道德声明
所有实验均经安徽医科大学第二医院伦理委员会和实验动物伦理委员会批准。每位参与者都获得了书面知情同意书。术中严格按照标本采集标准采集48例卵巢癌患者的组织标本。所有的努力都是为了减少痛苦。
卵巢癌分子机制的生物信息学预测
在基因表达总括(GEO)数据库中搜索卵巢癌基因表达芯片(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo网站/). 采用GSE14407、GSE18520、GSE38666和GSE66957芯片筛选卵巢癌差异表达基因。所用芯片的详细信息如表所示1R语言亲和包用于基因表达数据的背景校正和标准化预处理,limma包用于筛选差异表达基因。正确的第页值表示为调整P.Va.l;|log2 FC| > 3.0和第页价值 < 以0.05为筛选差异表达基因的阈值。jvenn分析了四种基因芯片的差异表达基因(http://JVenn.tour.inra.fr/app/example.htmL). 使用Chilibot(http://www.childbot.net/index.htmL)探讨差异表达基因与卵巢癌的关系。DisGeNET基因诊断相关数据库(http://www.disgenet.org/web/disgenet/menu/search?4)用于筛选卵巢癌相关基因。将差异表达基因和卵巢癌相关基因导入String数据库(https://string-db.org/),并进行了基因功能分析和相互作用分析。用Cytoscape 3.6.0软件可视化基因相互作用网络[14].
细胞和组织样本
5株卵巢癌细胞系(SKOV3、CAOV3,HO8910、PEO4、A2780)和1株正常卵巢细胞系(IOSE80)均购自中国科学院上海细胞生物学研究所。
共收集48例卵巢癌组织,均来自安徽医科大学第二医院卵巢癌手术患者。组织在− 80°C,用自动脱水器脱水,然后嵌入石蜡中并保存。
OCSC的分类和识别
为了鉴定和分选卵巢癌干细胞,使用了免疫磁珠分选。收集对数生长期SKOV3细胞,用300μL磷酸盐缓冲液(PBS)缓冲液(0.5%牛血清白蛋白(BSA)、2 mM乙二胺四乙酸(EDTA)、0.01%PBS)洗涤。总共100μL FCR阻滞剂和100μL分化簇90+(CD90+)加入磁性微床,将细胞完全悬浮后,在4°C的黑暗中培养30min。然后用PBS清洗细胞10至20次,并在179℃下离心克持续5分钟。去除冲洗缓冲液并添加500μL PBS,将细胞悬浮液转移到安装在磁性分选架上的MS分选柱中,并使用巴斯德管。取下细胞悬液后,细胞(CD90−)用4倍体积的缓冲液从分类柱中取出,然后收集。取下缓冲液后,加入1mL缓冲液,从磁分选架上取下分选柱,并取下缓冲溶液(含CD90+细胞)通过与分选柱匹配的塞子泵入收集瓶中。已分拣CD90的零件+将干细胞接种到100 mL培养瓶中,并与10 mL Dulbecco改良鹰培养基(DMEM)/F12(1:1)CO孵育2培养基(含20μg/L EGF、20μg/LbFCF和20μg/LLIF)。每4天更换一次培养基。剩余CD90+细胞和CD90−细胞在RPMI1640无血清培养基(SFM)和5%CO中培养2分别为37°C培养箱。CD90的细胞形态与肿瘤球形成+每天观察干细胞。
在鉴定OCSC时,采用逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和western blot分析检测干细胞相关基因CD44、Nanog和Oct4的表达。甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)被用作内部参考基因,该基因的相对表达表示为2-ΔΔCt通过肿瘤球体形成实验富集肿瘤干细胞。
细胞分组和转染
慢病毒载体用于包装三对si-ST6GALNAC1(si-1[CAGUUUACAGUUGUGAAAUC]、si-2[GGAGCAGUGUCACAAGGACGG]、si-3[GGCUCAUGUUAAGACAAAGG])和过表达质粒(ST6GALNAC1)。以空载体si-NC和PCDNA3.0作为沉默和过度表达对照。之后,根据lip2000的说明对细胞进行处理,并选择沉默效果最佳的si-3进行后续实验。
收集的OCSC被随机分为8组:si-NC(沉默空白质粒感染细胞)、si-ST6GALNAC1(沉默ST6GALNA质粒感染细胞,LY294002(Akt信号通路抑制剂LY29400处理的细胞),ST6GALNAC1 + DMSO和ST6GALNAC1 + LY294002组。在处理前24小时,将细胞接种到6孔板中。当细胞汇合达到50%左右时,立即通过脂质体胺2000(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德因维特罗根)治疗OCSC。处理6小时后,更换培养基,继续培养OCSCs 48小时,然后收集用于随后的实验。
RT-qPCR
使用TRIzol(Invitrogen,Carlsbad,California,USA)从组织和细胞中提取总RNA。RT-qPCR引物序列如表所示2反应条件为95°C预纯化10min,95°C变性40s,60°C退火20s,72°C延伸34s。GAPDH作为内部参考。基因的相对表达计算为2-ΔΔCt每个实验重复三次。
蛋白质印迹分析
细胞在RIPA裂解缓冲液(BB-3209,Best Bio biotechnology Company,Shanghai,China)中进行裂解,细胞裂解产物通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶电泳分离,然后转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。将膜与ST6GALNAC1(ab82821,1:1000)、Oct4(ab18976,1:1000)、CXCL16(ab101404,1:2000)、p-PI3K(ab182651,1:2000)和CD44(ab157107,1:2000)的初级多克隆兔抗体以及PI3K(ab151549,1:1000)、Akt(ab179463,1:1000)、p-Akt(ab192623,1:1000)的初级单克隆抗体在4°C下孵育过夜,Nanog(ab109250,1:1000)、S6(ab32529,1-1000)、p-S6(ab109393;1:1000),表皮生长因子受体(EGFR)(ab52894,1:1000,)、β-连环蛋白(ab32572,1:5000)和GAPDH(ab181603,1:5000,)。这些抗体均来自Abcam公司(美国马萨诸塞州剑桥)。然后将膜与辣根过氧化物酶(HRP)山羊抗兔抗体(A2012,ABBkine,California,USA)在37°C下孵育1小时。GAPDH被用作内部控制。结果表明,目标蛋白的相对水平等于同一样品的目标蛋白带灰度值/GAPDH带灰度值。每个实验重复三次。
EdU分析
将对数期的细胞接种到96个带有4个 × 10三–1 × 105细胞每孔培养至正常生长期。用细胞培养基将EdU溶液稀释至最终浓度50μM。每个孔用100μL 50μM EdU培养基培养2 h。然后用PBS清洗细胞1-2次,每次5分钟。每个孔在室温下与50μL细胞固定液(含4%多聚甲醛的PBS)孵育30分钟,然后与50μL2 mg/mL甘氨酸孵育5分钟。培养后,在每个孔中用100μL渗透剂(0.5%Triton X-100 PBS)培养细胞10分钟。接下来,向每个孔中添加100μL的1X Apollo染色反应溶液,并在室温下的暗室中反应30分钟,然后用100μL渗透剂清洗细胞2-3次,每次10分钟。之后,每个孔用100μL甲醇洗涤1至2次,每次5分钟,然后在PBS中洗涤一次,每次5分钟。用去离子水以100:1的比例稀释试剂F。向每个孔中加入100μL 1×Hoechst33342反应溶液,并在室温下的暗室中反应30 min。图像是在荧光显微镜下获得的。计算标记有(红色)或无(蓝色)的细胞数。EdU阳性细胞率 = 用EdU标记的细胞数/(用EdU标识的细胞数 + 未标记单元格的数量) × 100%.
Transwell分析
为了进行和了解Transwell分析的结果,研究了细胞迁移。当细胞融合达到80%时,将细胞在无血清的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中饥饿24小时。Transwell(美国纽约州科宁)的下室在37°C下与无血清DMEM预孵育1小时。将细胞消化,再悬浮在无血清DMEM中,并稀释至3 × 105细胞/mL,然后将100μL细胞添加到心尖室,并将600μL 10%血清DMEM培养基添加到基底侧室(血清用作趋化因子)。培养24小时后,将Transwell室上表面的细胞移除。用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗培养箱,在预冷甲醇中浸泡30分钟,以固定到达培养箱底部的细胞,然后用0.1%结晶紫溶液染色10分钟。共选择了6个区域,并在倒置显微镜下采集图像(日本东京奥林巴斯)。随后对细胞进行计数,并重复实验3次。
进行Transwell分析的第二部分是研究细胞侵袭。Matrigel在无血清DMEM中以1:10的比例稀释。接种细胞的浓度调整为1.0 × 105细胞/mL,其余操作与细胞迁移实验中的操作相同。实验重复5次。
肿瘤球形成
总共1个 × 104CD90型+将OCSC接种于低吸附96-well板中,在含有20 ng/mL表皮生长因子(EGF)和20 ng/mL转化生长因子-β(FGF-β)的无血清DMEM-F12培养基中培养,每2天进行一次液体半定量变化。在连续培养10天后,使用70μM滤膜过滤微球,放弃过滤,并对剩余小于70μM的微球进行计数[15].
软琼脂中菌落的形成
使用新鲜DMEM培养基制备总共0.7%的低熔点琼脂糖,并将2mL琼脂糖涂敷在直径为100mm的培养皿上。将细胞悬液(1mL)与1mL 0.7%琼脂糖溶液混合,在琼脂糖凝固后轻轻接种到培养皿中,制备三个重复。细胞在37°C和5%CO下培养21个月,细胞培养基每2至3天更换一次。然后在倒置显微镜下对细胞进行计数。只有含有50个以上细胞的肿块被判定为细胞集落,并拍摄图像。
体内极限稀释试验
将细胞接种到低粘附性培养板上。培养7天后,将OCSC球收集到10 mL玻璃离心管中,离心,并丢弃上清液。然后用生理盐水清洗细胞一次。将总计1 mL 0.5%胰蛋白酶添加到37°C的培养箱中。每2分钟轻轻翻转一次盘子底部。将细胞消化10分钟以制备单个细胞。通过添加3 mL完整培养基终止培养,然后离心细胞以收集细胞沉淀。然后用生理盐水清洗细胞一次。将细胞加入适量的生理盐水,然后轻轻移液至单细胞悬浮液中进行细胞计数。不同数量的细胞(1 × 10三,第5页 × 10三, 1 × 104、和5 × 104)分别重新悬浮于50μL生理盐水中,然后与50μL基质胶(1:1)混合,并皮下接种至NOD-SCID小鼠。接种两周后,观察并记录肿瘤形成情况。使用ELDA软件计算肿瘤干细胞比率(http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.htmL) [16].
裸鼠肿瘤发生
将细胞接种到低粘附培养板上。培养7天后,将OCSC球收集到10 mL玻璃离心管中,离心,并丢弃上清液。用生理盐水清洗球体一次,并在37°C下将总计1 mL 0.5%胰蛋白酶添加到培养箱中,每2分钟轻轻翻转底部。处理10分钟后,细胞球分解为单个细胞。然后向细胞加入3mL完全培养基以终止培养,并离心以收集细胞沉淀,并用盐水洗涤细胞一次。加入适量的生理盐水,用移液管将细胞轻轻移到单细胞悬浮液中,进行细胞计数。总共2个 × 106将细胞重新悬浮在50μL生理盐水中,与50μL基质(1:1)混合。共36只NOD-SCID小鼠被分为si-NC组(接种沉默空质粒OC干细胞的NOD-SCED小鼠)、si-ST6GALNAC1(接种沉默ST6GALNA质粒OCSC的NOD-SCID小鼠)、空载体组(接种无沉默空质粒的OCSC的NOD-SCID鼠)、,ST6GALNAC1组(NOD-SCID小鼠接种过表达的OCSC质粒),ST6GALNAC1 + 二甲基亚砜组(NOD-SCID小鼠接种过表达的OCSC及质粒和DMSO癌干细胞)和ST6GALNAC1 + LY294002组(NOD-SCID小鼠接种带有质粒的过表达OCSC,并注射带有Akt信号通路抑制剂的OCSC)。每组包含6个样本。将细胞皮下接种到NOD-SCID小鼠。接种两周后,记录肿瘤体积。
免疫组织化学染色
使用免疫组织化学试剂盒(Key-GEN,中国南京)对β-连环蛋白(CST,9562S)进行免疫组织化学染色。从安乐死小鼠收集的肿瘤组织用福尔马林固定并用石蜡包埋。然后将石蜡包埋组织切片脱蜡、水合、在1%PBST中清洗,并在37°C下用5%BSA封闭1h。然后将载玻片与含有5%BSA的PBS中的抗体在4°C下孵育过夜,然后在室温下添加生物素化二级抗体孵育1小时。然后用链霉亲和素-辣根-过氧化物酶培养载玻片,用二氨基联苯胺(DAB)底物染色,并用苏木精复染。之后,在倒置显微镜下观察组织(美国宾夕法尼亚州中心谷奥林巴斯)。
统计分析
使用SPSS 21.0(IBM-SPSS,美国伊利诺伊州芝加哥)进行统计分析。每个实验至少进行三次。测量数据用平均值表示 ± 标准偏差。数据符合正态分布,方差均匀。使用配对分析ST6GALNAC1在癌组织和癌旁组织中的表达t吨测试。其他两组之间的数据由未成对的t吨测试(独立样本t吨测试)。采用Kolmogorov–Smirnov方法进行数据正态性检验,采用单向AVONA对正态分布的多组数据进行比较,其中Tukey的事后检验用于多重比较。通过重复测量方差分析比较实验过程中不同时间点的增殖能力。A类第页价值 < 0.05表示显著的统计学差异。