.579,具有4个自由度,第页=0.003)(图1G公司). 这一结果不仅为NMDA诱导的PTEN核转位提供了进一步的证据,而且还表明核PTEN与细胞质PTEN一样,可能作为PIP的脂质磷酸酶发挥作用三从而负向调节PI3K-Akt细胞存活促进信号通路的核池。为了进一步研究核PTEN的磷酸酶活性是否导致NMDA诱导的兴奋毒性神经元损伤,我们接下来检测了转染野生型GFP-PTEN的培养神经元中NMDA的兴奋毒性重量或磷酸酶死亡突变型GFP-PTENC124S型(Maehama和Dixon,1998年). 由于这些结构优先在细胞核表达,这两个结构都融合到一个特征明确的经典NLS(Liu等人,2005年). NLS可以将其融合蛋白导入细胞核以实现核富集。如所示图1H(H),磷酸酶死亡的PTEN(NLS-GFP-PTEN)的核过度表达C124S型)作为显性阴性抑制剂,减少NMDA诱导的兴奋毒性,与野生型PTEN或对照质粒GFP转染的神经元相比,这些转染神经元的核浓缩/分裂显著减少(单向方差分析,F类(2,33)= 9.483,对< 0.001; GFP,33.2±4.7%神经元死亡,n个=每组12个培养孔,从三个独立实验中计算每个培养孔中的25个神经元;NLS-GFP-PTEN公司重量, 32.7 ± 8.9%,n个= 12; NLS-GFP-PTEN公司C124S型, 22.0 ± 7.0%,n个= 12; Tukey的HSD测试,GFP与NLS-GFP-PTENC124S型,第页= 0.002; NLS-GFP-PTEN公司重量与NLS-GFP-PTEN相比C124S型,第页= 0.002) (图1H(H)). 因此,NMDA刺激后PTEN核转位增加似乎是导致NMDA诱导兴奋毒性神经元损伤的重要步骤。
最近使用许多癌细胞系的研究提供了强有力的证据,支持赖氨酸残基K13和K289的单泛素化在介导PTEN核积累中的关键作用(Trotman等人,2007年;Wang等人,2007年). 为了研究这两个赖氨酸残基是否对神经元PTEN核转位也至关重要,我们将含有赖氨酸-精氨酸突变的PTEN突变体转染神经元(K13R和K289R)。如所示图2A类在转染野生型PTEN(GFP-PTEN)的神经元中重量)或K289R突变型(GFP-PTENK289R公路)GFP信号在细胞核和细胞质中的分布相对均匀(GFP-PTEN重量细胞核和细胞质PTEN信号的比值为119.0±21.8%,n个=每组33个神经元,来自三个独立实验;GFP-PTEN公司K289R公路, 128.2 ± 24.9%,n个= 33) (图2A类). 相反,在转染K13R突变(GFP-PTEN)的神经元中K13R系列)GFP信号主要为细胞质信号,不包括在细胞核内(GFP-PTENK13R系列为42.1±18.2%,n个= 33; Kruskal–Wallis等级单向分析,H2= 64.507,对= < 0.001;临时的Tukey的HSD测试,GFP-PTEN重量与GFP-PTEN相比K289R公路,第页> 0.05; GFP-PTEN公司重量与GFP-PTEN相比K13R系列,第页< 0.01) (图2A类). 这些结果强烈表明,与以前在癌细胞系中的观察结果不同(Trotman等人,2007年;Wang等人,2007年),只有K13残基(而不是K289残基)对神经元中PTEN核的积累至关重要。
为了进一步证实K13残基在NMDA诱导的PTEN核定位中的重要作用,我们接下来设计了两个侧翼K13残端的干扰肽(KEIVSRNK13RRYQED)和K289残渣(GPEETSEK289VENGS)。我们假设K13肽可以竞争性地抑制K13残基的PTEN单泛素化,从而阻断神经元中的PTEN核移位。相反,由于神经元中PTEN核移位不需要K289残基(图2A类)K289肽可能不影响PTEN核转位。通过将这两种肽与人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)Tat蛋白(GRKKRRQRRR)的细胞膜转导域融合,使其具有膜渗透性(Schwarze等人,1999年;Aarts等人,2002年;Borsello等人,2003年;Taghibiglou等人,2009年). 与我们的预测一致,原代神经元培养的细胞核/细胞质分馏结果表明,Tat-K13联合应用(10μ米),但不是由Tat-K289(10μ米)(单向方差分析,F类(5,18)= 23.809,第页< 0.001; NMDA为对照组的267.3±25.5%,n个=每组4个培养皿,来自四个独立实验、Tukey HSD测试和对照,第页< 0.001; K13+NMDA,126.2±34.1%,n个=4,与对照组相比,第页= 0.828; K289+NMDA,234.0±49.6%,n个=4,与对照组相比,第页< 0.001) (图2B类). 这些结果进一步证实了K13残基(而非K289残基)对NMDA诱导的神经元PTEN核移位至关重要,并表明Tat-K13肽是阻断PTEN核转位的有效抑制剂。
Tat-K13有效预防NMDA诱导的PTEN核转位的能力表明,它可能是一种有效的兴奋性毒性神经元损伤的神经保护剂。我们首先在接受NMDA诱导的兴奋毒性神经元损伤的神经元培养物中使用两种核浓缩物进行了测试(图2C类)和LDH释放(图2D类)分析。我们的结果表明,用Tat-K13(10μ米),但不是Tat-K289(10μ米),防止NMDAR介导的神经元损伤。如所示图2C类NMDA治疗导致显示浓缩/碎片细胞核的神经元百分比显著增加(单向方差分析,F类(5,42)= 14.254,第页< 0.001; 对照组,40.3±6.1%神经元死亡,n个=每组8个培养孔,来自三个独立实验;NMDA,60.0±8.4%,n个= 8; Tukey的HSD测试,第页< 0.001) (图2C类). 用Tat-K13预处理神经元可阻止这种增强的凋亡,但用Tat-K289预处理神经元则不能阻止(K13+NMDA,39.6±7.9%,n个=8,与对照组相比,第页= 1.000; K289+NMDA,58.7±6.9%,n个=8,与对照组相比,第页< 0.001) (图2C类). 此外,来自LDH分析的证据也证实了Tat-K13对NMDA损伤具有强大的神经保护作用(Kruskal–Wallis等级单向分析,H5=128.957,对= < 0.001) (图2D类). 联合应用Tat-K13而非Tat-K289(NMDA为对照的270.0±34.6%,n个=每组27个培养孔,来自3个独立实验、Tukey HSD测试和对照,第页< 0.01; K13+NMDA,139.0±24.2%,n个=27,与对照组相比,第页> 0.05; K289+NMDA,256.5±35.4%,n个=27与对照组相比,第页< 0.01) (图2D类). 为了进一步证实Tat-K13的神经保护作用主要是通过抑制PTEN核转位介导的,而不是影响细胞质中PTEN的脂质磷酸酶活性,我们进行了一项研究在体外使用孔雀石绿法测定PTEN脂质磷酸酶活性。结果表明,在测试浓度(10μ米)干扰肽Tat-K13和对照肽Tat-K289对PTEN对PIP的脂类磷酸酶活性均无显著影响三,表明新开发的Tat-K13干扰肽可能代表一种新型治疗性神经保护剂,可以避免由于改变PTEN的酶功能而产生的潜在副作用(图2E类).
PTEN核转位增强导致局灶性脑缺血损伤后缺血性神经元损伤体内
由于NMDAR的过度激活被认为是缺血性中风期间神经元损伤的主要原因之一(卢卡斯和纽豪斯,1957年;奥尔尼,1969年;罗斯曼,1983年,1984;Simon等人,1984年;利普顿和罗森博格,1994年;Aarts等人,2002年;Arundine和Tymianski,2004年;Lai等人,2011年)接下来,我们测试了缺血性脑损伤后是否会发生PTEN核移位,如果是,Tat-K13是否可以阻止缺血诱导的PTEN核转移,从而减少缺血诱导的神经元损伤。在这里,我们使用了一个体内大鼠中风模型,包括远端MCA的短暂闭塞(Chen等人,1986年;Shyu等人,2008年).
测试缺血损伤是否会触发PTEN核移位体内,大鼠受到90分钟短暂缺血事件的攻击,然后在发作后2至24小时的不同时间段内恢复。核分馏分析显示,与对侧脑区的相应区域相比,含有核心区和半影区的缺血区域脑组织中PTEN核聚积随时间增加(图3A类). 缺血激发后,缺血脑区的核PTEN水平逐渐升高,在12小时达到峰值,在中风发作后24小时内恢复到基线水平(图3A类,右侧)。
图3。 PTEN核转位增强导致局灶性脑缺血损伤后缺血性神经元损伤体内成熟的Sprague-Dawley大鼠通过短暂结扎右侧MCA和双侧CCA,接受90分钟局灶性缺血事件的挑战,然后按照指示恢复不同的时间段。A类,缺血性损伤在梗死皮质区域触发了时间依赖性PTEN核转位。左侧,第7天从一只经盐处理的对照卒中大鼠身上拍摄的MRI代表性冠状扫描图像显示了一个清晰的梗死(白色)区域。右侧,在卒中后不同时间点对梗死区(左侧为白色方形区域)的PTEN和核蛋白层粘连B1的细胞核分数进行连续探测,结果显示PTEN核易位随时间增加,在卒中12小时后达到峰值,24小时内恢复到基线水平(n个=每组2只大鼠)。B类,系统应用Tat-K13可以有效地进入大脑中的神经元,包括缺血半影区的神经元。脑卒中后6 h应用荧光肽Tat-K13-Carboryfluorescein(10 mg/kg,静脉注射),1 h后处理脑切片。左图,氯化三苯基四氮唑(TTC)染色图像(1mm厚的冠状脑切片)显示大脑损伤侧的感觉运动皮层可见梗死区。右侧,荧光显微镜图像取自紧邻左侧TTC染色切片的切片。1毫米厚脑切片中梗死区的图像(放大2.5倍)与左侧TTC切片中的白框所示的区域相对应,显示肽不仅进入大脑,而且似乎在梗死区特别富集。高倍放大(20倍或40倍)拍摄的梗死区20μm厚的脑切片图像进一步证实了该肽成功转导到缺血区的单个细胞中。C类在发作后6小时应用Tat-K13肽可减少中风引发的PTEN核移位。对梗死区PTEN(N-PTEN)和核蛋白层粘连B1的细胞核组分的连续探测表明,在中风后12 h进行检测时,Tat-K13(K13;10 mg/kg,静脉注射),而不是其对照Tat-K13R(K13R;10 mg/kg.静脉注射)显著降低了缺血诱导的PTEN核移位(n个=每组6只大鼠)。D类,在第7天,对大鼠进行90分钟短暂局灶性脑缺血损伤,并按指示接受各种治疗,从嘴侧(顶部)到尾侧(底部)水平拍摄典型的MRI扫描图像。右边的条形图总结了每组10只大鼠的结果。与对照肽Tat-K13R(K13R;10 mg/kg,静脉注射)或Tat-K289(K289;10 mg/kg/kg,静脉滴注)或在中风发作后2 h滴注生理盐水相比,中风发作后第2或6 h滴注Tat-K13(K13;10 mg/kg.)可显著减少梗死面积。E类,FDG-PET扫描在第7天从相同的动物组D类与接受对照肽Tat-K13R或Tat-K289或生理盐水的动物相比,接受Tat-K13的动物梗死区的脑葡萄糖代谢活动显著恢复。色标(左)表示葡萄糖代谢的相对水平,从高(红色)到低(蓝色)。条形代表组平均值,误差条形代表SD。后hoc在进行显著的单因素方差分析或Kruskal–Wallis等级分析后,分析比较了治疗组和对照组(生理盐水),显著性定义为*第页< 0.05, **第页< 0.01.
为了确定全身应用后的Tat-K13是否可以防止缺血性核PTEN易位,从而减少缺血性神经元损伤,我们首先测试了全身应用后的Tat-K13是否可以使用荧光团标记的肽Tat-K13-碳酰荧光素进入缺血性半影中的神经元。如所示图3B类中风发作6小时后静脉注射这种荧光Tat-K13(10 mg/kg)不仅有效地进入大脑,而且在用药后1小时内在梗死区的神经元中富集(图3B类). 梗死脑区的这种明显富集可能是由于缺血损伤后血脑载体泄漏的短暂增加所致(Belayev等人,1996年;Fernandez-Lopez等人,2012年)这些结果表明,中风后全身给药可以有效地将该肽传递到脑缺血/梗死区域的神经元。
在证明肽能有效地传递到缺血区域后,我们接下来测试Tat-K13肽是否能抑制缺血诱导的PTEN核移位体内由于大多数中风患者在中风发作后数小时到达医院,任何临床相关治疗即使在中风发作后数小时给予,也应具有疗效。鉴于PTEN核聚积在发病后约12小时达到峰值(图3A类)通过静脉注射给药的Tat-肽可以在1小时内迅速达到大脑中的治疗浓度(图3B类) (Aarts等人,2002年;Taghibiglou等人,2009年;库克等人,2012年),在发病后6小时全身应用Tat-K13应有足够的时间抑制缺血诱导的PTEN核移位的主要部分。为了进一步证实Tat-K13肽的特异性,我们还开发了另一种控制肽Tat-K13R,其中赖氨酸13残基(K13)被精氨酸(R13)取代。K13转化为R13应使Tat-K13R无法与K13位点上的内源性PTEN单体泛素化竞争,从而起到对Tat-K13的非活性控制作用。正如预测的那样,在中风发作后6 h静脉注射Tat-K13,而不是Tat-K13R(10 mg/kg,静脉注射),在中风发病后12 h进行检测时,显著抑制了缺血诱导的PTEN核移位(单向方差分析,F类(2,15)= 24.033,对< 0.001) (图3C类). Tat-K13治疗组大鼠的核PTEN水平降低至盐治疗组的65.3±7.6%,而Tat-K13R治疗组大白鼠的核PTEN水平在统计学上与盐对照组相似(盐、,n个=每组6只大鼠;K13,n个= 6; Tukey的HSD测试,第页< 0.001; K13R,盐水对照的88.8±7.3%,n个=6,与对照组相比,第页= 0.106) (图3C类). 这些结果证实,PTEN核转位是卒中发病后一个相对延迟的细胞过程,可以通过卒中后使用Tat-K13治疗加以抑制。
为了研究缺血诱导的PTEN核移位与缺血性神经元死亡之间的因果关系,我们通过全身静脉注射Tat-K13或以Tat-K13R或Tat-K289作为对照来抑制PTEN核转移。我们在发病后2小时或6小时给治疗组第一次注射Tat-K13(10 mg/kg,静脉注射),在发病后2h给对照组注射Tat-K13R或Tat-K289(10 mg/kg.静脉注射)。为了提高肽的功效,我们还在中风后第2天和第3天额外给每种肽两次剂量。在中风发病7天后,使用MRI评估肽的长期形态神经保护作用。如所示图3D类MRI扫描显示,与盐处理大鼠相比,接受Tat-K13治疗的大鼠,无论是在发病后2小时还是6小时服用,其脑梗死体积都显著减少(Kruskal–Wallis等级单向分析,h4= 38.639,对= < 0.001; 生理盐水对照,170.9±18.7 mm三,n个=每组10只大鼠;K13(2小时),67.7±17.5毫米三,n个=10,Tukey的HSD测试,与生理盐水相比,第页< 0.01; K13(6小时),67.4±15.9毫米三,n个=10,与生理盐水相比,第页< 0.01) (图3D类). 相比之下,对照肽(Tat-K13R和Tat-K289)的发作后治疗对缺血诱导的脑梗死几乎没有保护作用[K13R(2 h),160.9±5.7mm三,n个=10,与生理盐水相比,第页> 0.05; K289(2小时),151.2±8.0毫米三,n个=10,与生理盐水相比,第页>0.05】(图3D类).
然后,我们通过测量卒中发病后7天用FDG-PET测定神经元葡萄糖摄取的恢复情况,检查Tat-K13是否也能对神经元提供相应的功能保护,使其免受缺血损伤。与MRI结果一致,FDG-PET扫描还显示,与生理盐水治疗组相比,两组接受Tat-K13治疗的大鼠缺血半球的FDG摄取缺陷显著恢复[单因素方差分析,F类(4,45)= 246.269,第页< 0.001; 生理盐水对照,78.4±4.8%缺陷,n个=每组10只大鼠;K13(2小时),25.6±7.8%缺陷,n个=10,Tukey的HSD测试与生理盐水,第页< 0.001; K13(6小时),不足20.2±6.3%,n个=10相对于盐水,第页< 0.001] (图3E类). 相比之下,用任何一种对照肽[K13R(2 h)处理的大鼠均未观察到明显的恢复,即缺陷的73.2±3.4%,n个=10,与生理盐水相比,第页= 0.267; K289(2小时),赤字的71.5±5.3%,n个=10,与生理盐水相比,第页= 0.07] (图3E类). MRI和PET采集结果表明,Tat-K13通过阻断PTEN核蓄积,可以有效保护神经元免受缺血损伤。
临床上,了解神经保护剂除了提供神经保护外,是否还能对中风患者的行为产生持久的益处是很重要的。因此,我们还使用三种典型的感觉运动评估,即偏向性摆动、运动活动和握力测量,来检查中风后Tat-K13治疗是否能提供神经行为益处,这三种评估通常用于评估局部缺血损伤的皮层神经回路的功能恢复(Dunnett等人,1998年;Chang等人,2003年;Shyu等人,2008年). 在中风发作后的4周恢复期内,身体摆动试验表明,与生理盐水或任何一种对照肽治疗的大鼠相比,服用Tat-K13(2和6小时组)的大鼠身体不对称运动行为的恢复速度要快得多(图4A类). 到第28天,接受Tat-K13治疗的大鼠基本上已从身体不对称缺陷中恢复[Kruskal–Wallis等级单向分析,H4= 38.017,对= < 0.001; 生理盐水对照,回收率44.4±6.0%,n个=每组10只大鼠;K13(2小时),回收率90.8±2.8%,n个=10,Tukey的HSD测试与生理盐水,第页< 0.01; K13(6h)回收率为88.9±4.3%,n个=10,与生理盐水相比,第页< 0.01] (图4A类). 相反,用任何一种对照肽(Tat-K13R或Tat-K289)治疗的患者与生理盐水对照组表现相似[K13R(2 h),50.0±5.4%的恢复率,n个=10,与生理盐水相比,第页> 0.05; K289(2小时),回收率41.2±7.4%,n个=10,与生理盐水相比,第页>0.05】(图4A类). 同样,在计算机化运动室中监测的垂直运动时间表明,与经盐处理或对照肽处理的大鼠相比,经Tat-K13处理的大白鼠(2和6小时组)在4周恢复期内的运动活动表现出更快、更显著的改善(图4B类). 在第28天,单向方差分析表明各组之间存在显著差异(单向方差分析,F类(4,45)= 361.269,第页< 0.001).后hoc比较(Tukey的HSD试验)表明,Tat-K13治疗组大鼠的垂直运动时间显著长于盐水治疗组大鼠类[盐水对照组,200.9±17.2s,n个=每组10只大鼠;K13(2小时),453.6±23.7秒,n个=10,与生理盐水相比,第页< 0.001; K13(6小时),440.6±20.7秒,n个=10相对于盐水,第页< 0.001] (图4B类). 另一方面,运动活性不受对照肽处理的影响[K13R(2 h),231.8±16.8s,n个=10,与生理盐水相比,第页= 0.018; K289(2小时),213.0±26.1秒,n个=10,与生理盐水相比,第页= 0.708] (图4B类). 此外,握力测试的结果还显示,在中风后28天用Tat-K13治疗的大鼠恢复更为显著(Kruskal–Wallis等级单向分析,H4= 35.840,对= < 0.001) (图4C类). 与生理盐水治疗相比,无论是在发病后2小时还是6小时,Tat-K13治疗都能显著提高握力恢复,而对照肽则无保护作用[生理盐水对照,握力后/握力前0.70±0.23,n个=每组10只大鼠;K13(2小时),1.72±0.14,n个=10,Tukey的HSD测试与生理盐水,第页< 0.01; K13(6小时),1.65±0.13,n个=10,与生理盐水相比,第页< 0.01; K13R(2小时),0.70±0.11,n个=10,与生理盐水相比,第页> 0.05; K289(2小时),0.74±0.11,n个=10,与生理盐水相比,第页> 0.05] (图4C类). 总之,我们在中风大鼠模型中的研究结果有力地表明,Tat-K13不仅减少了脑梗死面积,而且改善了因缺血性损伤而受损的功能性神经回路。
图4。 中风后用Tat-K13肽治疗改善局灶性脑缺血损伤后的运动行为表现体内。局部缺血和肽应用如图3(n个=每组10)。A类偏倚摆动试验表明,在中风后4周的恢复期内,接受Tat-K13中风后治疗的动物(2和6小时组)的恢复速度比接受生理盐水或对照肽治疗的动物快得多。B类与生理盐水治疗相比,Tat-K13肽(而非其对照肽)显著促进了中风大鼠运动活动的恢复。在中风后4周恢复期的2小时观察期内,使用电脑运动箱自动测量运动活动(垂直运动时间)。C类握力测试表明,在中风后28天,接受Tat-K13治疗的动物(2和6小时组)的握力表现比接受对照肽或生理盐水的动物要好得多。总之,这些行为测试表明,Tat-K13肽在改善运动功能方面具有持久的治疗作用。条形代表组平均值,误差条形代表SD。后hoc在进行显著的单因素方差分析或Kruskal–Wallis等级分析后,分析比较了治疗组和对照组(生理盐水),显著性定义为*第页< 0.05, **第页< 0.01.
讨论
我们目前的研究确定PTEN核转位增加是导致NMDAR/缺血介导的神经元损伤的信号级联中的一个重要步骤。我们提供了一些证据支持PTEN核转位在介导神经元损伤中的致病作用:(1)PTEN核易位是NR2B介导的NMDAR介导的细胞死亡信号通路的下游(图1D类) (Lai等人,2011年); (2) 显性阴性突变PTEN的核过度表达降低NMDAR介导的兴奋毒性(图1H(H)); (3)最重要的是,用Tat-K13肽特异性阻断PTEN核转位可防止NMDAR介导的培养神经元兴奋性毒性(图2)保护大脑免受缺血性损伤体内(图3,图4). 因此,PTEN核转位增加似乎是导致兴奋性毒性/缺血性神经元死亡的关键步骤。我们的研究与最近的一份报告一致,即核PTEN输入减少可促进核TDP-43介导的神经元存活(Zheng等人,2012年). 此外,我们的研究也与最近关于PTEN消融的轴突再生和神经保护作用的两份报告相一致(Domanskyi等人,2011年;Sun等人,2011年). 与PTEN消融方法相比,Tat-K13肽诱导的神经保护的优势在于,Tat-K13不干扰PTEN的细胞质功能,而PTEN的缺失则取消其所有功能。有趣的是,最近一项使用Nedd4家族相互作用蛋白1(Ndfip1)条件性敲除动物的研究也报告了PTEN核易位的平行减少和缺血损伤后神经元易损性的增加(Howitt等人,2012年). 然而,作为一种E3连接酶衔接蛋白,Ndfip1的敲除不仅会影响PTEN,而且会影响E3-ligase Nedd4的许多底物。因此,很可能Ndfip1中观察到的神经元易损性增加−/−这是因为它影响一个或多个细胞生存信号通路,而不是减少PTEN核易位。
值得注意的是,最近的几项研究也报道了PTEN核转位在PTEN的肿瘤抑制功能中的重要作用。利用几个癌细胞系和人类癌症标本,这些研究表明PTEN核易位受损会导致各种癌症的发生(Georgescu等人,2000年;Gimm等人,2000年;Whiteman等人,2002年;Walker等人,2004年;Trotman等人,2007年). 最近对人类胶质母细胞瘤和Cowden病的研究发现了两种PTEN突变体(K13E和K289E),它们保留了正常的脂质磷酸酶活性,但不能转移到细胞核中,导致PTEN在肿瘤发生过程中的肿瘤抑制能力受损(Georgescu等人,2000年;Walker等人,2004年;Trotman等人,2007年). 更引人注目的是,在甲状腺中,正常滤泡细胞的特点是细胞核中的PTEN染色比细胞质中的强,而PTEN的核染色强度在从正常到滤泡腺瘤到癌的过程中逐渐减弱(Gimm等人,2000年). 在黑色素瘤进展中也观察到类似的趋势(Whiteman等人,2002年). 这些结果以及本研究中提出的结果清楚地证明了PTEN核转位的正常功能是调节细胞存活和死亡的关键机制,这是肿瘤发生和神经退行性变之间的共同机制。PTEN核转位受损可能导致细胞生长抑制失败,从而导致各种癌症的发病机制。另一方面,过度兴奋的PTEN核转位会增加细胞死亡,导致神经退行性变。因此,进一步研究PTEN核转位如何调节细胞存活和死亡可能有助于更好地理解肿瘤发生和神经退行性变发病机制。
我们目前的研究揭示了PTEN核转位在介导兴奋性毒性和缺血性神经元死亡中的重要作用。然而,核PTEN增加神经元对兴奋毒性和缺血易感性的详细机制尚不清楚。以往癌症研究的证据表明,核PTEN可能作为核PIP发挥作用三磷酸酶并因此拮抗核PI3K/Akt前生存信号通路(Gimm等人,2000年;Deleris等人,2003年;Ahn等人,2004年,2005;Vasko等人,2004年). 在嗜铬细胞瘤细胞(PC12)中,用纯化PTEN预处理的细胞核提取物显示,在凋亡刺激下,DNA片段增加,这可以通过过量的PIP来挽救三(Ahn等人,2004年,2005). 此外,在甲状腺肿瘤发生过程中,从正常甲状腺滤泡细胞到腺瘤到癌的过程中,核PTEN水平与活化核Akt水平呈负相关(Gimm等人,2000年;Vasko等人,2004年). 这些结果与我们的观察一致,即NMDA刺激导致PIP核水平急剧下降三并且NMDA诱导的神经毒性被显性阴性突变PTEN的核过度表达所抑制C124S型因此,很有可能推测核PTEN可能通过拮抗核PIP介导兴奋毒性神经元死亡三/Akt生存信号通路。此外,核PTEN可能通过PIP发挥其神经毒性作用三-独立机制。最近的研究发现,PTEN可以与细胞核中的p53形成物理复合物,从而保护p53免受泛素介导的降解,并促进p53依赖性凋亡(Freeman等人,2003年;Tang and Eng,2006年). 进一步研究PTEN核移位增加神经元易损性的详细机制可能有助于确定开发治疗性神经保护剂的新靶点。
介导兴奋性毒性/缺血性神经元死亡的机制是一个复杂的过程,已经提出了多因素和步骤(利普顿,1999年;Lai等人,2011年). PTEN核转位抑制相当显著的神经保护效果提出了一个有趣的问题,即如何将PTEN核易位与这些分子和先前参与兴奋毒性/缺血信号通路的步骤联系起来。由于PTEN核转位是导致缺血性神经元损伤的相对延迟步骤(在发作后12小时达到峰值),因此PTEN可能是几个NMDAR下游信号级联的稍后常见步骤,包括早期细胞溶质信号分子,如NR2B-PSD95(Jurado等人,2010年)以及后来的核因素,如TPD-43(Zheng等人,2012年),汇聚导致神经元损伤。这可以部分解释为什么Tat-K13肽的有效卒中后治疗窗口大于6小时。此外,值得指出的是,除了NMDAR介导的兴奋性毒性外,PTEN核转位也是非NMDAR诱导的细胞死亡机制中的关键步骤(Freeman等人,2003年;Chung and Eng,2005年;Tang和Eng,2006年;Shen等人,2007年). 越来越多的证据支持这样的观点,即一些非NMDAR介导的机制,如自由基生成和p53过度激活(无论是NMDAR激活的继发性还是独立性),可能会显著导致脑损伤,尤其是在严重卒中后(利普顿,1999年;Aarts等人,2002年;Leker等人,2004年). 因此,通过阻断这些非NMDAR依赖性细胞死亡机制,抑制PTEN核转位不仅可能有更广泛的治疗窗口,而且可能比以前报道的基于NMDAR的卒中后神经保护操作更有效(Lai等人,2011年).
通过对NMDAR介导的PTEN核转位机制的表征,我们开发了一种肽(Tat-K13)作为特异性PTEN核易位抑制剂,并证明它可能代表一种新的有效中风治疗方法。正如MRI和PET成像所观察到的那样,它为神经元提供了持久的形态学和功能保护,使其免受缺血损伤。此外,行为分析进一步证明了其促进行为恢复的能力。与之前在中风临床试验中测试的大多数基于NMDAR拮抗剂的神经保护剂不同(Albers等人,1995年,1999,2001;Davis等人,2000年),Tat-K13不影响NMDAR,但靶向PTEN核转位,这是NMDAR介导的细胞死亡信号级联中的延迟步骤。因此,Tat-K13可能具有更宽的中风后治疗窗口,副作用减少。最后,由于NMDAR介导的兴奋性毒性被认为除了急性脑损伤(如中风和脑外伤)外,还可能导致大量慢性神经退行性疾病(如阿尔茨海默病和亨廷顿病导致的精神疾病)的发病机制(利普顿和罗森博格,1994年),这项研究可能具有中风以外的广泛意义。