线粒体酸5激活MAPK–ERK–yap信号通路，通过增加Bnip3相关的有丝分裂来保护小鼠小胶质细胞BV-2细胞免受TNFα诱导的凋亡

摘要

背景

通过线粒体稳态调节小胶质细胞功能在神经炎症的发展中很重要。这种监管功能的基本机制尚不清楚。在本研究中，我们研究了线粒体酸5（MA-5）在TNFα诱导炎症损伤后小胶质细胞线粒体凋亡中的保护作用。

方法

用TNFα诱导小鼠小胶质细胞BV-2细胞在MA-5治疗前后的炎症损伤。使用MTT和TUNEL分析评估细胞凋亡。通过线粒体膜电位JC-1染色、ROS流式细胞术分析、mPTP开放性评估和cyt-c免疫荧光检测线粒体功能。使用蛋白质印迹和免疫荧光以及通路阻断剂进行通路分析。

结果

我们的结果表明，TNFα通过激活caspase-9依赖的线粒体凋亡途径诱导小胶质细胞BV-2细胞系的凋亡。从机制上讲，炎症降低了线粒体电位，诱导了活性氧的产生，并促使线粒体促凋亡因子渗入细胞质。炎症反应降低了细胞能量代谢，增加了氧化应激。相比之下，MA-5通过上调线粒体吞噬功能减少线粒体凋亡。增加的线粒体吞噬降解受损的线粒体，扰乱线粒体凋亡，中和活性氧过度生成，并改善细胞能量生产。我们还发现MA-5通过MAPK–ERK–Yap信号通路通过Bnip3调节有丝分裂。抑制该信号通路或敲低Bnip3表达可阻止MA-5对线粒体内环境稳定和增加小胶质细胞凋亡产生有利影响。

结论

TNFα诱导炎症损伤后，MA-5通过增强保护性Bnip3相关的有丝分裂作用（通过MAPK–ERK–Yap信号通路介导），影响小胶质细胞线粒体稳态。

背景

神经炎症与神经疾病、神经细胞损伤、突触传导功能障碍以及随后的神经退化密切相关，最终导致阿尔茨海默病和帕金森综合征的发展[1]. 临床研究也表明，出现神经炎症的患者患心血管疾病的风险更大，包括外周动脉疾病和冠状动脉疾病[2]. 外周动脉疾病导致大脑微血管动脉粥样硬化，这实际上通过代谢紊乱和大脑供血不足导致神经炎症和神经细胞损伤。减缓或预防神经退行性疾病进展的尝试依赖于减少过度炎症反应和提高神经细胞对炎症诱导损伤的抵抗力[三,4].

小胶质细胞是位于中枢神经系统的主要免疫细胞。一些研究表明，小胶质细胞凋亡是神经炎症发展的关键因素[5]. 氧化应激、钙超载和炎性细胞因子对小胶质细胞有负面的机制影响，从而导致细胞凋亡[6]. 受损的小胶质细胞释放一系列促炎因子，增加炎症反应。因此，保护小胶质细胞免受炎症诱导的凋亡应在源头上减轻神经炎症[7].

小胶质细胞特别富含线粒体，许多研究报道线粒体凋亡是小胶质细胞的主要死亡途径[8]. 经典的线粒体凋亡途径涉及炎症反应，导致线粒体通透性转换孔（mPTP）过度开放，从而激活caspase-9，进而裂解caspase-3启动细胞凋亡[9,10].

线粒体损伤是一种细胞反应[11,12]. 这是一种对线粒体有选择性的自噬。应及时有效地清除受损或未修复的线粒体，以维持线粒体功能并抑制线粒体凋亡[13,14].

通过BCL2/腺病毒E1B 19-kDa蛋白相互作用蛋白3（Bnip3）激活噬菌体[15,16]. 上调的Bnip3与LC3II相互作用，有助于线粒体与溶酶体融合，确保有丝分裂。有趣的是，Bnip3相关的线粒体自噬实际上在脂肪肝和糖尿病等慢性代谢性疾病中受到抑制[15]. 这种缺陷的Bnip3相关线粒体吞噬加剧了线粒体的损伤，而重新引入Bnip3-相关线粒体吞噬可改善线粒体的结构和功能[17].

这些发现表明Bnip3相关的有丝分裂在线粒体保护中不可或缺的作用[18]. 目前尚不清楚Bnip3相关的有丝分裂是否参与维持小胶质细胞的线粒体功能，从而在炎症反应期间起到保护作用。

线粒体酸5（MA-5），从植物生长激素吲哚-3-乙酸中提取[19]，可以通过调节能量代谢和减少线粒体氧化应激来保护线粒体功能[20,21]. MA-5是否通过Bnip3相关的有丝分裂调节小胶质细胞的线粒体功能尚不清楚。我们的研究旨在探索Bnip3相关的线粒体自噬在小胶质细胞线粒体保护中的保护作用，并研究MA-5是否调节线粒体自噬以保护小胶质细胞免受炎症损伤。

方法

细胞实验和再生剂处理

本研究中使用的小鼠BV-2细胞来自中国科学院细胞库。细胞在37°C、5%CO的气氛中，在补充有10%胎牛血清（FBS）的L-DMEM中培养₂.

为了诱导炎症损伤，用10ng/ml TNFα（Selleck Chemicals）处理细胞约12小时。MA-5（0-10μM，Selleck Chemicals）与BV-2细胞在TNFα处理下孵育约12小时。为了抑制ERK活性，使用SCH772984（Selleck Chemicals）约45分钟。

免疫荧光

所有组的样品在室温下用冰镇PBS清洗三次。然后，用0.1%Triton X-100在4°C下使样品渗透30分钟。随后，在室温下用冷PBS清洗样品三次[22]. 将初级抗体与样品一起孵育，以在4°C下标记靶蛋白过夜。随后，将样品用冷PBS洗涤三次。然后，将二级抗体与样品在室温下孵育45分钟。以下主要抗体购自Abcam：Tomm20（#ab78547）、LAMP1（#ab24170）和HtrA2/Omi（#ab32092）。

线粒体部分分离

样品在室温下用冷PBS清洗三次。细胞在4°C下用裂解缓冲液裂解30分钟。随后，将样品在4°C下以20000 x g离心10分钟，以获得上清液。分离小球并再次旋转。最后，使用PBS将颗粒悬浮在1%Triton X-100中。这被用作线粒体部分[15].

免疫印迹法

使用冷PBS在室温下清洗样品，然后在带有PMSF的RIPA缓冲液中进行裂解，以抑制蛋白质降解。然后将样品在4°C下离心10分钟，以获得蛋白质。使用BCA蛋白质定量试剂盒对上清液进行分离和测量，以评估蛋白质浓度。转移到PVDF膜后，将初级抗体与样品在4°C下孵育过夜[23].

用TBST洗涤后，在室温下用二级抗体标记目标蛋白45分钟。然后将膜暴露于增强化学发光西方印迹检测试剂（Amersham Pharmacia Biotech）[24].

用于免疫印迹的主要抗体有：前caspase-3（1:1000，细胞信号技术，#9662）、裂解caspase-2（1:1000；细胞信号技术；#9664）、HtrA2/Omi（1:1000、Abcam，#ab32092）、Bax（1:2000，细胞信号技术，#5023）、Bcl2，LC3II（1:1000，细胞信号技术，#3868），p62（1:1000；Abcam，#ab56416），Beclin1，复合物III亚基核心（CIII-core2，1:1000，Invitrogen，#459220）、复合物II（CII-30，1:1000，Abcam，#ab110410）和复合物IV亚基II（CIV-II，1:1000，Abcam，#ab110268）。

细胞活性氧的流式细胞术分析

流式细胞仪分析观察细胞活性氧。简单地说，用PBS清洗样品，然后将ROS探针（DHE，Molecular Probes）与细胞在37°C的黑暗中孵育30分钟。随后，使用PBS清洗细胞以去除ROS探针，然后用0.25%胰酶消化[25]. 在PBS中再次悬浮后，立即使用流式细胞仪（Partec）对细胞进行分析。对每组每10000个细胞进行细胞活性氧的量化，并使用Flowmax软件（Partec）对数据进行分析[26].

线粒体钙分析和线粒体电位检测

为了分析线粒体钙，样品在室温下用PBS洗涤三次。然后，在37°C的黑暗中用线粒体钙探针（Rhod-2，分子探针）负载细胞30分钟。随后，用PBS清洗样品三次。然后，在奥林巴斯DX51荧光显微镜下观察细胞。

通过JC1染色分析线粒体电位。在健康的线粒体中，JC1显示红色荧光，而在受损的线粒体中JC1显示绿色荧光。简单地说，样品在37°C的黑暗中用JC1染色剂染色30分钟[27]. 随后，用PBS清洗样品三次。然后，用DAPI对样品进行染色以标记细胞核。使用奥林巴斯DX51荧光显微镜捕获图像，并使用Image-Pro Plus 6.0（媒体控制论）进行分析，以获得感兴趣区域的平均密度。这些值被归一化为对照组的值。红绿色荧光比值量化线粒体膜去极化。

mPTP开放试验和ATP生成

mPTP开放是线粒体凋亡的早期事件。在我们的研究中，基于四甲基罗丹明乙酯荧光测量了mPTP的开放度。样品用PBS洗涤三次，然后用四甲基罗丹明乙酯装载。记录四甲基罗丹明乙酯的基线荧光。30分钟后，再次记录四甲基罗丹明乙酯荧光。根据之前的研究，根据两个测量值绘制的图表测量开度[28].

测定ATP生成量以量化线粒体功能。样品首先用冷PBS清洗三次。然后，对样品进行裂解，并使用Beyotime荧光素酶ATP检测试剂盒（分类号S0026）。使用酶标仪测定ATP的产生。

MTT分析和TUNEL检测

MTT法用于分析细胞活性。细胞在96个培养板中培养。然后，在37°C的黑暗中向每个孔中加入50μl MTT溶液4小时。随后，用PBS洗涤细胞三次，并用200μl DMSO消化MTT。10分钟后，再次用PBS清洗细胞，并使用波长为570 nm的微孔板阅读器对样品进行分析[29].

为了进行TUNEL分析，首先将样品固定在福尔马林中，并在4°C下用0.1%Triton X-100渗透约30分钟。然后，根据制造商的协议，使用原位细胞死亡检测试剂盒（Roche）检测TUNEL阳性细胞[30].

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3和-9活性检测

为了分析caspase-3和caspase-9的变化，根据制造商的协议使用了caspase-3与-9活性试剂盒（分类号C1115、C1157；Beyotime）。为了分析caspase-3活性，将5μl DEVD-p-NA底物（4 mM，200μM最终浓度）添加到样品中，在37°C下保持2 h。为了测量caspase-9活性，将5μl LEHD-p-NA底物（4 mM，200μM最终浓度）添加到样品中，在37°C下保持1 h。然后，使用微孔板阅读器记录400 nM的波长。这反映了caspase-3和caspase-9的活性[31].

细胞内GSH、SOD和GPx水平的测量

分别使用GSH、GPx和SOD ELISA检测试剂盒（分类号S0053、S0109、S0112；Beyotime）测量GSH、GPx和SOD水平。样品用PBS洗涤，然后在RIPA缓冲液中溶解。在10000 x g离心约10分钟后，收集上清液。使用商用试剂盒测量上清液，结果以nmol/g组织表示[32].

RNAi分析

在我们的研究中，siRNA被用于抑制Yap的表达。siRNA引物为：正义链siRNA，5'-GCGACATTCAGGGGUGACUUU-3′；和反义链siRNA，3'-TCGCUUCCTCCCACUGAUAAU-5′。siRNA是从扬州瑞博生物科技有限公司设计和购买的。细胞在最适基本培养基中培养约24小时。然后，根据制造商的协议，使用Lipofectamine 2000转染试剂将siRNA转染到细胞中。48小时后，消化并收集细胞，通过western blot分析Yap的表达[33].

统计分析

数据表示为来自至少三个独立实验的平均值±SEM。通过ANOVA检验分析统计显著性。第页 < 0.05被认为具有统计学意义。

结果

MA-5以剂量依赖性方式减少TNFα诱导的小鼠小胶质细胞BV-2凋亡

为了观察MA-5在炎症条件下对小胶质细胞的保护作用，使用先前研究中描述的方法应用TNFα[34]. 随后，采用MTT法评估细胞活力。作为对TNFα治疗的反应，细胞活力显著降低。然而，MA-5治疗可剂量依赖性地抑制这种效应（图。1a个).

图1

MA-5以剂量依赖性方式减少TNFα诱导的小鼠小胶质细胞BV-2细胞凋亡。一MTT法用于评估细胞活力。b条caspase-3活性表明TNFα促进了BV-2细胞的死亡。c（c）和d日TUNEL法用于检测细胞凋亡*第页 < 0.05与对照组（Ctrl）比较#第页 < 0.05 vs.TNFα组

我们还观察到caspase-3活性和TUNEL分析中反映的细胞凋亡。在TNFα处理的细胞中，Caspase-3活性增加，而MA-5处理的细胞以浓度依赖的方式减少（图。1亿). TUNEL分析用于量化细胞死亡。如图所示。1c、dTNFα显著增加了TUNEL阳性细胞的数量，但这种作用被MA-5治疗所抑制。

总的来说，这些数据表明MA-5治疗以剂量依赖的方式减少TNFα诱导的小胶质细胞BV-2凋亡。MA-5的最低保护浓度为5μM。该剂量用于以下研究，时间设定为12小时。

TNFα通过caspase-9介导的线粒体凋亡诱导BV-2细胞死亡

我们的下一步是研究MA-5在TNFα治疗后减少BV-2凋亡的机制。最初，我们研究了线粒体功能的改变，基于先前的研究表明线粒体是炎症反应的靶点[35]. 线粒体损伤被定义为线粒体膜电位降低、线粒体钙超载和mPTP开放[36].

使用JC1染色，我们发现TNFα处理降低了红色荧光，增加了绿色荧光，这表明线粒体电位降低（图。2a、b). 相比之下，MA-5处理增加了线粒体电位，红绿色荧光强度的比例更高证明了这一点。使用免疫荧光分析，我们发现TNFα处理增加了线粒体钙的荧光强度，并且MA-5处理抑制了这种作用（图。2c、d).

图2

MA-5保留了线粒体功能。一和b条通过JC1染色测量对照细胞（Ctrl）和用10 ng/ml TNFα（TNFα）或10 ng/ml TNFα和5μM MA-5（TNF al+MA-5）处理的细胞的线粒体电位。c（c）和d日在对照细胞（Ctrl）和用10 ng/ml TNFα（TNFα）或10 ng/ml TNFα和5μM MA-5（TNF-α+MA-5）处理的细胞中，线粒体钙水平被评估为荧光强度。e（电子）在对照细胞（Ctrl）和用10ng/ml TNFα（TNFα）或10ng/ml TNFα和5μM MA-5（TNFα+MA-5）处理的细胞中测定mPTP开放率。（f）和克用10 ng/ml TNFα（TNFα）或10 ng/ml TNFα和5μM MA-5（TNF al+MA-5）处理的细胞进行HtrA2/Omi的免疫荧光分析。小时通过n个用Western blots分析MA-5和TNFα处理对用10 ng/ml TNFα（TNFα）或10 ng/ml TNFα和5μM MA-5（TNF al+MA-5）处理的细胞凋亡蛋白的影响*第页 < 0.05与对照组（Ctrl）比较#第页 < 0.05相对于TNFα组

与对照组相比，接受TNFα治疗的组mPTP开放率增加（图。第二版). 相反，MA-5处理抑制了mPTP的开放。mPTP开放导致线粒体前凋亡蛋白如HtrA2/Omi的泄漏。利用HtrA2/Omi亚细胞定位的免疫荧光分析，我们发现TNFα处理促进HtrA2/Omi从线粒体释放到细胞质或细胞核（图。2f，克). 这种构象变化被MA-5治疗逆转。HtrA2/Omi蛋白印迹结果也支持这些发现（图。2小时，我).

通过western blot分析，我们还证明TNFα处理上调了caspase-3、caspase-9和Bax的表达（图。2小时和n个). 相反，Bcl2和x-IAP的表达水平在TNFα治疗后下调（图。2小时和n个). 然而，MA-5治疗逆转了抗凋亡蛋白的表达，并抑制了促凋亡因子的表达。

这些数据表明，TNFα治疗通过激活线粒体依赖性凋亡途径介导BV-2细胞死亡，MA-5治疗抑制线粒体凋亡，并在炎症损伤后为BV-2电池提供生存优势。

MA-5激活Bnip3相关的有丝分裂抑制线粒体凋亡

为了进一步解释MA-5对线粒体损伤的保护作用，我们探索了Bnip3相关的线粒体吞噬，这是损伤线粒体的修复系统[37]. 首先，我们发现Bnip3表达在TNFα治疗后降低，但在MA-5治疗后增加到正常水平（图。3a、b). 这些结果表明，Bnip3相关的有丝分裂受炎症和MA-5的影响。

图3

MA-5通过Bnip3增强了有丝分裂。一通过（f）蛋白质经western blotting分离和分析。在用siRNA（TNFα+MA-5）沉默Bnip3后，在对照细胞（Ctrl）和用10 ng/ml TNFα（TNF-α）、10 ng/ml TNFα和5μM MA-5（TNF + si-Bnip3）。克和小时用10 ng/ml TNFα（TNFα）或10 ng/ml TNFα和5μM MA-5（TNF al+MA-5）处理细胞，通过线粒体和溶酶体联合染色进行有丝分裂的免疫荧光分析。我MA-5处理（TNFα+MA-5）或Bnip3敲除（TNFβ+MA-5 + si-Bnip3）*第页 < 0.05与对照组#第页 < 0.05 vs.TNFα组；†第页 < 0.05 vs.TNFα+MA-5组

Western blots用于分析线粒体吞噬参数。在TNFα治疗组中，与对照组相比，mito-LC3II、Beclin1、Atg5和p62水平降低（图。3a年–（f）)，表明有丝分裂受到抑制。有趣的是，在MA-5治疗后，所有有丝分裂参数都显著增加，表明有丝分裂激活（图。3a年–（f）). 这些数据证实了我们的假设，即线粒体自噬受到TNFα诱导的炎症反应的抑制，而MA-5可以逆转线粒体自噬。

为了证明Bnip3是否对有丝分裂的激活起作用，使用了抗Bnip2的siRNA，并用western blot证实了敲除效率（图。3a、b). Bnip3的敲除减轻了MA-5对有丝分裂的促进作用（图。3a年–（f）)，表明Bnip3对于响应MA-5处理的线粒体自噬激活是必需的。

为了提供更直接的丝裂原吞噬证据，我们使用联合免疫荧光分析对线粒体和溶酶体进行联合染色。如图所示。3g小时与对照组相比，TNFα治疗导致线粒体和溶酶体分离，表明有丝分裂阻滞。相比之下，MA-5处理增强了线粒体和溶酶体的融合（图。3g小时)提示有丝分裂激活。这些数据进一步支持了这样一个事实，即MA-5处理可以重新激活BV-2细胞中TNFα抑制的有丝分裂。

最后，我们研究了活跃的线粒体吞噬在线粒体损伤中的作用。Caspase-9在线粒体损伤过程中被激活，其活性是线粒体凋亡的标志。有趣的是，胱天蛋白酶-9活性在TNFα治疗后增加，但在MA-5治疗后降至正常水平（图。第3页). 为了了解有丝分裂的作用，使用Bnip3 siRNA抑制有丝分裂。在MA-5处理的细胞中，Bnip3的缺失上调了caspase-9活性，这表明MA-5的线粒体保护作用依赖于Bnip3-相关的线粒体吞噬（图。第3页). 这些结果表明，在TNFα诱导的炎症反应下，MA-5触发的有丝分裂有助于BV-2细胞的线粒体稳态。

MA-5介导的有丝分裂减少细胞氧化应激并维持能量代谢

线粒体除了参与细胞凋亡外，还控制细胞能量代谢和氧化应激，这对细胞功能至关重要[10]. 通过流式细胞术，我们发现在TNFα治疗后，细胞ROS生成显著增加（图。4a、b). 然而，MA-5治疗后氧化应激降低，ROS生成减少证明了这一点。有趣的是，在MA-5处理的Bnip3敲除细胞中，活性氧的产生再次增加（图。4a类–d日).

图4

MA-5保护细胞免受线粒体氧化应激，并允许产生能量。一和b条用siRNA（TNFα+MA-5）沉默Bnip3后，通过流式细胞术测定对照细胞（Ctrl）和用10 ng/ml TNFα（TNF a）、10 ng/ml TNFα和5μM MA-5（TNF a+MA-5 + si-Bnip3）。c（c）通过e（电子）通过ELISA法测定对照细胞（Ctrl）和用10 ng/ml TNFα（TNFα）、10 ng/ml TNFα和5μM MA-5（TNF al+MA-5）处理的细胞中的谷胱甘肽水平以及SOD和GPx活性，或用siRNA（TNF Al+MA-5 + si-Bnip3）。（f）MA-5处理后ATP生成增加，Bnip3沉默后ATP生成减少。克通过j用siRNA沉默Bnip3（TNFα+MA-5 + si-Bnip3）*第页 < 0.05与对照组（Ctrl）比较#第页 < 0.05 vs.TNFα组；†第页 < 0.05 vs.TNFα+MA-5组

为了获得更多有关细胞氧化应激的信息，还对抗氧化系统进行了评估[38]. TNFα处理降低了GSH、SOD和GPx的含量（图。4c类–e（电子）)而MA-5逆转了这些抗氧化因子的表达。Bnip3被沉默后，这种效应消失了。这些数据表明MA-5通过Bnip3相关的线粒体自噬来中和过度的细胞氧化应激。

我们发现，ATP生成在TNFα处理后减少，在MA-5培养后增加到正常水平（图。4英尺). 随后，我们测量了线粒体呼吸复合体的活性，这是生成ATP所必需的。TNFα治疗组线粒体呼吸复合物的表达水平低于对照组（图。4克–j). 然而，MA-5刺激以Bnip3依赖的方式挽救了下调的线粒体呼吸复合物。

总之，这些发现进一步阐明了MA-5治疗不仅在线粒体凋亡中起作用，而且有益于细胞氧化应激和能量代谢。

MA-5通过MAPK-ERK-yap途径触发Bnip3相关的有丝分裂

MA-5影响Bnip3相关有丝分裂的调节机制尚不清楚。先前的一项研究报告称，Bnip3受Yap信号通路调节[39]. Yap增加JNK的表达，JNK转位到细胞核结合Bnip3启动子，从而增加Bnip2转录。因此，我们想知道MA-5是否通过Yap途径调节Bnip3相关的有丝分裂。

首先，我们证明了TNFα处理抑制了Yap的表达，并使MA-5处理的细胞恢复到正常水平（图。5a级和b条). 随后，在MA-5处理的细胞中使用抗Yap的siRNA（si-Yap）进行功能丧失检测。在MA-5处理的细胞中Yap缺失后，Bnip3表达逐渐减少（图。5a级–c（c）)，通过western blot分析确定。随后，线粒体和溶酶体的联合染色也表明Yap的丢失抑制了有丝分裂（图。5天). 这些数据证实Yap参与了Bnip3相关有丝分裂的上游信号传导。

图5

MA-5通过MAPK–ERK–Yap通路调节Bnip3相关的有丝分裂。一通过c（c）Western blotting用于分析Yap和Bnip3的变化。siRNA用于沉默Yap表达（si-Yap），这也降低了Bnip3的表达。d日线粒体和溶酶体联合染色的丝裂原吞噬免疫荧光分析。Yap-siRNA也减少了细胞的吞噬。e（电子）通过克SCH772984用于抑制ERK活性。ERK抑制剂也降低了Yap的表达*第页 < 0.05与对照组（Ctrl）比较#第页 < 0.05 vs.TNFα组；†第页 < 0.05 vs.TNFα+MA-5组

以前的报告也表明Yap精确地受ERK途径控制[40]. 我们对p-ERK和Yap进行了蛋白质印迹分析，以确定它们之间的关系。TNFα治疗后，p-ERK和Yap的表达均同步下降（图。第五版–克). 相比之下，与MA-5孵育同时逆转了这些蛋白质的表达。

随后，使用p-ERK抑制剂SCH772984。在抑制MA-5处理细胞中的p-ERK活性后，p-ERK表达显著降低，这伴随着Yap表达的降低（图。第五版–克). 因此，我们确认Yap受ERK通路调节。总之，我们的数据表明，Bnip3介导的线粒体自噬由MA-5通过MAPK–ERK–Yap信号通路控制。

讨论

神经炎症与神经变性和神经细胞死亡有关[6]它有助于阿尔茨海默病和帕金森综合征的进展。目前尚无有效的药物或治疗方法来预防或治疗神经炎症。有效治疗的设计取决于成功确定神经炎症的分子机制。

本研究的一个发现是，炎症反应以线粒体依赖的方式诱导神经细胞凋亡。外源性TNFα主要影响线粒体，导致线粒体电位降低、mPTP过度开放和caspase-9介导的凋亡途径激活。此外，由于线粒体呼吸复合体的下调，细胞能量代谢，特别是ATP的产生减少。细胞还产生多余的活性氧，导致细胞抗氧化系统失衡。通过这些机制，炎症反应介导神经细胞损伤，尤其是小胶质细胞死亡。

我们的发现揭示了神经炎症的发病机制，并表明线粒体是通过减少神经细胞死亡来调节神经炎症的潜在靶点。需要更多的临床数据来证实我们的理论。

在本研究中，我们还探讨了MA-5在神经炎症中的作用。MA-5，从植物激素吲哚-3-乙酸中分离出来[21]已测试用于线粒体疾病、心肌细胞损伤和肾小管损伤患者的治疗[32]. MA-5主要影响线粒体能量生产，增加线粒体呼吸和清除活性氧[41]. 根据Rothhammer等人报告的数据，在神经炎症的发展过程中，神经细胞损伤与吲哚-3-乙酸的下调密切相关[42]因此，通过MA-5补充吲哚-3-乙酸可能被认为是治疗神经炎症的有效方法。值得注意的是，之前的一项研究报告称，MA-5没有表现出典型的抗氧化性能[20]. 然而，在本研究中，我们发现MA-5通过有丝分裂间接调节氧化还原平衡，因为阻止Bnip3介导的有丝分裂可以完全消除MA-5在活性氧过度产生中的保护作用。然而，这一概念应该在未来的更多研究中得到验证。

更重要的是，我们的研究结果深入了解了MA-5保护神经细胞免受炎症损伤的分子机制。在TNFα处理的小胶质细胞中，MA-5以线粒体为靶点，Bnip3相关的有丝分裂是线粒体中MA-5的保护机制。MA-5上调Bnip5的表达，激活有丝分裂，降解受损的线粒体。有丝分裂激活抑制caspase-9凋亡，提高线粒体能量生产，减少细胞氧化应激。通过这些保护作用，MA-5维持线粒体功能并促进炎症损伤后神经细胞的生存信号传导。

此外，我们解释了MA-5调节Bnip3相关有丝分裂的调节机制。MAPK–ERK–Yap通路参与MA-5介导的Bnip3上调和有丝分裂激活。此前的研究报告称，Yap[39]通过增强JNK与Bnip3启动子的相互作用，是Bnip3转录的上游触发因子。这与我们的发现一致。

结论

我们全面概述了MA-5在神经炎症中的保护作用。MA-5通过MAPK–ERK–Yap信号通路发挥作用，该通路增加Bnip3相关的有丝分裂，导致炎症反应后凋亡信号被抑制。