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ST6GALNAC1通过Akt信号通路在卵巢癌干细胞增殖、迁移和侵袭中的刺激作用

摘要

背景

卵巢癌是世界上女性最常见的癌症之一。ST6GALNAC1在肿瘤干细胞(CSC)中高度表达,与高肿瘤启动、自我更新和分化能力相关。本研究旨在探讨ST6GALNAC1如何影响卵巢癌干细胞(OCSC)。

方法

为了确定与卵巢癌相关的差异表达基因,使用基于微阵列的卵巢癌基因表达谱,ST6GALANC1是已确定的靶点之一。然后检测OCSC和卵巢癌细胞中ST6GALNAC1的水平。随后,Akt信号通路抑制剂LY294002被引入分化簇90+(CD90+)检测干细胞、细胞增殖、迁移和侵袭、CXCL16、EGFR、CD44、Nanog和Oct4水平以及OCSC的致瘤性。

结果

通过使用综合微阵列分析,确定ST6GALNAC1在卵巢癌中高表达,并调节Akt信号通路。在OCSC和卵巢癌细胞中观察到高水平的ST6GALNAC1。沉默ST6GALNAC1能够减少OCSC的细胞增殖、迁移、侵袭、自我更新能力和致瘤性。根据这些结果,ST6GALNAC1在OCSC中的作用依赖于Akt信号通路。

结论

综合起来,我们的研究结果确定了ST6GALNAC1在卵巢癌和OCSC中的潜在刺激作用,这依赖于Akt信号通路。

背景

据报道,卵巢癌占女性恶性肿瘤的近2.5%,占女性癌症相关死亡的5%。这主要是由于晚期诊断导致生存率低所致[1]. 卵巢癌长期以来一直是一种复杂的恶性肿瘤,往往难以诊断和治疗[2]. 90%以上的恶性卵巢肿瘤是癌,可能起源于卵巢表面上皮和/或输卵管,预后不良,5年总生存率低于40%[].

癌干样细胞(CSC)或癌诱导细胞(CIC)是高度致瘤的癌细胞,通常具有自我更新、分化和肿瘤发生的能力[4]. CSC曾被认为是肿瘤表型和功能异质性的原因,也是化疗耐药和最终肿瘤复发的原因之一[5]. 卵巢癌晚期患者的治疗包括细胞还原手术和铂类细胞毒性化疗,但由于大多数患者复发,这两种方法都被认为是失败的[6]. 因此,迫切需要寻找新的治疗和诊断靶点,以帮助改善卵巢癌患者的预后和治疗。

ST6GALNAC1编码唾液酸转移酶,该酶可催化合成对细胞迁移至关重要的癌相关唾液酸-Tn(sTn)抗原[7]. 据报道,ST6GALNAC1在胃癌、乳腺癌和前列腺癌细胞系中过度表达,诱导sTn表达[8,9,10,11]. 先前的研究表明,ST6GALNAC1通过激活Akt信号通路在提高结直肠癌CSC表型中发挥了作用[4]. Akt信号通路是一种重要的细胞内通路,可以调节多种细胞过程,包括细胞稳态、增殖、存活、迁移和分化。[12]. Akt信号通路在近70%的卵巢癌中被激活,导致过度活跃的信号传递,促进细胞生长、增殖和血管生成[13]. ST6GALNAC1很可能通过Akt信号通路影响卵巢癌干细胞(OCSC)的生物学特性。因此,在本研究中,目的是研究ST6GALNAC1在卵巢癌发生发展中的作用,以及是否通过Akt信号通路发挥作用。

材料和方法

道德声明

所有实验均经安徽医科大学第二医院伦理委员会和实验动物伦理委员会批准。每位参与者都获得了书面知情同意书。术中严格按照标本采集标准采集48例卵巢癌患者的组织标本。所有的努力都是为了减少痛苦。

卵巢癌分子机制的生物信息学预测

在基因表达总括(GEO)数据库中搜索卵巢癌基因表达芯片(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo网站/). 采用GSE14407、GSE18520、GSE38666和GSE66957芯片筛选卵巢癌差异表达基因。所用芯片的详细信息如表所示1R语言亲和包用于基因表达数据的背景校正和标准化预处理,limma包用于筛选差异表达基因。正确的第页值表示为调整P.Va.l;|log2 FC| > 3.0和第页价值 < 以0.05为筛选差异表达基因的阈值。jvenn分析了四种基因芯片的差异表达基因(http://JVenn.tour.inra.fr/app/example.htmL). 使用Chilibot(http://www.childbot.net/index.htmL)探讨差异表达基因与卵巢癌的关系。DisGeNET基因诊断相关数据库(http://www.disgenet.org/web/disgenet/menu/search?4)用于筛选卵巢癌相关基因。将差异表达基因和卵巢癌相关基因导入String数据库(https://string-db.org/),并进行了基因功能分析和相互作用分析。用Cytoscape 3.6.0软件可视化基因相互作用网络[14].

表1卵巢癌基因芯片信息

细胞和组织样本

5株卵巢癌细胞系(SKOV3、CAOV3,HO8910、PEO4、A2780)和1株正常卵巢细胞系(IOSE80)均购自中国科学院上海细胞生物学研究所。

共收集48例卵巢癌组织,均来自安徽医科大学第二医院卵巢癌手术患者。组织在−80°C,用自动脱水器脱水,然后嵌入石蜡中并保存。

OCSC的分类和识别

为了鉴定和分选卵巢癌干细胞,使用了免疫磁珠分选。收集对数生长期SKOV3细胞,用300μL磷酸盐缓冲液(PBS)缓冲液(0.5%牛血清白蛋白(BSA)、2 mM乙二胺四乙酸(EDTA)、0.01%PBS)洗涤。总共100μL FCR阻滞剂和100μL分化簇90+(CD90+)加入磁性微床,将细胞完全悬浮后,在4°C的黑暗中培养30min。然后用PBS清洗细胞10至20次,并在179℃下离心持续5分钟。去除冲洗缓冲液并添加500μL PBS,将细胞悬浮液转移到安装在磁性分选架上的MS分选柱中,并使用巴斯德管。取下细胞悬液后,细胞(CD90)用4倍体积的缓冲液从分类柱中取出,然后收集。取下缓冲液后,加入1mL缓冲液,从磁分选架上取下分选柱,并取下缓冲溶液(含CD90+细胞)通过与分选柱匹配的塞子泵入收集瓶中。已分拣CD90的零件+将干细胞接种到100 mL培养瓶中,并与10 mL Dulbecco改良鹰培养基(DMEM)/F12(1:1)CO孵育2培养基(含20μg/L EGF、20μg/LbFCF和20μg/LLIF)。每4天更换一次培养基。剩余CD90+细胞和CD90细胞在RPMI1640无血清培养基(SFM)和5%CO中培养2分别为37°C培养箱。CD90的细胞形态与肿瘤球形成+每天观察干细胞。

在鉴定OCSC时,采用逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和western blot分析检测干细胞相关基因CD44、Nanog和Oct4的表达。甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)被用作内部参考基因,该基因的相对表达表示为2-ΔΔCt通过肿瘤球体形成实验富集肿瘤干细胞。

细胞分组和转染

慢病毒载体用于包装三对si-ST6GALNAC1(si-1[CAGUUUACAGUUGUGAAAUC]、si-2[GGAGCAGUGUCACAAGGACGG]、si-3[GGCUCAUGUUAAGACAAAGG])和过表达质粒(ST6GALNAC1)。以空载体si-NC和PCDNA3.0作为沉默和过度表达对照。之后,根据lip2000的说明对细胞进行处理,并选择沉默效果最佳的si-3进行后续实验。

收集的OCSC被随机分为8组:si-NC(沉默空白质粒感染细胞)、si-ST6GALNAC1(沉默ST6GALNA质粒感染细胞,LY294002(Akt信号通路抑制剂LY29400处理的细胞),ST6GALNAC1 + DMSO和ST6GALNAC1 + LY294002组。在处理前24小时,将细胞接种到6孔板中。当细胞汇合达到50%左右时,立即通过脂质体胺2000(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德因维特罗根)治疗OCSC。处理6小时后,更换培养基,继续培养OCSCs 48小时,然后收集用于随后的实验。

RT-qPCR

使用TRIzol(Invitrogen,Carlsbad,California,USA)从组织和细胞中提取总RNA。RT-qPCR引物序列如表所示2反应条件为95°C预纯化10min,95°C变性40s,60°C退火20s,72°C延伸34s。GAPDH作为内部参考。基因的相对表达计算为2-ΔΔCt每个实验重复三次。

表2 RT-qPCR引物序列

蛋白质印迹分析

细胞在RIPA裂解缓冲液(BB-3209,Best Bio biotechnology Company,Shanghai,China)中进行裂解,细胞裂解产物通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶电泳分离,然后转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。将膜与ST6GALNAC1(ab82821,1:1000)、Oct4(ab18976,1:1000)、CXCL16(ab101404,1:2000)、p-PI3K(ab182651,1:2000)和CD44(ab157107,1:2000)的初级多克隆兔抗体以及PI3K(ab151549,1:1000)、Akt(ab179463,1:1000)、p-Akt(ab192623,1:1000)的初级单克隆抗体在4°C下孵育过夜,Nanog(ab109250,1:1000)、S6(ab32529,1-1000)、p-S6(ab109393;1:1000),表皮生长因子受体(EGFR)(ab52894,1:1000,)、β-连环蛋白(ab32572,1:5000)和GAPDH(ab181603,1:5000,)。这些抗体均来自Abcam公司(美国马萨诸塞州剑桥)。然后将膜与辣根过氧化物酶(HRP)山羊抗兔抗体(A2012,ABBkine,California,USA)在37°C下孵育1小时。GAPDH被用作内部控制。结果表明,目标蛋白的相对水平等于同一样品的目标蛋白带灰度值/GAPDH带灰度值。每个实验重复三次。

EdU分析

将对数期的细胞接种到96个带有4个×10–1×105细胞每孔培养至正常生长期。用细胞培养基将EdU溶液稀释至最终浓度50μM。每个孔用100μL 50μM EdU培养基培养2 h。然后用PBS清洗细胞1-2次,每次5分钟。每个孔在室温下与50μL细胞固定液(含4%多聚甲醛的PBS)孵育30分钟,然后与50μL2 mg/mL甘氨酸孵育5分钟。培养后,在每个孔中用100μL渗透剂(0.5%Triton X-100 PBS)培养细胞10分钟。接下来,向每个孔中添加100μL的1X Apollo染色反应溶液,并在室温下的暗室中反应30分钟,然后用100μL渗透剂清洗细胞2-3次,每次10分钟。之后,每个孔用100μL甲醇洗涤1至2次,每次5分钟,然后在PBS中洗涤一次,每次5分钟。用去离子水以100:1的比例稀释试剂F。向每个孔中加入100μL 1×Hoechst33342反应溶液,并在室温下的暗室中反应30 min。图像是在荧光显微镜下获得的。计算标记有(红色)或无(蓝色)的细胞数。EdU阳性细胞率 = 用EdU标记的细胞数/(用EdU标识的细胞数 + 未标记单元格的数量)×100%.

Transwell分析

为了进行和了解Transwell分析的结果,研究了细胞迁移。当细胞融合达到80%时,将细胞在无血清的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中饥饿24小时。Transwell(美国纽约州科宁)的下室在37°C下与无血清DMEM预孵育1小时。将细胞消化,再悬浮在无血清DMEM中,并稀释至3×105细胞/mL,然后将100μL细胞添加到心尖室,并将600μL 10%血清DMEM培养基添加到基底侧室(血清用作趋化因子)。培养24小时后,将Transwell室上表面的细胞移除。用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗培养箱,在预冷甲醇中浸泡30分钟,以固定到达培养箱底部的细胞,然后用0.1%结晶紫溶液染色10分钟。共选择了6个区域,并在倒置显微镜下采集图像(日本东京奥林巴斯)。随后对细胞进行计数,并重复实验3次。

进行Transwell分析的第二部分是研究细胞侵袭。Matrigel在无血清DMEM中以1:10的比例稀释。接种细胞的浓度调整为1.0×105细胞/mL,其余操作与细胞迁移实验中的操作相同。实验重复5次。

肿瘤球形成

总共1个×104CD90型+将OCSC接种于低吸附96-well板中,在含有20 ng/mL表皮生长因子(EGF)和20 ng/mL转化生长因子-β(FGF-β)的无血清DMEM-F12培养基中培养,每2天进行一次液体半定量变化。在连续培养10天后,使用70μM滤膜过滤微球,放弃过滤,并对剩余小于70μM的微球进行计数[15].

软琼脂中菌落的形成

使用新鲜DMEM培养基制备总共0.7%的低熔点琼脂糖,并将2mL琼脂糖涂敷在直径为100mm的培养皿上。将细胞悬液(1mL)与1mL 0.7%琼脂糖溶液混合,在琼脂糖凝固后轻轻接种到培养皿中,制备三个重复。细胞在37°C和5%CO下培养21个月,细胞培养基每2至3天更换一次。然后在倒置显微镜下对细胞进行计数。只有含有50个以上细胞的肿块被判定为细胞集落,并拍摄图像。

体内极限稀释试验

将细胞接种到低粘附性培养板上。培养7天后,将OCSC球收集到10 mL玻璃离心管中,离心,并丢弃上清液。然后用生理盐水清洗细胞一次。将总计1 mL 0.5%胰蛋白酶添加到37°C的培养箱中。每2分钟轻轻翻转一次盘子底部。将细胞消化10分钟以制备单个细胞。通过添加3 mL完整培养基终止培养,然后离心细胞以收集细胞沉淀。然后用生理盐水清洗细胞一次。将细胞加入适量的生理盐水,然后轻轻移液至单细胞悬浮液中进行细胞计数。不同数量的细胞(1×10,第5页×10, 1×104、和5×104)分别重新悬浮于50μL生理盐水中,然后与50μL基质胶(1:1)混合,并皮下接种至NOD-SCID小鼠。接种两周后,观察并记录肿瘤形成情况。使用ELDA软件计算肿瘤干细胞比率(http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.htmL) [16].

裸鼠肿瘤发生

将细胞接种到低粘附培养板上。培养7天后,将OCSC球收集到10 mL玻璃离心管中,离心,并丢弃上清液。用生理盐水清洗球体一次,并在37°C下将总计1 mL 0.5%胰蛋白酶添加到培养箱中,每2分钟轻轻翻转底部。处理10分钟后,细胞球分解为单个细胞。然后向细胞加入3mL完全培养基以终止培养,并离心以收集细胞沉淀,并用盐水洗涤细胞一次。加入适量的生理盐水,用移液管将细胞轻轻移到单细胞悬浮液中,进行细胞计数。总共2个×106将细胞重新悬浮在50μL生理盐水中,与50μL基质(1:1)混合。共36只NOD-SCID小鼠被分为si-NC组(接种沉默空质粒OC干细胞的NOD-SCED小鼠)、si-ST6GALNAC1(接种沉默ST6GALNA质粒OCSC的NOD-SCID小鼠)、空载体组(接种无沉默空质粒的OCSC的NOD-SCID鼠)、,ST6GALNAC1组(NOD-SCID小鼠接种过表达的OCSC质粒),ST6GALNAC1 + 二甲基亚砜组(NOD-SCID小鼠接种过表达的OCSC及质粒和DMSO癌干细胞)和ST6GALNAC1 + LY294002组(NOD-SCID小鼠接种带有质粒的过表达OCSC,并注射带有Akt信号通路抑制剂的OCSC)。每组包含6个样本。将细胞皮下接种到NOD-SCID小鼠。接种两周后,记录肿瘤体积。

免疫组织化学染色

使用免疫组织化学试剂盒(Key-GEN,中国南京)对β-连环蛋白(CST,9562S)进行免疫组织化学染色。从安乐死小鼠收集的肿瘤组织用福尔马林固定并用石蜡包埋。然后将石蜡包埋组织切片脱蜡、水合、在1%PBST中清洗,并在37°C下用5%BSA封闭1h。然后将载玻片与含有5%BSA的PBS中的抗体在4°C下孵育过夜,然后在室温下添加生物素化二级抗体孵育1小时。然后用链霉亲和素-辣根-过氧化物酶培养载玻片,用二氨基联苯胺(DAB)底物染色,并用苏木精复染。之后,在倒置显微镜下观察组织(美国宾夕法尼亚州中心谷奥林巴斯)。

统计分析

使用SPSS 21.0(IBM-SPSS,美国伊利诺伊州芝加哥)进行统计分析。每个实验至少进行三次。测量数据用平均值表示±标准偏差。数据符合正态分布,方差均匀。使用配对分析ST6GALNAC1在癌组织和癌旁组织中的表达t吨测试。其他两组之间的数据由未成对的t吨测试(独立样本t吨测试)。采用Kolmogorov–Smirnov方法进行数据正态性检验,采用单向AVONA对正态分布的多组数据进行比较,其中Tukey的事后检验用于多重比较。通过重复测量方差分析比较实验过程中不同时间点的增殖能力。A类第页价值 < 0.05表示显著的统计学差异。

结果

ST6GALNAC1在卵巢癌中高表达并可能调节Akt信号通路

使用R语言从卵巢癌基因芯片中筛选差异表达基因,并基于|log2 FC从GSE14407、GSE18520、GSE38666和GSE66957微阵列中分别筛选出176、172、158和384个差异表达基因| > 3.0和第页价值 < 0.05. 比较了四个芯片中差异表达的基因,并构建了基因的文氏图谱(图1a) ●●●●。共鉴定出5个交叉基因(intlectin 1(ITLN1)、谷氨酸脱羧酶(GADL1)、分化簇24(CD24)、叶酸受体(FOLR1)和ST6GALNAC1),并进行随访分析。在Chilibot数据库中分析ITLN1、GADL1、CD24、FOLR1、ST6GALNAC1与卵巢癌的关系(图1b) ●●●●。在该数据库中,没有证据表明GADL1和ST6GALNAC1与卵巢癌相关,表明关于GADL1与ST6GALLAC1对卵巢癌的影响的研究很少。在DisGeNET数据库中搜索与卵巢癌相关的基因,并选择前20个基因作为疾病基因。卵巢癌相关差异表达基因和疾病基因的相互作用网络(图1c) 已建立。该网络中最相关的差异基因是FOLR1和ST6GALNAC1,表明这两个基因可能影响卵巢癌。先前的研究已经表明FLOR1的异常表达与卵巢癌有关[17,18]. 关于ST6GALNAC1对卵巢癌的影响的研究很少;因此,本研究旨在探讨ST6GALNAC1在卵巢癌中的差异表达及其可能的分子机制。GSE14407和GSE38666中前50个差异表达基因的热图如图所示1d、 e。ST6GALNAC1在卵巢癌组织中的表达明显高于正常组织。提取ST6GALNAC1在GSE18520和GSE66957芯片中的表达谱,ST6GALLAC1在GSE185020卵巢癌中异常高表达(图1f) 和GSE66957(图1g) 芯片。对String数据库中卵巢癌差异表达基因和疾病基因进行京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集分析。结果如图所示1h.结合基因相互作用网络信息,发现FOLR1和ST6GALNAC1在PI3K-Akt信号通路中富集,ST6GALNAC1可以激活Akt通路。因此,推测ST6GALNAC1在卵巢癌中异常表达,并可能介导Akt信号通路。

图1
图1

ST6GALNAC1在卵巢癌中高表达并介导Akt信号通路。GSE14407、GSE18520、GSE38666和GSE66957中差异表达基因的比较,以及5个交叉差异表达基因;b条ITLN1、GADL1、CD24、FOLR1、ST6GALNAC1与卵巢癌的关系。图中未显示GADL1和ST6GALNAC1与卵巢癌的关系;c(c)卵巢癌差异表达基因与疾病基因的相互作用网络,红钻石代表差异表达基因,紫色圆圈代表疾病基因;d日,e(电子)GSE14407和GSE38666中前50个差异表达基因的热图。横坐标表示样本数,纵坐标表示差异表达基因,右上直方图表示色标。每个矩形对应一个示例表达式值;(f),ST6GALNAC1在GSE18520和GSE66957中的表达变化;小时卵巢癌差异表达基因和疾病基因的KEGG富集分析

ST6GALNAC1在OCSCs和卵巢癌细胞中高水平表达

为了研究ST6GALNAC1在48例不同卵巢癌患者卵巢癌组织和癌旁组织中的表达,采用RT-qPCR和western blot方法进行分析。RT-qPCR结果显示,ST6GALNAC1在癌组织中的表达高于癌旁组织(图2a) ●●●●。进一步检测ST6GALNAC1在几种卵巢癌细胞中的表达。与IOSE80相比,ST6GALNAC1在SKOV3、CAOV3,HO8910、PE04和A2780中的表达均增加,其中SKOV4的表达最高(图2b) ●●●●。

图2
图2

ST6GALNAC1在OCSC和卵巢癌细胞中高度表达。卵巢癌中ST6GALNAC1的相对表达(n = 48; 数据通过配对进行比较t吨-测试*第页 < 0.05与正常组织相比);b条ST6GALNAC1在卵巢癌细胞系和卵巢细胞系中的相对表达(*第页 < 0.05与IOSE80);c(c)ST6GALNAC1在非球体和球体中的相对表达(*第页 < 0.05与非球形);d日ST6GALNAC1在CD90中的相对表达+和CD90(*第页 < 0.05与CD90);e(电子)CD44、Nanog和Oct4的RT-qPCR(*第页 < 0.05与IOSE80);(f)CD44、Nanog和Oct4的Western blot分析;瘤球形成数(*第页 < 0.05与IOSE80);小时培养10天后瘤球形成。测量数据表示为平均值±标准偏差。两组之间的测试分析如下t吨-多组间采用单因素方差分析。实验重复了3次

然后通过RT-qPCR进一步验证ST6GALNAC1在从SKOV3细胞分离的OCSC中的表达。与非球体相比,CSCs球体中ST6GALNAC1的表达升高(图2c) ●●●●。CD90是CSCs标记物中常用的一种,因此使用免疫磁珠从SKOV3、CAOV3,HO8910、PE04和A2780细胞中对CD90阳性和阴性细胞进行分类。首次检测ST6GALNAC1的表达。与CD90−细胞相比,CD90亚群中ST6GALNAC1的表达增加+干细胞,在SKOV3细胞系中表达最高(图2d) ●●●●。RT-qPCR和western blot分析(图2e、 f)用于验证干细胞相关基因(CD44、Nanog和Oct4)的表达和悬浮瘤球形成的能力(图2g、 h)在这些电池中。CD44、Nanog和Oct4的表达以及CD90中悬浮瘤球数+与IOSE80、SKOV3和CD90相比,细胞明显更高细胞,表示CD90+干细胞具有较强的增殖、分化和自我更新能力。因此,CD90+从SKOV3细胞中分离出的干细胞被用于后续实验。所有上述结果表明,ST6GALNAC1在CD90中高度表达+干细胞和卵巢癌细胞。

Si-3具有最高的淘汰效力

使用三种ST6GALNAC1 siRNAs(si-1、si-2和si-3)敲除OCSC。使用混沌非靶向siRNA作为空白对照。根据western blot分析,si-3的敲除效率最高,达到70%。因此,选择si-3进行后续实验。此外,还构建了过表达ST6GALNAC1的质粒,以空载体pCDNA作为对照治疗OSSCs。此外,通过western blot分析检测到ST6GALNAC1的表达升高(图a、 b)。

图3
图3

Si-3表现出最佳的击倒效果。,b条siRNA敲除或过表达ST6GALNAC1效率的鉴定和统计分析。数据表示为平均值±标准差并用t检验进行分析*第页 < 0.05; **第页 < 0.01,牛顿 = 

沉默ST6GALNAC1抑制OCSC的增殖、迁移和侵袭

为了确定ST6GALNAC1在OCSC增殖、迁移和侵袭中的潜在作用,使用siRNA沉默ST6GALLAC1或在OCSC中过度表达,并通过RT-qPCR和western blot分析检测趋化因子CXCL16和EGFR的表达。如图所示4a、 b,与si-NC组相比,si-ST6GALNAC1组CXCL16和EGFR的表达明显减少。相反,与空载体组相比,ST6GALNAC1组CXCL16和EGFR的表达显著增加。EdU标记实验和Transwell分析表明,与si-NC相比,si-ST6GALNAC1组的EdU阳性细胞率、细胞迁移和侵袭数量显著降低,与空载体组相比,ST6GALNAC1组的EdU阳性细胞率和细胞迁移和侵袭数量增加(图4c、 d)。这些结果表明,ST6GALNAC1沉默可抑制OCSC的增殖、迁移和侵袭。

图4
图4

ST6GALNAC1的沉默抑制OCSCs的增殖、迁移和侵袭。RT-qPCR检测CXCL16和EGFR的表达()或western blot分析(b条);c(c)EdU法检测OCSCs增殖;d日通过Transwell分析评估OCSC的迁移和侵袭。测量数据表示为平均值±标准偏差。上述结果分析如下t吨-测试*第页 < 0.05与si-NC组相比;#第页 < 0.05 vs.空载体组;实验重复了三次

ST6GALNAC1沉默抑制OCSC的自我更新能力

为了研究ST6GALNAC1对OCSC自我更新能力的影响,检测了OCSC表面标记物和茎相关转录因子的变化。RT-qPCR和western blot分析表明,与空载体组相比,ST6GALNAC1组中表面标记CD44和转录因子Nanog和Oct4的表达增强,而与si-NC组相比,si-ST6GALNA C1组中这些基因的表达降低(图5a、 b)还分析了ST6GALNAC1对OCSCs的瘤球形成和集落形成能力的影响。研究发现,ST6GALNAC1组中形成的球体数量显著增加,而si-ST6GALNA C1组中的球体数量明显减少,这表明ST6GAL NAC1的过度表达促进了OCSC的自我更新(图5c) ●●●●。此外,软琼脂中的菌落形成表明,ST6GALNAC1组中形成的菌落数量增加,而si-ST6GALNA C1组中产生的菌落数显著减少。这些结果表明,ST6GALNAC1的沉默抑制了OCSC的扩张(图5d) ●●●●。

图5
图5

ST6GALNAC1的沉默抑制了OCSC的自我更新能力。RT-qPCR检测CD44、Nanog和Oct4;b条免疫印迹法检测CD44、Nanog和Oct4;c(c)瘤球形成实验检测成球能力;d日采用软琼脂集落形成试验检测其集落形成能力。测量数据以平均值表示±标准偏差。上述结果分析如下t吨-测试*第页 < 0.05与si-NC组相比;#第页 < 0.05 vs.空载体组;实验重复了三次

ST6GALNAC1沉默抑制OCSC体内致瘤性

为了进一步分析ST6GALNAC1在体内对OCSC的调节作用,对小鼠OCSC的肿瘤发生进行了评估。体内极限稀释试验表明,与空载体组相比,ST6GALNAC1组形成的肿瘤数量显著增加,肿瘤干细胞的比例也更高(表,图6a) ●●●●。此外,利用小鼠皮下肿瘤模型进一步研究了ST6GALNAC1对肿瘤生长的影响。与空载体组相比,ST6GALNAC1组的肿瘤形成更早,肿瘤生长更快,肿瘤体积更大,而si-ST6GALNA C1组与si-NC组相反(图6b–d)。此外,免疫组织化学染色结果显示,与si-NC组相比,si-ST6GALNAC1组的β-连环蛋白染色强度降低。然而,与空载体相比,过度表达ST6GALNAC1后β-catenin染色强度升高(图6e) ●●●●。这些发现表明ST6GALNAC1沉默抑制OCSC的致瘤性。

表3 CD90+球形细胞的致瘤性
图6
图6

ST6GAL NAC1沉默可抑制体内OCSC的Akt致瘤性。采用体内限制性稀释法检测小鼠体内ST6GALNAC1干细胞比例;b条检测OCSC在裸鼠体内形成的肿瘤。c(c)肿瘤体积的量化b条;d日肿瘤重量的量化b条;e(电子)免疫组化染色检测OCSCβ-catenin染色强度(×200)。测量数据表示为平均值±标准偏差。通过以下方法分析ST6GALNAC1在小鼠体内的干细胞比率和肿瘤体积的量化t吨-测试。肿瘤重量的量化通过双向方差分析(n = 6). *第页 < 0.05与si-NC组相比;#第页 < 0.05 vs.空载体组;实验重复了3次

Akt信号通路被ST6GALNAC1激活

为了研究Akt信号通路的活性,通过western blot分析检测β-catenin、磷酸化PI3K、Akt和S6的水平。当ST6GALNAC1在OCSC中过度表达时,β-catenin水平和PI3K、Akt和S6的磷酸化水平也增加,表明Akt信号通路被激活。使用Akt通路抑制剂LY294002进一步验证Akt信号通路在OCSC中的作用。LY2942002治疗可以阻断ST6GALNAC1过度表达诱导的β-catenin水平的增加以及PI3K、Akt和S6的磷酸化水平,表明抑制Akt信号通路可以抑制ST6GALNAC1的作用(图7). 这些结果表明,Akt信号通路被ST6GALNAC1沉默所灭活。

图7
图7

ST6GALNAC1沉默抑制OCSCs干细胞。western blot分析Akt、p-Akt,PI3K、p-PI3K,S6,p-S6和β-catenin蛋白的蛋白带;b条western blot分析Akt、p-Akt,PI3K,S6,p-S6和β-catenin的蛋白表达;测量数据表示为平均值±标准偏差,分析依据t吨-测试*第页 < 0.05; 实验重复了三次

ST6GALNAC1通过上调Akt信号通路促进OCSCs干细胞

由于ST6GALNAC1可以激活Akt信号通路,下一步是进一步研究Akt通路是否参与ST6GALNAC1对OCSCs无茎的调控。与NC组相比,CD44、Nanog、Oct4、CXCL16和EGFR的mRNA和蛋白水平(图8a、 b),EdU阳性细胞率、细胞迁移、侵袭、瘤球形成和集落形成能力均显著提高(图8c、 f)ST6GALNAC1中 + 二甲基亚砜组,均在LY294002治疗后预防。因此,抑制Akt信号通路可以逆转ST6GALNAC1在促进OCSCs增殖、迁移和侵袭以及获得无茎OCSCs方面的作用。

图8
图8

Akt信号通路失活抑制ST6GALNAC1对OCSC的增殖、迁移、侵袭和特征获取。RT-qPCR检测CD44、Nanog、Oct4、CXCL16和EGFR;b条免疫印迹法检测CD44、Nanog、Oct4、CXCL16和EGFR;c(c)EdU法检测干细胞增殖;d日Transwell法检测干细胞迁移和侵袭;e(电子)肿瘤球形成实验检测转染后不同细胞形成球体的能力;(f)使用软琼脂中的集落形成来检测转染后不同细胞形成集落的能力。测量数据通过单向方差分析进行分析,并表示为平均值±标准偏差*第页 < 0.05,与空载体组相比;实验重复了三次

Akt信号通路失活抑制OCSC体内致瘤性

为了确定Akt信号通路在OCSC致瘤性中的作用,进行了体内限制稀释实验。与空载体组相比,ST6GALNAC1中形成的肿瘤数量和肿瘤干细胞比例 + 二甲基亚砜组较高,但在ST6GALNAC1中均降低 + LY294002组(表4,图9a) ●●●●。小鼠皮下肿瘤模型也显示,与空载体组相比,ST6GALNAC1 + 二甲基亚砜组肿瘤形成较早,肿瘤生长较快,肿瘤体积较大,这在ST6GALNAC1中未见 + LY294002组(图9b、 d)。免疫组织化学染色显示,与空载体相比,ST6GALNAC1 + DMSO组β-catenin染色强度增加。然而,随着LY294002的加入,β-catenin染色强度降低(图9e) ●●●●。因此,ST6GALNAC1诱导的OCSCs的肿瘤生长可以通过Akt信号通路的失活来抑制。

表4 CD90+球形细胞的致瘤性
图9
图9

失活的Akt信号通路抑制OCSC的体内致瘤性和肿瘤生长。体内极限稀释法检测小鼠体内ST6GALNAC1干细胞百分比;b条转染后,测定裸鼠体内不同细胞的肿瘤大小;c(c)裸鼠致瘤瘤重;d日裸鼠肿瘤体积的变化;e(电子)免疫组化染色检测OCSCβ-catenin染色强度(×200)。测量数据表示为平均值±标准偏差。通过单向方差分析分析小鼠体内ST6GALNAC1干细胞比率和肿瘤体积的量化。通过重复测量方差分析(n = 6). *第页 < 0.05 vs.空载体组;实验重复了三次

讨论

ST6GALNAC1具有编码唾液酸转移酶的能力,该酶可催化肿瘤相关sTn的产生,sTn在多种癌症中表达,与癌症患者的转移和预后不良有关[11]. 例如,胃癌细胞系中ST6GALNAC1的过度表达增强了转移能力和肿瘤生长[19]. ST6GALNAC1过度表达的乳腺癌细胞株也表现出更强的致瘤性[20]. 从力学角度来看,ST6GALNAC1已被证明是OCSC和肿瘤细胞中miR-370的潜在参与者。CSC假设表明肿瘤是由具有干细胞特征的细胞亚群维持的[21]表达多潜能基因和干细胞标记,如Nanog和Oct4。此外,Oct4和Nanog在从卵巢癌细胞系中获得的旁系细胞中高度表达,这揭示了干细胞标记物在卵巢癌中的表达[22]. 干细胞标记物的主要功能是控制胚胎干细胞的自我更新和分化,并保持其生物学特性[23]. CD44是一种透明质酸受体,被发现参与多种细胞过程,如肿瘤转移、细胞迁移、增殖[24]. 其升高已被证明与许多癌症类型的不良预后相关[25]. 此外,CD44可以作为预测卵巢癌患者诊断和预后的一个有希望的生物标志物[26]. 在本研究中,ST6GALNAC1在卵巢癌细胞系和OCSC中过度表达[27]. 还发现,ST6GALNAC1沉默后,OCSC中CD44、Nanog、Oct4、CXCL16和EGFR的表达降低,表明CD90+感染抗ST6GALNAC1的miRNA的干细胞在卵巢癌中的自我更新能力较弱(图10).

图10
图10

ST6GALNAC1激活Akt信号通路使肿瘤细胞获得干细胞干细胞。ST6GALNAC1促进PI3K、Akt和S6的磷酸化,增加β-catenin转录,激活Akt信号通路,最终使肿瘤细胞获得干细胞干细胞

在乳腺癌和结肠癌中,ST6GALNAC1的过表达已被证明可增加肿瘤的生长、迁移和转移能力[20]. 此外,ST6GALNAC1的抑制导致球状形成能力降低,表明ST6GALLAC1对癌细胞的维持作用[4]. 在本研究中,我们观察到ST6GALNAC1的过度表达促进了OCSC的增殖、侵袭和迁移能力,同时增加了OCSC中CXCL16和EGFR的表达。ST6GALNAC1的沉默表现出相反的作用,表明ST6GALLAC1的沉默可以抑制OCSCs的增殖、侵袭和迁移。CXCL16被认为是一种独特的趋化因子,以跨膜或可溶性形式存在,CXCL16/CXCR6趋化因子轴最近在癌症中扮演着调节细胞增殖、侵袭和转移的角色[28]. 更重要的是,CXCL16和CXCR6的表达被认为在上皮性卵巢癌中过表达,这与肿瘤生长、增殖、侵袭和淋巴结转移密切相关[29]. EGFR过表达也被证明在癌症进展中起着重要作用,特别是在肿瘤侵袭性和侵袭性方面[30]. EGFR过度表达在30%~98%的上皮性卵巢癌中常见;除此之外,细胞内EGFR二聚体可激活包括PI3K/Akt信号通路在内的信号通路,该信号通路在上皮性卵巢癌的肿瘤迁移和侵袭、细胞功能以及对细胞凋亡的抵抗中起调节作用[31].

先前的研究还发现,Akt信号通路被ST6GALNAC1通过半乳糖凝集素-3激活[4]. 研究还证明,在OCSC中,ST6GALNAC1实际上通过激活Akt信号通路促进了生物特性、细胞增殖、迁移和侵袭能力。Akt信号通路是与细胞增殖相关的最重要途径之一[32]. 大量研究表明,Akt信号通路在促进肝癌等癌症的发生、发展、侵袭和转移中发挥了重要作用[33]. Akt信号通路已被证实是卵巢癌的致癌途径[34]. 此外,Akt信号通路可能介导miR-93诱导的A2780细胞对顺铂的化疗耐药性,为研究耐药性提供了新途径,并可能有助于发现治疗卵巢癌的新疗法[35]. 一项研究表明,ST6GALNAC1在结肠癌肿瘤干细胞中高表达,ST6GALNAC1的高表达可以促进肿瘤干细胞标记蛋白CD44相关抗原Stn的表达,这不仅可以促进肿瘤细胞的瘤球形成能力,而且还能提高肿瘤细胞对化疗药物的耐药性[4]. 基于分析,发现Akt信号通路在ST6GALNAC1高表达的肿瘤细胞中是活跃的,Akt通路的激活可以通过敲低半乳糖凝集素-3蛋白来阻断。可以得出结论,ST6GALNAC1与半乳糖凝集素-3蛋白协同激活Akt信号通路。同时,一项研究表明,沉默半乳糖凝集素-3可以通过下调Akt磷酸化水平和GSK-3β蛋白来抑制胰腺癌细胞的迁移和侵袭[36]. 另一项研究表明,使用半乳糖凝集素-3抑制剂可以阻断半乳糖凝素-3与EGFR的结合,从而抑制半乳糖聚素-3/EGFR/Akt/FOXO3轴,抑制体内外胰腺癌的发生和发展[37]. 因此,可以得出结论,ST6GALNAC1通过与半乳糖凝集素-3的协同作用促进EGFR/Akt/FOXO3信号通路的激活。具体机制需要进一步核实。未来,可以推断Akt信号通路可能在OCSC的生物学特性中发挥重要作用。

结论

总之,本研究表明,ST6GALNAC1激活卵巢癌中OCSC的生物学特性,这是通过激活Akt信号通路增加OCSC的增殖、侵袭和迁移来实现的(图9). 这些发现可能为未来卵巢癌的治疗开辟新的途径。然而,尚需进一步研究以更好地了解ST6GALNAC1调节卵巢癌Akt信号通路的潜在机制。

缩写

OCSC:

卵巢癌干细胞

CIC:

癌症起始细胞

地理位置:

基因表达综合

CD90+:

分化簇90+

RT-qPCR:

逆转录定量聚合酶链反应

GAPDH公司:

3-磷酸甘油醛脱氢酶

SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳):

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚偏氟乙烯:

聚偏氟乙烯

DMEM公司:

Dulbecco改良Eagle培养基

表皮生长因子:

表皮生长因子

FOLR1:

叶酸受体

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作者的贡献

W-YW和Y-XC设计了这项研究。XZ和BW整理了数据,设计和开发了数据库,进行了数据分析,并制作了手稿的初稿。LZ和S-YS参与了手稿的起草。所有作者都参与了修改后的手稿。所有作者阅读并批准了最终手稿。

致谢

我们还要感谢参与本研究的所有参与者。

竞争性利益

作者声明,他们没有相互竞争的利益。

数据和材料的可用性

当前研究期间生成的数据集可用。

出版同意书

不适用。

道德批准和参与同意

所有实验均经安徽医科大学第二医院伦理委员会批准。每位参与者都获得了书面知情同意书。术中严格按照标本采集标准采集48例卵巢癌患者的组织标本。所有的努力都是为了减少痛苦。

基金

本研究得到了国家自然科学基金(81100412号)、中国博士后科学基金第59项面上项目(2016M592038号)和2016年高校优秀青年人才支持计划重点项目(gxyqZD2016059号)的资助。

出版商备注

Springer Nature在公布的地图和机构关联中的管辖权主张方面保持中立。

作者信息

作者和附属机构

作者

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与的通信曹云霞.

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Wang、WY.、Cao、YX.、。,X·周。等。ST6GALNAC1通过Akt信号通路在卵巢癌干细胞增殖、迁移和侵袭中的刺激作用。癌细胞国际 19,86(2019)。https://doi.org/10.1186/s12935-019-0780-7

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