摘要
星形胶质细胞和小胶质细胞在大多数脑病理条件下会发生反应,这使得这种神经炎症过程成为神经功能障碍的替代标志物。神经炎症与转运蛋白18kDa(TSPO)水平和TSPO配体结合位点的增加有关。因此,TSPO的正电子发射断层扫描(PET)成像通常用于临床前和临床研究中的神经炎症监测。人们普遍认为TSPO PET信号揭示了反应性小胶质细胞,尽管一些研究表明反应性星形胶质细胞可能起作用。由于星形胶质细胞和小胶质细胞扮演着非常不同的角色,因此确定反应性星形胶质细胞是否也能过度表达TSPO并产生可检测的TSPO PET信号至关重要体内我们使用了一种选择性星形胶质细胞激活模型,通过慢病毒将细胞因子睫状神经营养因子(CNTF)基因转移到大鼠纹状体中,而不存在神经变性。CNTF诱导星形胶质细胞的广泛激活,星形胶质细胞过度表达GFAP并变为肥大,而小胶质细胞的反应性标记物增加最小。两种TSPO放射性配体[18F] DPA-714型[N、 N个-二乙基-2-(2-(4-(2-[18F] 氟乙氧基)苯基)-5,7-二甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)乙酰胺]和[11C] SSR180575(7-氯-N个,N个-二甲基-5-[11C] 甲基-4-氧代-3-苯基-3,5-二氢-4H(H)-哒嗪并[4,5-b条]吲哚-1-乙酰胺),在注射了透镜-CNTF的纹状体中显示出显著的结合,该纹状体被PK11195饱和并移位[N个-甲基-N个-(1-甲基丙基)-1-(2-氯苯基)-异喹啉-3-甲酰胺]。放射配体结合体积与GFAP免疫阳性体积相匹配。TSPO mRNA水平显著升高,并且CNTF激活的星形胶质细胞过表达TSPO蛋白。我们发现反应性星形胶质细胞过度表达TSPO,导致TSPO放射性配体的显著和选择性结合。因此,在动物或患者中解释TSPO PET成像时必须谨慎,因为反应性星形胶质细胞除了反应性小胶质细胞外,还可能产生信号。
介绍
为了应对大脑中的多种异常情况,星形胶质细胞和小胶质细胞会发生反应。这种神经炎症过程包括定型的形态学改变和多种功能改变(Hanisch和Kettenmann,2007年;Escartin和Bonvento,2008年). 由于胶质细胞的激活不仅反映了神经元的功能障碍,而且还可以直接影响疾病的进展,因此已经做出了相当大的努力来开发非侵入性技术来监测这些细胞体内这些技术将能够在动物模型和患有多种神经退行性疾病的患者中评估疾病进展和治疗效果。
转位蛋白18kDa(TSPO)的正电子发射断层成像(PET)被认为是监测动物和人类神经炎症的有效策略(Chen和Guilarte,2008年). TSPO由胶质细胞表达,在神经炎症条件下上调(Rupprecht等人,2010年)作为使用TSPO放射性配体的神经炎症PET成像的生物标记物。[11【抄送】-(R(右))-PK11195型[N个-甲基-N个-(1-甲基丙基)-1-(2-氯-苯基)-异喹啉-3-甲酰胺]是首批开发的TSPO-选择性放射配体之一,20年来广泛用于动物和患者(Venneti等人,2006年;Chauveau等人,2008年). 此后产生了多种其他TSPO放射性配体,包括[18F] DPA-714型[N、 N个-二乙基-2-(2-(4-(2-[18F] 氟乙氧基)苯基)-5,7-二甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)乙酰胺](James等人,2008年)和[11C] SSR180575(7-氯-N个,N个-二甲基-5-[11C] 甲基-4-氧代-3-苯基-3,5-二氢-4H(H)-哒嗪并[4,5-b条]吲哚-1-乙酰胺)(Thominiaux等人,2010年).
尽管存在多种TSPO放射性配体,但TSPO PET信号是来自反应性星形胶质细胞还是小胶质细胞尚不清楚。人们普遍认为,反应性小胶质细胞对用TSPO放射性配体观察到的信号负责(Venneti等人,2006年;Chauveau等人,2008年,2009). 然而,一项原始研究报告称星形胶质细胞过度表达TSPO(Kuhlmann和Guilarte,2000年)和其他人提出了它们对TSPO PET信号的潜在贡献(Rojas等人,2007年;Ji等人,2008年). 探索TSPO表达的PET研究的主要局限性是所用的动物模型(脑内注射神经毒素、缺血、转基因小鼠)或所考虑的临床疾病。大多数显示星形胶质细胞和小胶质细胞激活,限制了PET数据的解释。其他混杂因素包括神经元变性、血脑屏障破坏和外周免疫细胞募集。因此,很难确定每种细胞类型对PET信号的相对贡献,而且在没有反应性小胶质细胞和神经退行性变的情况下,反应性星形胶质细胞是否会产生可检测的TSPO PET信号仍有待确定。评估TSPO PET成像是否允许区分反应性小胶质细胞和反应性星形胶质细胞也很重要,因为这两种细胞类型发挥着非常不同的功能,可能以相反的方式影响疾病的进展。
为此,我们开发了一种通过慢病毒在大鼠脑内转移细胞因子睫状神经营养因子(CNTF)选择性激活星形胶质细胞的模型,在没有可检测到的小胶质细胞反应性、神经元变性或任何其他病理过程的情况下(Escartin等人,2006年,2007;Beurrier等人,2010年). 我们使用这个独特的模型来评估反应性星形胶质细胞是否可以过度表达TSPO,并使用两种最近开发的和现场可用的TSPO放射性配体生成可检测的TSPO PET信号[18F] DPA-714和[11C] 180575瑞典先令。
材料和方法
试剂和动物。
除非另有规定,否则所有试剂均来自Sigma。所有动物实验程序均严格按照法国法规(农村法规R214/87至R214/130)和欧洲经济共同体(86/609/EEC)关于实验动物护理和使用的建议进行,并遵守《法国国家宪章》关于动物实验伦理的道德准则。动物设施由法国当局(兽医检查员)认证,编号为B92-032-02。
慢病毒注射。
如前所述,我们使用在小鼠磷酸甘油酸激酶1启动子控制下编码人类CNTF基因(“lent-CNTF”)和Ig输出序列或β-半乳糖苷酶基因(“lint-LacZ”)的自激活慢病毒(Escartin等人,2006年).
雄性Sprague-Dawley大鼠(2个月龄)用氯胺酮(75 mg/kg)和甲苯噻嗪(10 mg/kg)的混合物麻醉。将慢病毒载体悬浮液(2μl,100 ng p24/μl,用1%BSA在PBS中稀释)以0.2μl/min的速率注射到纹状体中,使用34号钝头针通过聚乙烯导管连接到Hamilton注射器。分别在大鼠左右纹状体注射lent-LacZ和lent-CNTF。来自前角的立体定向坐标如下:前后向,+0.5mm;横向,±3 mm;和腹侧,距硬脑膜−4.5 mm,齿杆设置为−3.3 mm。注射结束时,将针头留在原位5 min,然后缓慢取出。缝合皮肤,让大鼠在扫描前恢复至少2个月。注射后2至6个月对大鼠进行分析,因为CNTF的作用至少在6个月内是稳定的(Escartin等人,2006年).
作为涉及反应性星形胶质细胞和小胶质细胞的神经炎症的阳性对照(Ryu等人,2005年)如前所述,我们在9只大鼠的纹状体中注射了80 nmol的喹啉酸(QA)(Beurrier等人,2010年). 2周后,对8只大鼠进行灌注,其中一只大鼠的大脑冷冻,如下所述(见免疫组织学)。
放射性配体合成。
随时注射,放射化学纯度>99%[18F] DPA-714是由回旋加速器生产的[18F] 基于已发布标准条件的氟化物(Cyclone-18/9回旋加速器;IBA)(Damont等人,2008年;James等人,2008年)使用TRACERLab FX-FN合成器(GEMS)。用氟-18对DPA-714进行放射性标记时,使用了对乙酰氧基对氟亲核脂肪族取代(一步法),其制备包括以下五个阶段:(1)稀释添加的非载体、干燥(活化)K[18F] F-Kryptofix222复合物(由[18F] 氟化物、碳酸钾和Kryptofix222)和700μl二甲基亚砜,其中含有3.5–4.5 mg甲苯氧前体,用于标记[N、 N个-二乙基-2-(2-(4-(2-甲苯磺酰氧乙氧基)苯基)-5,7-二甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)乙酰胺];(2) 将反应混合物在160°C下加热5分钟;(3) 用HPLC流动相稀释反应混合物,并在SepPak氧化铝N筒上进行预提纯;(4) 半制备Waters X-Terra C-18柱上的HPLC纯化(洗脱液:0.1米乙酸铵水溶液,pH 10/乙腈,60:40 v/v);和(5)基于SepPak Plus C-18载体去除HPLC溶剂。[18F] DPA-714是一种乙醇(15%)生理盐水溶液(6.7至8.5 GBq批次,10 ml-体积),通常在50–55分钟内从35 GBq[18F] 氟化物(19-24%非衰变校正总分离产量),比放射性为74-222 GBq/μmol。
随时注射,放射化学纯度>99%[11C] SSR180575是由回旋加速器生产的[11C] 如前所述,使用TRACERLab FX-C合成器(GEMS)的二氧化碳(Cyclone-18/9回旋加速器;IBA)(Thominiaux等人,2010年). SSR180575在其5-甲基哒嗪[4,5-b条]相应的甲基化吲哚部分也不是-模拟,带[11C] 三氟甲磺酸甲酯。其制备包括以下六个阶段:(1)在−40°C下捕获[11C] 三氟甲烷(由回旋加速器生产的放射性合成[11C] 二氧化碳通过[11C] 甲基碘化物)溶于400μl二甲基甲酰胺中,含有0.6–0.9 mg标记前体(7-氯-N个,N个-二甲基-4-氧代-3-苯基-3,5-二氢-4H(H)-哒嗪并[4,5-b条]吲哚-1-乙酰胺)和细粉K2一氧化碳3(1.5–2.5毫克);(2) 将反应混合物在120°C下加热2 min;(3) 在减压和氦气流量下浓缩至干燥;(4) 用1ml HPLC流动相稀释残留物;(5) 半制备Waters Symmetry C-18柱上的HPLC纯化(洗脱液:水/乙腈/三氟乙酸,50:50:0.1,v/v/v);和(6)基于SepPak Plus cartridge去除HPLC溶剂。[11C] SSR180575是一种乙醇(15%)生理盐水溶液(4.8–6.7 GBq批次,10 ml体积),通常在40分钟内从74 GBq开始获得[11C] 比放射性为37至185 GBq/μmol的二氧化碳(6.5–9.1%非衰变校正总分离产量)。
对等分的待注射药物进行质量控制[18F] DPA-714或[11C] SSR180575准备,符合我们的内部质量控制/保证规范。
PET成像。
使用协和Focus 220相机(西门子)对大鼠(502±59 g)进行扫描,该相机专用于小动物成像,最高全宽空间分辨率为1.35 mm。在注射CNTF后2-6个月内,使用[18F] DPA-714型(n个=6)或[11C] 180575瑞典先令(n个=4)作为放射性配体。每组一只大鼠也进行了未标记PK11195的移位和预饱和研究。的解决方案(R、 S公司)-通过将PK11195溶解在二甲基亚砜中,然后稀释,首先用聚乙二醇400,然后用生理盐水稀释,然后在2 h内静脉注射。对于置换实验,在注射[18F] DPA-714和[11C] SSR180575。对于预饱和实验,未标记的PK11195(2 mg/kg和5 mg/kg[18F] DPA-714和[11C] 分别静脉注射SSR180575)。
用5%异氟醚诱导麻醉,并用2–2.5%异氟醚维持麻醉2。使用与PET采集兼容的自制立体定向框架,将动物置于扫描仪内,俯卧位,并使用加热毯(哈佛仪器)将其保持在37°C。同时注射[18F] DPA-714或[11C] SSR180575(分别为1.83±0.33和2.00±0.27 mCi)通过尾静脉中的26号导管,进行了90分钟的发射扫描,能量窗口为400–650 keV,符合时间窗口为6 ns。列表模式采集的数据文件显示为3D正弦图,最大环差为47,跨度为3。最后,对每个发射正弦图进行归一化、校正(针对衰减和放射性衰减),并使用FORE加OSEM-2D算法重建(16个子集,四次迭代)。
磁共振成像。
磁共振成像(MRI)用于确认注射部位,排除注射部位有可检测到水肿的动物(本研究中的10只动物中的1只),并通过PET/MRI联合登记确定感兴趣的解剖区域(ROI)。MRI在7 T水平系统(Varian-Agilent Technologies)上进行,该系统配备了一个达到600 mT/m(上升时间120μs)的梯度线圈、一个用于传输的射频鸟笼1H线圈和一个四通道表面接收线圈(Rapid Biomedical)。
在100%氧气中使用2%异氟醚麻醉动物2并通过口罩和耳罩固定在立体定向MRI兼容的啮齿动物框架上。一旦进入磁铁,动物就会被热气流加热,并监测其温度和呼吸参数。使用快速自旋回波序列获得T2加权图像,参数如下:TE,20ms;TR,7000毫秒;视野,38.4×38.4 mm;矩阵,256×256;获得150×150μm的面内分辨率;106个300μm厚冠状切片;采样频谱宽度为90 kHz;采集时间37分钟。
PET数据分析。
对收集到的PET时间帧进行汇总,并使用刚性变换将其手动登记到每只动物的T2加权MRI上。使用内部图像处理软件(Anatomist、BrainVISA可视化工具、,http://www.brainvisa.info). 所有实验均由同一操作员执行此过程。ROI分别为45.54±3.86和45.48±5.07 mm3分别用于注射lent-LacZ-和lent-CNTF的纹状体。计算左、右ROI的平均活性浓度值,并用于获得区域时间-活性曲线(TAC)。然后将这些曲线归一化为注射剂量和体重,并表示为标准化摄取值百分比(SUV):%SUV=[100×ROI值(Bq/ml)]/[(注射剂量(mCi)×37.106)/体重(g)]。
免疫组织学。
PET扫描后2至12天,用过量戊巴比妥杀死大鼠,快速收集其大脑,并在−30°C的异戊烷中冷冻。冷冻后的大脑被植入自制的绿色培养基中,并使用低温恒温器将其完全切成20μm厚的冠状切片。每第五节,用数码相机(高平面分辨率30×30μm)记录一张块面照片(即大脑表面照片)2),为尸检图像三维重建提供参考。收集了包括整个纹状体的十组组织切片,并将其安装在Superfrost玻璃载玻片上。
将冰冻切片在4%多聚甲醛中固定4小时后,根据制造商的说明,使用自动免疫染色系统(Ventana-Roche Discovery XT Medical)进行DAB免疫组化。使用以下主要抗体:GFAP(1:1000;Dako)、ED1/CD68(1:100;Serotec)、IBA1(1:250;Wako)和vimentin(1:100,Calbiochem)。对染色切片进行数字化,并使用基于计算机的图像分析系统(MCID分析)评估每只大鼠6至8片纹状体的染色强度(背景减影后的光密度)。在40倍显微镜下,从每只大鼠的两个切片上取八个视野,计算IBA1阳性细胞的数量。
另外两只分别在左右纹状体注射lent-LacZ和lent-CNTF的大鼠在戊巴比妥麻醉下经心灌注4%多聚甲醛。在20%蔗糖溶液中浸泡24小时后,使用冷冻切片机将大脑切成40μm的冠状切片。如前所述,在漂浮切片上进行双重或三重荧光免疫染色(Escartin等人,2006年). 我们使用了针对GFAP(1:1000;Sigma)、IBA1(1:500)、OX42/CD11b(MRC275;1:1000;Serotec)、TSPO(NP155;日本千叶国立放射科学研究所Higuchi博士赠送的礼物)和vimentin(ab24525;1:1000,Abcam)的一级抗体。用共焦显微镜(LSM 510;卡尔蔡司)拍摄染色切片图像。TSPO抗体先前通过Western blot和免疫荧光验证(Ji等人,2008年). 此外,通过省略初级抗体进行阴性对照,未产生明显染色。
尸检图像配准和三维重建。
使用1200 dpi平面内分辨率(21×21μm)的高分辨率平板扫描仪(ImageScanner III;GE Healthcare)将两组GFAP标记的组织切片数字化为24位彩色图像2,像素大小)来进行三维重建。使用BrainVISA/Anatomist软件包进行图像处理。在校正个别切片特定的2D变形后,使用摄影体积作为几何参考,重建GFAP组织学体积。首先,如前所述,将块面照片自动分割,以将脑组织从嵌入介质中分离出来(Dubois等人,2007年). 然后将一系列分段照片叠放在Z轴-创建全脑空间相干摄影体积的方向(分辨率为0.03×0.03×0.1 mm3). 然后,数字化的GFAP标记切片被堆叠在Z轴-使用BrainVISA的BrainRAT模块进行指导。然后,使用块匹配配准方法,将包括纹状体在内的堆积组织学体积的每个部分与其相应的块面照片进行配准(Ourselin等人,2001年). 基于2D仿射变换,对所有可用切片重复此注册过程,以获得空间一致的GFAP组织学体积(分辨率为0.021×0.021×0.1 mm3).
RT-qPCR。
在戊巴比妥麻醉下,分别在左右纹状体注射lent-LacZ和lent-CNTF,杀死5只大鼠。快速收集大鼠大脑,将每个纹状体从1mm冠状切片上切割下来,保存在RNAlater(Sigma)中,直到进行额外处理。用Trizol(Invitrogen)从纹状体样品中分离出总RNA,在RNA清理柱上纯化,用DNA酶(Macherey-Nagel)在柱上消化残余DNA。使用RT从0.5μg RNA合成cDNA2SABiosciences提供的PCR阵列第一股试剂盒遵循制造商的说明。cDNA与RT混合2实时SYBR Green PCR混合物(SABiosciences),并分配到定制的qPCR阵列板中,该阵列板包含每个孔中感兴趣基因的特定引物(参见表1). 对于每个样品(即平板),我们检查了三个质量控制(基因组DNA无污染、RT和qPCR反应效率)是否符合制造商的说明。三个基因(IL-1β,干扰素γ、和Ccl2公司)无法在任何或多个样品中检测到,因此未进行分析。感兴趣基因的丰度被归一化为家政基因的丰满度肌动蛋白使用ΔCt方法。肌动蛋白以及其他家务基因(GAPDH公司,乳酸脱氢酶)在PCR阵列板上研究,两组之间没有差异。使用针对大鼠的特异性引物对这些纹状体cDNA样品进行额外的qPCRTSPO公司(正向引物GCTGCCCGCTTGGTATCCT;反向引物CCCTCGCCACAGAGTATCA)。TSPO丰度标准化为每个样品中亲环素A的丰度(正向引物ATGGCAAATGCTGGACCAAA;反向引物GCCTTCACCTCCAAA)。
表1。 CNTF激活星形胶质细胞,对其他神经炎症标记物的影响有限
蛋白质斑点。
分别在左右纹状体注射lent-LacZ和lent-CNTF的三只大鼠在戊巴比妥麻醉下死亡。纹状体在冰上迅速被切割出来,并在50米内均匀化米三氯化氢,pH 7.4,100 m米氯化钠和1%十二烷基硫酸钠,配蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏)。如前所述,使用ECL检测进行蛋白质印迹(Escartin等人,2011年)使用针对肌动蛋白(1:5000)和TSPO(1:500)的抗体。
统计分析。
数据表示为平均值±SEM。n个表示大鼠数量。使用配对进行左右对比t吨测试。TAC用于[18F] DPA-714和[11C] SSR180575通过双向重复测量方差分析(时间,注射侧)进行分析。
结果
CNTF选择性激活星形胶质细胞
我们以前曾报道过慢病毒介导的大鼠纹状体细胞因子CNTF的基因转移激活星形胶质细胞,但对小胶质细胞和神经元无明显影响(Escartin等人,2006年). 为了进一步描述我们的啮齿动物脑星形胶质细胞选择性激活模型,我们使用RT-qPCR阵列量化了几种神经炎症标记物的表达(表1). 我们将lent-CNTF的作用与lent-LacZ进行了比较,正如之前通过多种组织学和功能指标所证明的那样,lent-Lac Z与溶媒注射相比,在大脑中不会引起神经炎症或非特异性作用(Escartin等人,2006年,2007).
在这里,我们发现CNTF诱导星形胶质细胞反应性的两个经典标记物的强烈表达:波形蛋白和GFAP(分别是lent-LacZ的8.3倍和12.7倍,第页<0.005,成对t吨测试;图1A类,表1). 与对星形胶质细胞的强烈影响相反,CNTF没有显著改变反应性小胶质细胞标记物IBA1和CD11b的mRNA水平(分别是lent-LacZ的1.4倍和1.7倍,第页>0.05,成对t吨测试)。CNTF还使促炎细胞因子TNFα的mRNA水平略有增加(与Lent-LacZ大鼠相比,增加了两倍,第页<0.05,成对t吨试验)和Noxa1 mRNA水平显著但最小的增加(1.2倍于lent-LacZ,第页<0.005,成对t吨测试)。最后,CNTF显著降低Ncf2和Ptgs2的表达(分别为,第页<0.05和第页<0.005,成对t吨测试)。许多其他神经炎症标记物,如细胞因子、趋化因子和活性氧产生酶,保持不变(表1)证实了lent-CNTF对星形胶质细胞的选择性激活。
图1。 CNTF选择性地激活星形胶质细胞。A类CNTF增加GFAP和波形蛋白的mRNA水平,但对小胶质细胞标记物IBA1和CD11b没有显著影响。mRNA水平归一化为肌动蛋白,并与LacZ组的水平相对表达(设定为100%)。n个= 5; **第页<0.005,成对t吨测试。B–E类、大鼠大脑左右纹状体分别注射lent-LacZ和lent-CNTF后的免疫染色。CNTF增加星形胶质细胞中间丝GFAP的表达(B类)和波形蛋白(C类). 高倍镜下,星形胶质细胞表现出典型的反应性肥大形态(D类). 与星形胶质细胞相比,CNTF对小胶质细胞IBA1表达的影响有限。E类ED1/CD68是反应性小胶质细胞的一种选择性标记物,在两侧纹状体的背景水平表达。比例尺:2.5 mm和50μm。切片用苏木精/蓝色复染。F类,背景减影后注射lent-LacZ或lent-CNTF后测量纹状体的染色强度。n个=6只大鼠,每只大鼠有6-8个切片*第页< 0.05, **第页< 0.005, ***第页<0.001,成对t吨测试。G公司GFAP和IBA1的免疫荧光染色证实,与注射QA的阳性对照脑相比,CNTF在星形胶质细胞中诱导强烈的形态学变化,但在小胶质细胞中没有。共焦图像投影。比例尺,10μm。
此外,免疫染色显示,CNTF可诱导星形胶质细胞的强烈激活和小胶质细胞的轻微激活。我们观察到注射lent-CNTF的纹状体中GFAP和波形蛋白免疫反应性显著增加(分别是lent-LacZ的2.2倍和3.2倍,第页< 0.005;图1B类,C类,F类). 与慢CNTF对小胶质细胞的限制性激活一致,注射慢CNTF的纹状体中IBA1染色仅无显著增加(图1D类,F类)ED1/CD68,一种反应性小胶质细胞的标记物(1.2倍,第页< 0.05;图1E类,F类). 作为阳性对照,我们证实这些小胶质细胞标记物是由QA强烈诱导的(数据未显示),QA是一种已知可诱导显著神经炎症反应的兴奋毒素(Ryu等人,2005年). 我们观察到,注射透镜-CNTF的纹状体中IBA1阳性细胞的数量增加(1.8倍,第页<0.05 vs lent-LacZ),但与QA诱导的结果相比仍处于边缘状态(5.9倍,第页< 10−5; 数据未显示)。
为了进一步分析CNTF在星形胶质细胞和小胶质细胞中诱导的形态学变化,我们在较厚的切片上使用共焦荧光显微镜。在注射lent-CNTF的纹状体中,星形胶质细胞表现出典型的反应性特征:它们肥大并且高水平表达GFAP(图1G公司). 相反,IBA1阳性的小胶质细胞表现出正常的静息形态,具有薄突起,与QA注射纹状体中观察到的变形虫样小胶质细胞非常不同(图1G公司).
CNTF在mRNA、蛋白质和细胞水平上的作用特征表明,CNTF选择性激活星形胶质细胞,对小胶质细胞的影响最小。
[18F] DPA-714和[11C] SSR180575显示与透镜-CNTF注射纹状体的特异性结合
两者都有[18F] DPA-714和[11C] 与对侧注射lent-LacZ相比,注射lent-CNTF的SSR180575显示纹状体摄取增加(图2A类,B类). 如的TAC所示[18F] DPA-714,双侧注射后2分钟内达到峰值(图2C类). 最大摄取量[11C] 注射后2-5分钟,SSR180575出现短暂的平台(图2D类). 在注射透镜-CNTF的纹状体中[18F] DPA-714随后迅速洗脱(注射后20分钟时最大摄取量的−30%)。这种冲刷速度较慢[11C] SSR180575(注射后20分钟最大摄取量的−9%)。对于这两种放射性配体,注射lent-LacZ的纹状体的洗入和洗出阶段比注射lent-CNTF的纹状体快,并且药物动力学根据注射的慢病毒(时间×注射侧,第页< 10−4,双向重复测量方差分析)。这两种放射性配体都强调了lent-CNTF和lent-LacZ侧之间的显著差异(第页< 10−4,双向重复测量方差分析)。在放射配体给药后30和90分钟内,注射lent-CNTF的纹状体与注射lent-LacZ的纹状体中的平均摄取率在[11C] SSR180575(3.35±0.87)与[18F] DPA-714(2.29±0.67),尽管不显著(第页=0.09,未配对t吨测试)。
图2。 [18F] DPA-714和[11C] SSR180575结合到透镜-CNTF注射的纹状体。%SUV汇总PET图像的冠状大鼠脑视图(超过90分钟)[18F] DPA-714型(A类)和[11C] 180575瑞典先令(B类)在与单个MRI联合配准后,在纹状体中观察到两种放射性配体注射lent-CNTF后的大面积放射性配体结合。TAC用于[18F] DPA-714型(C类,n个=6)和[11C] 180575瑞典先令(D类,n个=4)在注射了CNTF的晶状体和注射了LacZ的对侧纹状体中。TAC表示为平均%SUV。这两种放射性配体在lent-CNTF和lent-LacZ纹状体之间显示出强烈的显著差异(第页< 10−4对于两种放射性配体,双向重复测量方差分析)。颜色编码的刻度单位为贝克勒尔/立方厘米。
通过使用过量的参考配体PK11195进行预饱和和置换研究,测试每个放射性配体对TSPO的结合选择性。这些实验是在同一只大鼠上进行的,以基线采集为参考。在使用未标记的PK11195进行预饱和后,两种放射性配体进入纹状体的吸收速度更快,且高于基线实验中观察到的水平。更快的洗脱使两侧的放射性配体摄取降低到背景水平(图3A类,B类). 这种在PK11195预饱和时较高的初始放射性摄取与TSPO放射性配体是常见的,因为它还阻断了外周TSPO结合位点,诱导了较高的血浆游离放射性配体水平(Venneti等人,2006年). 通过注射未标记的PK11195(1 mg/kg),在注射[18F] DPA-714和[11C] 180575瑞典先令。注射PK11195诱导两者的快速下降[18F] DPA-714和[11C] 透镜-CNTF注射纹状体中SSR180575的结合(图3,4). 位移将信号降低到与预饱和相当的背景水平,但速度更快[18F] DPA-714(5分钟)比[11C] SSR180575(10分钟)(图3B类). 在两个纹状体都观察到移位,尽管在晶状体LacZ侧的移位程度要小得多(图3).
图3。 [18F] DPA-714和[11C] SSR180575结合预饱和,并被过量的PK11195取代。A类,B类,预饱和[18F] DPA-714和[11C] 在放射配体给药前5分钟,分别注射2和5 mg/kg PK11195对SSR180575进行测试。的位移[18F] DPA-714和[11C] 放射性配体给药后15分钟和20分钟,分别用1mg/kg PK11195诱导SSR180575(箭头)。显示的TAC用于[18F] DPA-714型(A类)和[11C] 180575瑞典先令(B类)在lent-CNTF和lent-LacZ纹状体上。显示了额外的基线实验;对每种放射性配体在同一只大鼠上进行所有三项检查。
图4。 代表性PET图像[18F] DPA-714预饱和和置换。冠状大鼠脑视图[18F] DPA-714%SUV汇总PET图像(超过90分钟),与基线下的单个MRI共同登记(A类),预饱和(B类)、和位移条件(C类:前15分钟SUV总形象的百分比;D类:过去75分钟内SUV的总形象百分比)。色标单位为贝克勒尔/立方厘米。
CNTF激活的星形胶质细胞过度表达TSPO
为了证明注射晶状体-CNTF的纹状体中的PET信号在解剖学上与GFAP的免疫阳性区域相匹配,我们使用块照片参考体积重建了标记为GFAP的连续脑切片的三维结构(见材料和方法)。的体积[18F] DPA-714结合与GFAP阳性体积一致(图5),观察到类似的模式[11C] SSR180575(数据未显示)。
图5。 GFAP阳性组织学体积与放射配体结合体积相匹配。对大鼠进行[18F] DPA-714 PET和MRI扫描(B类,D类,一层楼,地上二层)并对他们的大脑进行切割和GFAP免疫组织化学处理(A类,C类,电子1,E2级). PET和MRI 3D图像被联合注册以提供融合图像,如所示B类(日冕视图),D类(轴向视图),一层楼(左矢状图),以及地上二层(右矢状图)。在大脑切割过程中,拍摄了块面照片,以重建死后大脑的三维结构,并允许重叠数字化和三维重建GFAP染色的切片(较轻的带C类,电子1,E2级). GFAP阳性组织学体积与[18F] 注射lent-CNTF的右纹状体可见DPA-714 PET信号。色标单位为贝克勒尔/立方厘米。
为了进一步证实TSPO PET信号来源于CNTF激活的星形胶质细胞,我们通过双重免疫染色研究了TSPO纹状体的表达。我们发现注射lent-CNTF的纹状体中TSPO免疫反应增强,与GFAP阳性区域重叠(图6A类). 在注射透镜-CNTF的纹状体中过度表达TSPO的细胞对GFAP具有强烈的免疫反应性(图6A类). 相反,在同一区域,TSPO与CD11b阳性小胶质细胞的共定位程度很低(图6B类). 在注射lent-LacZ的对侧,GFAP和TSPO染色最小(图6A类). 这种基本TSPO染色与CD11b染色完全共定位,表明TSPO在静息小胶质细胞中表达水平较低(图6B类). 针对TSPO、CD11b和波形蛋白的三重免疫染色证实TSPO在CNTF激活的星形胶质细胞中过度表达(图6C类).
图6。 TSPO被CNTF激活的星形胶质细胞过度表达。A类在注射lent-LacZ的纹状体中,GFAP(红色)和TSPO(绿色)染色水平较低。指针轨迹由星号表示。在注射lent-CNTF的纹状体中,TSPO染色非常强烈,与显示GFAP阳性反应性星形胶质细胞的区域相匹配(左虚线区域)。TSPO在GFAP阳性星形胶质细胞(白色箭头)中表达最高。比例尺,20μm。B类相反,在注射透镜-CNTF的纹状体中,TSPO(绿色)与CD11b标记的小胶质细胞(红色开放箭头)只有有限的共定位。在注射lent-LacZ的对照纹状体中也观察到这种共定位,并产生最小的PET信号。CD11b染色在有反应性星形胶质细胞的区域没有明显增强(破折号以上区域)。比例尺,20μm。C类在高倍镜下,在注射了CNTF的晶状体纹状体中,波形蛋白阳性反应性星形胶质细胞(蓝色、白色箭头)表达高水平的TSPO(绿色),而CD11b标记的小胶质细胞(红色、开放箭头)表达检测不到的TSPO水平。比例尺,10μm。
为了评估反应性星形胶质细胞中TSPO表达的增加是否源于mRNA水平的增加,我们分别在大鼠左右纹状体注射lent-LacZ和lent-CNTF后进行RT-qPCR。CNTF诱导TSPO mRNA水平增加四倍(第页<0.05,成对t吨测试;图7A类). 重要的是,lent-LacZ对照组和非注射对照组的TSPO mRNA水平相似(数据未显示)。我们最后在纹状体蛋白匀浆上进行了蛋白质印迹,以通过密度计评估TSPO蛋白水平。CNTF使TSPO水平(归一化为肌动蛋白)显著增加6倍(第页<0.05,成对t吨测试;图7A类,B类).
图7。 CNTF增加TSPO表达。分别在大鼠左右纹状体注射lent-LacZ(LacZ,L)和lent-CNTF(CNTF,C)后,用RT-qPCR和Western blot分析纹状体样本。A类,CNTF显著增加TSPO表达。TSPO mRNA和蛋白水平分别归一化为亲环素和肌动蛋白,并与LacZ组的水平相对表达(设为1)。n个=5和n个分别=3*第页<0.05,成对t吨测试。B类TSPO的代表性Western blot。