格列美脲降低巨噬细胞CD14表达和细胞因子分泌

摘要

背景

激活的小胶质细胞与阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）和朊病毒病患者大脑中聚集蛋白的沉积有关。由于活化的小胶质细胞分泌的细胞因子被认为有助于这些神经退行性疾病的发病机制，抑制细胞因子产生的化合物已被确定为潜在的治疗靶点。CD14是一种糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白，是一种受体复合体的一部分，该复合体介导小胶质细胞对朊病毒病（PrP82-146）、AD（淀粉样β（aβ）中积累的肽的反应₄₂)和PD（α-突触核蛋白（αSN））。由于用格列美脲（一种用于治疗糖尿病的磺脲）处理后，一些GPI锚定蛋白从细胞中释放，因此研究了格列美脲对培养巨噬细胞CD14表达和细胞因子产生的影响。

方法

用格列美脲或磷脂酰肌醇（PI）-磷脂酶C（PLC）处理RAW 264细胞和小胶质细胞，并通过ELISA和免疫印迹分析细胞受体的表达。随后用Aβ孵育处理细胞₄₂测定αSN、PrP82-146或脂多糖（LPS）以及Toll样受体（TLR）-4、肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素（IL）-1和IL-6的含量。

结果

格列美脲从RAW 264细胞和小胶质细胞释放CD14。格列美脲预处理显著降低RAW 264和与LPS、Aβ孵育的小胶质细胞的TNF、IL-1和IL-6分泌₄₂，αSN和PrP82-146。格列美脲还降低了LPS，Aβ₄₂αSN和PrP82-146诱导TLR-4移位到与细胞激活相关的膜筏。用PI-磷脂酶C（PLC）消化RAW 264细胞后，也可以观察到格列美脲的这些作用。此外，格列美脲的作用被GPI-PLC的药理抑制所阻断。细胞因子的产生具有CD14依赖性；CD14基因敲除小鼠的小胶质细胞中表达量减少，并被CD14抗血清阻断。

结论

RAW 264和小胶质细胞对Aβ的反应_1–42αSN、PrP82-146和LPS依赖于CD14的表达。格列美脲通过激活GPI-PLC诱导CD14从细胞中脱落，从而减少对Aβ的反应产生的细胞因子₄₂、αSN、PrP82-146和LPS。这些结果表明，格列美脲作为一种新型抗炎剂，可以改变神经退行性疾病的进展。

背景

脑内聚集蛋白的沉积是神经退行性疾病的常见特征，包括阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）和朊病毒病。这些聚集物通常被活化的小胶质细胞包围，小胶质细胞是大脑中的巨噬细胞样细胞[1–三]和，在体外聚集形式的疾病相关肽刺激小胶质细胞/巨噬细胞分泌细胞因子[三–6]. 大量研究表明，细胞因子诱导的神经炎症与AD、PD和朊病毒疾病的临床进展有关[7–9]. 例如，流行病学研究报告称，使用非甾体抗炎药可延缓痴呆、PD和AD的进展[10–12]他汀类药物治疗痴呆的疗效[13]被认为具有抗炎作用[14]. 虽然很难确定脑内直接发生的细胞因子分泌的程度，但淀粉样蛋白-β（Aβ_1–42)α-突触核蛋白（αSN）或朊衍生肽（PrP82-146）刺激培养巨噬细胞和小胶质细胞分泌细胞因子[三,15–17]. 在本研究中，巨噬细胞系（RAW 264细胞）和分泌肿瘤坏死因子（TNF）和白细胞介素（IL）1和IL-6的原代小胶质细胞的反应[18]针对PrP82-146，Aβ_1–42研究了αSN。

有人认为，减少巨噬细胞细胞因子分泌的药物可能对AD和PD有治疗益处[19]. 据报道，多个受体参与巨噬细胞对聚集神经毒素蛋白的反应[20]包括清道夫受体[21]和CD40[22]，其他研究涉及CD14，一种在包括小胶质细胞在内的髓细胞上高度表达的蛋白质[23]，作为受体复合物的关键成分，介导纤维aβ肽诱导的细胞因子分泌[16]，朊病毒受损的神经元[24]和脂多糖[25,26]. 此外，CD14基因缺失可减弱AD小鼠模型的病理学[27]. 因此，我们假设任何降低小胶质细胞/巨噬细胞CD14表达的化合物也可能减少细胞因子分泌，从而改善认知下降的速度。目前对巨噬细胞上CD14表达的控制因素知之甚少。然而，CD14通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定与膜相连[28]和其他GPI锚定蛋白一样，它们也是以可溶性形式存在的。因此，血液中发现的可溶性CD14可以减少巨噬细胞分泌细胞因子[29]并预防LPS治疗小鼠的死亡[30]. 最近，发现AD和PD患者的可溶性CD14浓度升高，并与胶质细胞抑制有关[31]. 总的来说，这些观察结果表明，细胞相关CD14的减少或细胞外液中可溶性CD14的增加都可以减少巨噬细胞的细胞因子分泌。

格列美脲，一种用于治疗糖尿病的磺酰脲[32]，能够模拟胰岛素信号并激活内源性GPI-磷脂酶C（PLC）[33]导致脂肪细胞表面释放一些GPI锚定蛋白[34]和神经元[35]. 因此，本研究检测了其对巨噬细胞的影响。我们报告称，格列美脲处理的RAW 264和小胶质细胞在与PrP82-146、Aβ_1–42αSN或LPS。

方法

细胞系

小鼠RAW 264细胞系在添加2 mM谷氨酰胺、5%胎牛血清（FCS）（PAA、，http://www.gelifesciences.com/PAA)和标准抗生素（100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素-Invitrogen，http://www.lifetechnologies.com/uk). 细胞以2 x 10的速度接种在48个板中⁵每个孔中的细胞数，并允许隔夜粘附。用试验化合物（包括格列美脲、格列吡嗪、对氯汞苯基磺酸盐（p-CMPS）、多粘菌素B或磷脂酰肌醇（PI）-PLC）预处理细胞蜡样芽孢杆菌，（均来自Sigma）或带有CD14抗体（山羊多克隆IgG抗小鼠CD14（R&D Systems，http://www.rndsystems.com)、PrP^C类在添加LPS（Sigma，网址：http://www.sigmaaldrich.com)，PrP82-146，αSN或Aβ₄₂24小时后收集细胞上清液，并检测细胞因子或CD14。收集细胞提取物并检测CD14和Toll样受体（TLR）-4。实验在三个重复的井中进行。使用配对抗体通过夹心酶联免疫分析（ELISA）测定TNF、IL-1和IL-6的水平（见下文）。

小胶质细胞

这些是通过分离C57Bl/B6J、CD14野生型和C57B1/B6J和CD14基因敲除小鼠（Jackson Laboratory，http://www.jax.org)如前所述[36]. 通过反复通过细孔移液管制备细胞悬浮液，并通过100μM细胞滤网过滤去除碎屑。将细胞悬浮在含有2 mM谷氨酰胺、标准抗生素和10%FCS的Ham’s F12培养基中，并放置在涂有聚赖氨酸的75 cm培养基中^三烧瓶。培养物用5%CO维持在37°C₂持续两周或直到胶质细胞培养融合。以260 rpm的转速摇晃培养2小时，分离小胶质细胞。收集分离的细胞，计数并按2×10分配⁵48周板中每孔的细胞数。90%以上的细胞对小鼠巨噬细胞标记蛋白F4/80（Serotec，http://www.abdsterec.com网站/).

细胞提取物

在处理结束时，细胞在PBS中清洗两次，并在含有10 mM Tris-HCl（pH 7.4）、100 mM NaCl、10 mM乙二胺四乙酸（EDTA）、0.5%Nonide P-40、0.5%脱氧胆酸钠、0.2%十二烷基硫酸钠（SDS）和混合蛋白酶抑制剂（4-（2-氨基乙基）苯磺酰氟）的提取缓冲液中匀浆，抑肽酶、亮氨酸肽、bestatin、胃蛋白酶抑制素A和E-46-西格玛）⁶细胞/ml。用惠顿匀浆器反复传代制备膜；通过离心（300×克持续5分钟）。

耐洗涤剂膜（DRMs）/脂筏的分离

细胞在含有1%Triton X-100、10mM Tris-HCl（pH 7.2）、100mM NaCl、10mM EDTA和混合蛋白酶抑制剂（10⁶细胞/ml）。通过匀浆制备膜，通过离心（300×克持续5分钟）。在进一步离心之前，将核后上清液在冰上培养60分钟（16000×克在4°C下保持30分钟）。将可溶性物质保留为正常细胞膜。将小球溶解在提取缓冲液（10 mM Tris-HCl、10 mM NaCl、10 mM-EDTA、0.5%Nonide P-40、0.5%脱氧胆酸钠、0.2%SDS和混合蛋白酶抑制剂）中，再次离心（在16000×克)保留上清液作为脂筏部分。

IL-1βELISA

将抗IL-1β的单克隆抗体（R&D系统）在碳酸盐缓冲液中稀释至2μg/ml，并在96周Maxisorb免疫板（Nunc，Roskilde，Denmark）中分配过夜。添加样品一小时，然后添加二级抗体（生物素化山羊抗小鼠IL-1β（研发系统））。加入1小时的外泌素碱性磷酸酶（1:1000，西格玛），之后加入1mg/ml的4-硝基苯基磷酸盐底物（西格玛）。20分钟后，在450 nM下读取平板，并参考重组小鼠IL-1β（R&D系统）的标准曲线计算结果。

IL-6酶联免疫吸附试验

将抗IL-6的单克隆抗体在碳酸盐缓冲液中稀释至2μg/ml，并在96周Maxisorb免疫板中放置过夜。添加样品一小时，然后添加二级抗体（一种与碱性磷酸酶（R&D系统）结合的多克隆抗小鼠IL-6），该抗体使用1 mg/ml 4-硝基苯基磷酸盐检测。在450 nM下读取平板，并参考重组小鼠IL-6（R&D系统）的标准曲线计算结果。

肿瘤坏死因子ELISA

将多克隆IgG至TNF（研发系统）在碳酸盐缓冲液中稀释至2μg/ml，并在96-well Maxisorb免疫板中分配过夜。将样品添加1小时，然后添加检测抗体，即以200 ng/ml添加的生物素化抗鼠TNF多克隆抗体（R&D系统）。然后再添加1:5000稀释的外源性碱性磷酸酶，再添加1小时后再添加1 mg/ml 4-硝基苯基磷酸酶。在450nM下读取平板，并通过参考重组鼠TNF（研发系统）的标准曲线计算结果。

CD14酶联免疫吸附试验

用0.5μg/ml大鼠IgG1抗小鼠CD14单克隆抗体（克隆RmC5-3）（BD Biosciences，网址：http://www.bdbiosciences.com). 应用样品，并使用山羊多克隆IgG抗小鼠CD14（R&D系统）测量结合CD14的量，然后使用与碱性磷酸酶（Sigma）和1 mg/ml 4-硝基苯基磷酸酯（Sigma-）结合的抗山羊IgG。在405 nm的微孔板阅读器上测量吸光度。结果以CD14单位报告，其中100单位 = CD14在10中的数量⁶控制RAW 264单元。

TLR-4酶联免疫吸附试验

用0.5μg/ml小鼠TLR-4单克隆抗体（Abcam-ab22048）（表位100-200）包被Maxisorb免疫板，并用5%奶粉封闭。使用样品（室温下一小时），使用兔多克隆IgG至TLR-4（Abcam-ab13556）（表位420至435），然后使用与碱性磷酸酶结合的抗兔IgG和1 mg/ml 4-硝基苯基磷酸酯，测量TLR-4的量。在405 nm的微孔板阅读器上测量吸光度。结果报告为%TLR-4，其中100% = 对照RAW 264细胞提取液中TLR-4的量。

PrP82-146酶联免疫吸附试验

如前所述，通过ELISA测定细胞提取物中PrP82-146的含量[35]. 用单克隆抗体3 F4（Abcam，http://www.abcam.com). 样品用0.2%十二烷基硫酸钠煮沸至变性肽并孵育1小时。使用生物素化ICSM35（Mourad Tayebi博士的礼物）检测结合PrP82-146，然后检测外源性碱性磷酸酶和1 mg/ml 4-硝基苯基磷酸盐。在405 nm的微孔板阅读器上测量吸光度，并参考PrP82-146的标准曲线计算细胞提取物中PrP82-146的量。

Aβ₄₂酶联免疫吸附试验

Maxisorb免疫板涂有单抗4G8（表位17至24）（Covance，http://www.bioscience.co.uk/covance)在碳酸盐缓冲液中过夜。用PBS-Tween中5%的奶粉封住盘子，并使用样品。检测抗体为Aβ₄₂选择性兔单抗BA3-9（Covance），然后是生物素化抗兔IgG（Sigma）。通过添加1 mg/ml 4-硝基苯基磷酸酯来观察总Aβ，并在405 nm的分光光度计中读取光密度。在405nm的微孔板阅读器上测量吸光度，并通过与合成aβ的系列稀释液进行比较来计算结果_1–42.

蛋白质印迹分析

样品与Laemmli缓冲液混合，加热至95°C，并在15%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。将蛋白质转移到Hybond-P PVDF膜上（Amersham Biotech，http://www.gelifesciences.com)通过半干吸墨纸。用10%奶粉封闭膜，并与任一mAb ICSM35孵育（以检测PrP^C类)、山羊多克隆IgG抗小鼠CD14（R&D系统）、绵羊多克隆抗CD55（R＆D系统）或兔抗小窝蛋白多克隆抗体（Upstate，网址：http://www.millipore.com)，然后是与过氧化物酶缀合的第二抗小鼠、兔或山羊IgG（Sigma）。用增强化学发光法观察结合抗体。

多肽

合成肽包含人类PrP蛋白（PrP82-146）的82至146个氨基酸，对应于朊病毒感染的大脑中发现的PrP片段，以及对照肽（PrP 82-146scrambled），由Mario Salmona教授（米兰马里奥·内格里研究所）提供。一种合成肽，含有Aβ蛋白（Aβ）的1到42个氨基酸残基_1–42)和由相同氨基酸组成的控制肽（aβ_42–1)是从Bachem获得的。肽储备溶液储存在1 mM的二甲基亚砜中，并在使用当天解冻，然后在培养基中稀释、超声处理并添加到细胞中。重组αSN和βSN购自Sigma。

统计方法

使用Student’s，两个样本，配对，评估治疗组之间的差异-t吨测验。在所有测试中，统计显著性设置为5%。

结果

格列美脲刺激RAW 264细胞释放CD14

由于格列美脲刺激脂肪细胞释放一些GPI锚定蛋白[34]和神经元[35]研究了格列美脲对RAW 264细胞中GPI-锚定蛋白表达的影响。用格列美脲处理1小时后，RAW 264细胞中CD14的数量以剂量依赖的方式减少（图1A） ；RAW 264细胞中CD14的丢失伴随着这些细胞上清液中CD14数量的相应增加（图1B） ●●●●。这些影响发生在无毒浓度的格列美脲中，因此，添加5μM格列美肽不会显著改变噻唑蓝四氮唑测定的细胞存活率（97%的细胞生存率 ± 6比100% ± 7，n = 12,对 = 0.24). 用另一种用于治疗糖尿病的磺酰脲类药物5μM格列吡嗪预处理RAW 264细胞，不会影响细胞内CD14的数量（数据未显示）。格列美脲的作用不是CD14特异性的；它还减少了GPI锚定的细胞朊蛋白（PrP^C类)在细胞中，但不影响GPI-锚定CD55或小窝蛋白的数量（图1C） 。格列美脲（而非格列吡嗪）对小胶质细胞有类似的作用；用5μM格列美脲处理后，细胞CD14减少，上清液中可溶性CD14增加（图1D） ●●●●。通过Western blot测定，格列美脲导致可溶性CD14数量呈剂量依赖性增加（图1E） ●●●●。

图1

格列美脲从RAW264细胞中释放CD14。（A）用对照培养基处理1小时后，RAW 264细胞中CD14的数量(□) 或格列美脲(■) 如图所示。值是指 ± SD，来自执行4次的三次重复实验，n = 12（B）用对照培养基处理1小时后，RAW 264细胞上清液中CD14的数量(□) 或如图所示的格列美脲(■). 值是指 ± SD，来自执行4次的三次重复实验，n = 12（C）免疫印迹显示CD14、PrP的数量^C类用对照介质（i）或5μM格列美脲（ii）处理1小时的RAW 264细胞提取物中的CD55和小窝蛋白。（D）细胞中CD14的数量(□) 或上清液(■) 用对照培养基、5μM格列美脲或5μM glipizide处理小胶质细胞1小时。数值为平均单位CD14 ± SD，根据三次重复实验得出，n = 9.*细胞CD14显著低于对照细胞**上清液CD14显著大于对照上清液。（E）印迹显示了用格列美脲浓度处理一小时后小胶质细胞上清液中CD14的数量。

格列美脲减少RAW 264细胞分泌细胞因子

聚合肽激活小胶质细胞被认为影响朊病毒疾病的进展。添加PrP82-146增加了RAW 264细胞的TNF分泌（图2A） ●●●●。用对照肽（PrP82-146打乱）培养的细胞产生的TNF与用对照培养基处理的细胞没有显著差异。1μg/ml多粘菌素B（一种阻断LPS作用的抗生素）的加入并未影响PrP82-146诱导的TNF生成，这表明细胞因子的生成并非由于这种常见细菌污染物的污染所致。然后测试格列美脲对肿瘤坏死因子分泌的影响。与对照细胞相比，添加5μM格列美脲或5μM glipizide不会增加TNF的生成。然而，用5μM格列美脲而不是5μM glipizide进行预处理，显著减少了用PrP82-146培养的RAW 264细胞的TNF分泌（图2B） ●●●●。格列美脲对TNF生成的影响具有剂量依赖性；添加50μM PrP82-146后，细胞CD14的数量与TNF的生成量之间存在显著相关性（图2C） 。同样，用5μM格列美脲而非格列吡嗪预处理RAW 264细胞，可显著减少IL-1β的分泌（图2D） 或IL-6（图2E） ●●●●。

图2

格列美脲减少与PrP82-146孵育的RAW 264细胞的细胞因子分泌。（A）与PrP82-146孵育的RAW 264细胞产生的TNF浓度(●)，PrP82-146加扰(■) 或PrP82-146和1μg/ml多粘菌素B(□). 值是指 ± SD来自进行4次的一式三份实验，n = 12（B）用对照培养基预处理RAW 264细胞产生的TNF浓度(●)，5μM格列美脲(○)或5μM格列吡嗪(□) 并与PrP82-146孵育。值是指 ± 进行4次重复实验的SD，n = 12（C）用格列美脲（0.3至5μM）处理1小时的RAW 264细胞的细胞CD14数量与添加50μM PrP82-146后TNF的生成量之间存在显著相关性，皮尔逊系数 = 0.858,P（P） < 0.01.（D）RAW 264细胞经对照培养基预处理后产生的IL-1β浓度(●)，5μM格列美脲(○)或5μM格列吡嗪(□) 并与PrP82-146孵育。值是指 ± 进行4次重复实验的SD，n = 12（E）RAW 264细胞经对照培养基预处理后产生的IL-6浓度(●)，5μM格列美脲(○)或5μM格列吡嗪(□) 并与PrP82-146孵育。值是指 ± 进行4次重复实验的SD，n = 12

Aβ的添加_1–42，但不是Aβ_42–1也导致RAW 264细胞分泌TNF（图三A） ●●●●。Aβ_1–42-1μg/ml多粘菌素B的加入不会影响TNF的诱导分泌。用5μM格列美脲预处理，而不是5μM glipizide预处理，可显著降低Aβ_1–42-诱导TNF分泌（图三B） ，IL-1β（图三C） 或IL-6（图三D） ●●●●。类似地，αSN而非βSN的添加导致RAW 264细胞分泌TNF（图4A） ●●●●。αSN诱导的TNF分泌不受1μg/ml多粘菌素B的影响。用5μM格列美脲（而不是5μM格列吡嗪）治疗前，可显著降低αSN诱导的TNF分泌（图4B） ，IL-1β（图4C） 或IL-6（图4D） 来自RAW 264单元。

图3

格列美脲减少与Aβ孵育的RAW 264细胞分泌细胞因子。（A）与Aβ孵育的RAW 264细胞产生的TNF浓度_1–42(●)，Aβ_42–1(■) 或Aβ_1–42和1μg/ml多粘菌素B(□). 值是指 ± 进行4次重复实验的SD，n = 12（B）RAW 264细胞经对照培养基预处理后产生的TNF浓度(●)5μM格列美脲(○)或5μM格列吡嗪(□) 并与Aβ孵育_1–42。值是指 ± 进行4次重复实验的SD，n = 12（C）RAW 264细胞经对照培养基预处理后产生的IL-1β浓度(●)5μM格列美脲(○)或5μM格列吡嗪(□) 并与Aβ一起孵育_1–42。值是指 ± 进行4次重复实验的SD，n = 12（D）RAW 264细胞经对照培养基预处理后产生的IL-6浓度(●)，5μM格列美脲(○)或5μM格列吡嗪(□) 并与Aβ孵育_1–42。值是指 ± 进行4次重复实验的SD，n = 12

图4

格列美脲减少与αSN孵育的RAW 264细胞的细胞因子分泌。（A）αSN孵育RAW 264细胞产生TNF的浓度(●)，β序号(■) 或αSN和1μg/ml多粘菌素B(□). 值是指 ± 进行4次重复实验的SD，n = 12（B）用对照培养基预处理RAW 264细胞产生的TNF浓度(●)，5μM格列美脲(○)或5μM格列吡嗪(□) 并与αSN孵育。值是指 ± 进行4次重复实验的SD，n = 12（C）RAW 264细胞经对照培养基预处理后产生的IL-1β浓度(●)或5μM格列美脲(○)或5μM格列吡嗪(□) 并与αSN孵育。值是指 ± 进行4次重复实验的SD，n = 12（D）RAW 264细胞经对照培养基预处理后产生的IL-6浓度(●)，5μM格列美脲(○)或5μM格列吡嗪(□) 并与αSN孵育。值是指 ± SD来自进行4次的一式三份实验，n = 12

格列美脲减少小胶质细胞分泌细胞因子

将RAW 264细胞的反应与原代小胶质细胞的反应进行比较，原代小神经胶质细胞在与50μM PrP82-146或50μM Aβ孵育时产生相似数量的TNF_1–42.与对照肽、PrP82-146干扰肽或Aβ孵育的小胶质细胞分泌的TNF数量_42–1，不显著高于对照小胶质细胞（数据未显示）。用5μM格列美脲而非5μM glipizide预处理小胶质细胞，可显著降低50μM PrP82-146或50μM Aβ对TNF分泌的影响_1–42（图5A） ●●●●。目前尚不清楚格列美脲处理的细胞释放的可溶性CD14是否与PrP和Aβ肽结合，从而阻止它们与小胶质细胞的相互作用，也不清楚格列美脲是否导致小胶质细胞对PrP及Aβ肽反应迟钝。因此，在添加50μM PrP82-146或50μM Aβ之前，用5μM格列美脲处理小胶质细胞1小时，然后彻底清洗以去除任何可溶性受体_{1–42之间。}我们报告，当与50μM PrP82-146或50μM Aβ孵育时，洗涤细胞产生的TNF少于对照细胞_1–42（图5B） ●●●●。

图5

格列美脲减少与PrP82-146或Aβ孵育的小胶质细胞分泌细胞因子 _1–42 .（A）用对照培养基预处理1小时后小胶质细胞产生的TNF浓度(■), 5μM格列美脲(□) 或5μM格列吡嗪（条纹棒），并与对照培养基、50μM PrP82-146或50μM Aβ孵育_1–42如图所示。值是指 ± 三次重复实验的SD，n = 9.*TNF显著低于用肽培养的对照细胞。（B）对照培养液预处理后小胶质细胞产生TNF的浓度(●)或5μM格列美脲1小时(□），或用5μM格列美脲预处理1小时，用PBS（条纹条）洗涤3次，并用50μM PrP82-146或50μM Aβ孵育_1–42如图所示。值是指 ± 三次重复实验的SD，n = 9.*TNF显著低于用肽培养的对照细胞。

格列美脲的免疫抑制作用是暂时的

采用时间进程研究确定格列美脲对RAW 264和小胶质细胞的影响是否永久。用5μM格列美脲处理后，RAW 264细胞中与细胞相关的CD14均随时间增加（图6A） 和小胶质细胞（图6C） 。同样，RAW 264和小胶质细胞对PrP82-146产生TNF的能力也表现出时间依赖性增加（图6B和D）。

图6

RAW264和小胶质细胞从格列美脲诱导的细胞因子生成抑制中恢复。（A）用对照培养基处理的RAW 264细胞中CD14的数量(□) 或5μM格列美脲(■). 价值是手段 ± 两次重复实验的SD，n = 6（B）用对照培养基预处理RAW 264细胞产生的TNF浓度(□）或5μM格列美脲(■) 并与50μM PrP82-146孵育24小时。值是指 ± 两次重复实验的SD，n = 6（C）对照培养液处理的小胶质细胞中CD14的含量(□) 或5μM格列美脲(■). 值是指 ± 两次重复实验的SD，n = 6（D）对照培养液预处理后小胶质细胞产生TNF的浓度(□) 或5μM格列美脲(■) 并与50μM PrP82-146孵育24小时。值是指 ± 两次重复实验的SD，n = 6

格列美脲减少LPS诱导的细胞因子分泌

还研究了格列美脲对与LPS孵育的RAW 264细胞分泌细胞因子的影响。添加LPS导致TNF、IL-1β和IL-6的分泌呈剂量依赖性增加，而使用5μM格列美脲进行预处理后，TNF、IL-1β和IL-6的分泌减少（图7A、 B和C）。相反，细胞因子的分泌不受5μM格列吡嗪预处理的影响。同样，用5μM格列美脲而不是5μM glipizide进行预处理，可以减少与LPS孵育的原代小胶质细胞产生的TNF（图7D） ●●●●。当在添加10 ng/ml LPS之前用不同浓度的格列美脲预处理RAW 264细胞时，格列美肽以剂量依赖性的方式减少TNF分泌（图7E） ●●●●。当用格列美脲（0.3至5μM）处理后的细胞CD14浓度与LPS产生的TNF相比较时，观察到显著的相关性（图7F） ●●●●。

图7

格列美脲减少脂多糖（LPS）诱导的细胞因子分泌。（A）用对照培养基预处理RAW 264细胞产生的TNF浓度(●)，5μM格列美脲(○)或5μM格列吡嗪(■) 并与脂多糖孵育。值是指 ± 进行4次重复实验的SD，n = 12（B）RAW 264细胞经对照培养基预处理后产生的IL-1β浓度(●)，5μM格列美脲(○)或5μM格列吡嗪(■) 并与脂多糖孵育。价值是手段 ± 进行4次重复实验的SD，n = 12（C）RAW 264细胞经对照培养基预处理后产生的IL-6浓度(●)，5μM格列美脲(○)或5μM格列吡嗪(■) 并与脂多糖孵育。值是指 ± 进行4次重复实验的SD，n = 12（D）对照培养液预处理后小胶质细胞产生TNF的浓度(●)，5μM格列美脲(○)或5μM格列吡嗪(■) 并与脂多糖孵育。值是指 ± 进行4次重复实验的SD，n = 12（E）用对照培养基预处理RAW 264细胞产生的TNF浓度(□) 或如图所示的格列美脲(■) 并与10 ng/ml LPS孵育。值是指 ± 三次重复实验的SD，n = 9（F）格列美脲（0.3至5μM）处理的RAW 264细胞的CD14含量与10 ng/ml LPS产生的TNF浓度之间存在显著相关性，皮尔逊系数 = 0.886.

PI-PLC消化减少RAW 264细胞分泌细胞因子

研究了格列美脲诱导免疫抑制的分子机制。由于格列美脲激活内源性GPI-PLC，导致GPI-锚定蛋白的释放[34,35]，我们假设PI-PLC治疗对巨噬细胞的作用与格列美脲相似。用0.2单位的PI-PLC/ml处理RAW 264细胞1小时，显著减少了细胞相关CD14（7单位 ± 3比100 ± 10，牛顿 = 9,P（P） < 0.05）和增加细胞上清液中CD14的数量（81单位 ± 6台与7台相比 ± 4，n = 9,P（P） < 0.05），从而复制格列美脲对RAW 264细胞的部分作用。至关重要的是，用0.2单位/ml PI-PLC预处理1小时的RAW 264细胞在与50μM PrP82-146，Aβ孵育时产生的TNF、Il-1β和Il-6显著减少_1–42或αSN（图8A、 B和C）。这些细胞对LPS的反应也产生较少的TNF、IL-1β和IL-6（图9A、 B和C）。

图8

PI-PLC消化减少RAW 264细胞的细胞因子分泌。（A）用对照培养基预处理RAW 264细胞产生的TNF浓度(□) 或PI-PLC(■) 并与50μM PrP82-146，Aβ孵育_1–42或αSN。值是指 ± 进行4次重复实验的SD，n = 12.*TNF显著低于用肽培养的对照细胞。（B）RAW 264细胞经对照培养基预处理后产生的IL-1β浓度(□) 或PI-PLC(■) 并与50μM PrP82-146，Aβ孵育_1–42或αSN。值是指 ± 重复实验进行4次的SD，n = 8.*IL-1β显著低于肽孵育的对照细胞。（C）RAW 264细胞经对照培养基预处理后产生的IL-6浓度(□) 或PI-PLC(■) 并与50μM PrP82-146，Aβ孵育_1–42或αSN。值是指 ± 重复实验进行4次的SD，n = 8.*IL-6显著低于用肽培养的对照细胞*IL-6显著低于肽孵育的对照细胞。

图9

用PI-PLC消化的RAW 264细胞对脂多糖（LPS）反应迟钝。（A）RAW 264细胞经对照培养基预处理后产生的TNF浓度(●)、PI-PLC(○)或热失活PI-PLC(■) 并与LPS一起孵育。值是指 ± 进行4次重复实验的SD，n = 12.（B）用对照培养基预处理的RAW 264细胞产生的IL-1β的浓度(●)、PI-PLC(○)或热失活PI-PLC(■) 并与脂多糖孵育。值是指 ± 进行4次重复实验的SD，n = 12（C）RAW 264细胞经对照培养基预处理后产生的IL-6浓度(●)、PI-PLC(○)或热失活PI-PLC(■) 并与脂多糖孵育。值是指 ± 进行4次重复实验的SD，n = 12

接下来，我们试图通过抑制GPI-PLC的活性来逆转格列美脲的作用。pCMPS（GPI-PLC抑制剂）的作用[37])研究了格列美脲对细胞因子产生的抑制作用。用200μM p-CMPS处理不会影响RAW 264细胞（94个单位）中CD14的数量 ± 11比100 ± 8，n = 9,P（P） = 0.5），也不影响用10 ng/ml LPS（2614 pg/ml）培养的RAW 264细胞分泌TNF ± 338 pg/ml，而2549 pg/ml ± 306，编号 = 9,P（P） = 0.7). 然而，在RAW 264细胞中添加200μM p-CMPS逆转了格列美脲对细胞的影响，阻止了格列美脲诱导的细胞CD14的减少（图10A） 减少格列美脲对PrP82-146，Aβ诱导的TNF分泌的抑制₄₂和αSN（图10B） 或LPS（图10C） 。初级小胶质细胞的行为与RAW 264细胞相似，因为格列美脲诱导了PrP82-146和aβ的抑制₄₂-通过加入200μM p-CMPS逆转了TNF的生成（图10D） ●●●●。

图10

格列美脲诱导的免疫抑制被pCMPS逆转。（A）用对照培养基或5μM格列美脲在对照培养基存在下处理1小时的RAW 264细胞中CD14的数量(□) 或200μM pCMPS(■). 值是指 ± SD来自进行4次的一式三份实验，n = 12.*CD14显著高于格列美脲处理的细胞。（B）用对照培养基预处理RAW 264细胞产生的TNF浓度(□），5μM格列美脲(■), 或5μM格列美脲和200μM pCMPS（条纹条），并与50μM PrP82-146、50μM Aβ孵育_1–42或50μMα序号。值是指 ± 进行4次重复实验的SD，n = 12.*TNF显著低于用肽培养的对照细胞。（C）用对照培养基预处理RAW 264细胞产生的TNF浓度(●)，5μM格列美脲(○)或5μM格列美脲和200μM pCMPS(■)并与LPS孵育，如图所示。值是指 ± 进行4次重复实验的SD，n = 12（D）对照培养液预处理后小胶质细胞产生TNF的浓度(□），5μM格列美脲(■), 或5μM格列美脲和200μM pCMPS（条纹条），并与50μM PrP82-146或50μM Aβ孵育_1–42。值是指 ± 两次重复实验的SD，n = 6.*TNF显著低于用肽培养的对照细胞。

CD14参与肽诱导的细胞因子分泌

这些结果与以下假设一致，即格列美脲对细胞因子分泌的抑制作用是通过GPI锚定蛋白介导的，而CD14已知参与LPS诱导的细胞因子分泌[25]其他GPI锚定蛋白，如细胞朊蛋白（PrP^C类)CD55也可能参与巨噬细胞的活化[26,38]. 为了确定这些受体中哪一个对肽诱导的细胞因子产生至关重要，用CD14、PrP抗体对RAW 264细胞进行预处理^C类或CD55。用CD14抗血清而不是PrP抗血清预处理RAW 264细胞^C类或CD55减少与PrP82-146，Aβ孵育的RAW 264细胞的TNF分泌₄₂或αSN（图11A） 表明CD14是参与肽诱导TNF分泌的主要受体。当与PrP82-146或Aβ孵育时，来自CD14基因敲除小鼠的小胶质细胞产生的TNF少于来自CD14野生型小鼠的小神经胶质细胞，这一观察结果加强了这一假设₄₂（图11B） ●●●●。值得注意的是，来自PrP的小胶质细胞的TNF分泌^C类当与PrP82-146或Aβ孵育时，基因敲除小鼠与来自Prnp野生型小鼠的小胶质细胞没有显著差异₄₂（未显示数据）。

图11

CD14介导肽刺激的RAW 264细胞分泌细胞因子。（A）用CD14抗血清预处理RAW 264细胞产生的TNF浓度(■), PrP公司^C类(□) 或CD55（条纹条），与50μM PrP82-146，Aβ孵育_1–42或αSN。值是指 ± 三次重复实验的SD，n = 9.*TNF显著低于与肽孵育的对照细胞。（B）CD14野生型小胶质细胞产生TNF的浓度(□) 或CD14淘汰赛(■) 用PrP82-146或Aβ孵育的小鼠_1–42。值是指 ± 三次重复实验的SD，n = 9.*TNF显著低于肽孵育的CD14野生型细胞的TNF。

我们的研究结果表明，格列美脲的免疫抑制作用是由CD14的表达减少介导的，CD14是LPS和与朊病毒、阿尔茨海默病和帕金森病相关的神经毒性肽的受体。为了确定格列美脲是否减少了RAW 264细胞对神经毒性肽的摄取，用50μM PrP82-146或50μM Aβ₄₂持续2小时。用5μM格列美脲进行预处理不会显著改变PrP82-146（43μM）的浓度 ± 与41μM相比为5 ± 7，n = 9,P（P） = 0.5）或Aβ₄₂（39微米 ± 与40μM相比为8 ± 7，n = 9,P（P） = 0.7）在RAW 264细胞中表达。

肽导致TLR-4移位到膜筏

由于CD14周围形成的信号复合物也包括TLR-4[26]，研究巨噬细胞刺激物对TLR-4的影响。首先，我们发现添加50μM PrP82-146（100个单位）不会显著改变RAW-264细胞中TLR-4的数量 ± 5台，而98台 ± 7，n = 9,P（P） = 0.62）或50μM Aβ₄₂（100个单位 ± 5台，而97台 ± 8，n = 9,P（P） = 0.49). 信号复合物的形成涉及TLR-4在特定的抗洗涤剂膜（通常称为脂筏）中的募集[39,40]. 在这里，我们表明，添加PrP82-146而不是对照肽（PrP82-146加扰）导致（DRM）筏内TLR-4数量的剂量依赖性增加（图12A） ●●●●。添加50μM Aβ后，筏中TLR-4的数量也增加_1–42或αSN，但不受50μM Aβ的影响_42–1或βSN（图12B） ●●●●。将RAW 264细胞与不同浓度的PrP82-146、Aβ_1–42或αSN，筏内TLR-4的含量与TNF的产生量之间存在显著相关性（图12C） 。当RAW-264细胞与LPS孵育时，也得到了类似的结果；即LPS导致TLR-4迁移到筏中，并且筏中TLR-4的数量与TNF的生产之间存在显著相关性（图12D） ●●●●。

图12

PrP82-146导致Toll样受体（TLR）-4移位到筏中。（A）经PrP82-146处理的RAW 264细胞衍生的DRM中TLR-4的百分比(●)或PrP82-146加扰(○). 价值是手段 ± 三次重复实验的SD，n = 9（B）DRM中的%TLR-4来源于经控制介质处理的RAW 264细胞(□）或50μM Aβ_1–42，Aβ_42–1、αSN或βSN，如图所示(■). 值是指 ± 三次重复实验的SD，n = 9.*TLR-4显著高于对照细胞。（C）用PrP82-146培养RAW 264细胞(○)，Aβ_1–42(●)或αSN(□) （6至50μM）。PrP82-146、Pearson系数的筏中%TLR-4与TNF之间存在显著相关 = 0.88，Aβ_1–42，皮尔逊系数 = 0.78和αSN皮尔逊系数 = 0.86.（D）与脂多糖（LPS）（0.75至50 ng/ml）孵育的RAW 264细胞筏中的%TLR-4与产生的TNF、Pearson系数、 = 0.887.

格列美脲减少肽诱导TLR-4向膜筏的移位

用5μM格列美脲处理RAW264细胞也不会影响整个细胞（100个单位）中TLR-4的数量 ± 5台，而99台 ± 7，n = 9,P（P） = 0.71）或DRM内（筏）（21个单元 ± 3台，而20台 ± 6，n = 9,P（P） = 0.58). 接下来，我们发现用5μM格列美脲预处理可以减少用50μM PrP82-146培养的细胞筏中TLR-4的数量（图13A） ，50μM Aβ_1–42（图13B） ，50μMαSN（图13C） 或10 ng/ml LPS（图13D） ●●●●。用5μM格列吡嗪预处理RAW 264细胞不会影响肽或LPS诱导的TLR-4向DRM的移位。

图13

格列美脲减少Toll样受体（TLR）-4向筏的易位。（A）用对照培养基、5μM格列美脲或5μM glipizide预处理RAW 264细胞筏中的%TLR-4，并用对照培养液培养(□) 或50μM PrP82-146(■). 值是指 ± 进行4次重复实验的SD，n = 12.*TLR-4显著低于用PrP82-146培养的对照细胞。（B）用对照培养基、5μM格列美脲或5μM glipizide预处理RAW 264细胞筏中的%TLR-4，并用对照培养液培养(□) 或50μM Aβ_1–42(■). 值是指 ± 进行4次重复实验的SD，n = 12.*TLR-4显著低于与Aβ孵育的对照细胞_1–42.（C）用对照培养基、5μM格列美脲或5μM glipizide预处理RAW 264细胞筏中的%TLR-4，并用对照培养液培养(□) 或50μMαSN(■). 值是指 ± 进行4次重复实验的SD，n = 12.*TLR-4显著低于用αSN孵育的对照细胞。（D）如图所示，用对照培养基、5μM格列美脲或5μM glipizide预处理RAW 264细胞筏中的%TLR-4，并与对照培养基孵育(□) 或10 ng/ml LPS(■). 值是指 ± 进行4次重复实验的SD，n = 12.*TLR-4显著低于与脂多糖（LPS）孵育的对照细胞。

讨论

越来越多的证据表明炎症会加剧症状并加速AD和PD的进展[10–12]. 因此，被聚集蛋白激活的胶质细胞被视为治疗靶点。这里我们显示了格列美脲的生理相关浓度[41]导致从RAW 264和小胶质细胞中释放几个GPI-锚定蛋白，这与该药物激活内源性GPI-PLC的报道一致[33,34]. 格列美脲处理RAW 264细胞时，当这些细胞与PrP82-146、Aβ₄₂或αSN。

细胞因子在神经退行性疾病中的作用存在争议，尽管有报道称TNF可以保护神经元抵抗Aβ[42,43]大多数研究表明，细胞因子浓度升高会加剧神经退行性变。因此，在包括AD和PD在内的神经退行性疾病中，TNF水平升高[44,45]抑制TNF可预防AD小鼠模型的神经病理学和术后认知功能下降[46,47]TNF抑制剂依那西普可改善AD患者的认知能力[48]. 同样，阿尔茨海默病、艾滋病痴呆综合征、多发性硬化症、中风、帕金森病和创伤性脑损伤患者的脑组织或脑脊液（CSF）中IL-6水平升高[49]IL-6受体在突触的神经元上表达，可以调节神经递质的释放[50,51]. 由于这些观察结果，人们认为减少细胞因子产生的化合物可能会减少神经退化。

由于格列美脲会降低许多GPI锚定蛋白的表达，包括CD14、PrP^C类和CD55-与细胞因子产生有关的蛋白质[25,26,52]-尚不清楚哪个GPI-锚定蛋白负责细胞对聚集肽的反应。然而，我们发现，CD55的表达不受格列美脲的影响，CD55抗血清不影响肽诱导的细胞因子的产生。虽然格列美脲降低了PrP^C类PrP抗血清不影响RAW 264细胞的含量和细胞因子的产生^C类相反，CD14抗血清阻断了肽和LPS诱导的细胞因子的产生。此外，当与PrP82-146或Aβ孵育时，CD14敲除小鼠的小胶质细胞产生的细胞因子少于CD14野生型小鼠的小神经胶质细胞_1–42总之，这些结果表明，CD14的丢失是格列美脲诱导细胞因子生成抑制的关键因素。格列美脲处理细胞中CD14的丢失伴随着细胞上清液中CD14相应增加，表明CD14是从细胞中释放出来的，而不是降解的。

在AD和PD动物模型中CD14的表达增加[53]CD14参与小胶质细胞对Aβ纤维的识别[16]和朊病毒受损的神经元[24]. 虽然格列美脲预处理显著降低了RAW 264和与PrP82-146、αSN或Aβ孵育的小胶质细胞产生的TNF和IL-6的数量₄₂，它没有降低PrP82-146或Aβ的结合₄₂至RAW 264单元。因此，尽管细胞上清液中可溶性CD14的存在可能与PrP或Aβ肽结合，但这种复合物仍与细胞相互作用。此外，用格列美脲处理过的细胞，然后清洗，以去除任何可溶性CD14，对PrP和Aβ肽仍然反应迟钝，这表明仅用可溶性CD14不足以解释格列美肽的免疫抑制作用。这些观察表明，尽管细胞以CD14非依赖性的方式结合这些肽，但细胞因子的产生依赖于CD14的参与。最近，在AD的转基因小鼠模型中，CD14的缺失被证明可以减弱AD样病理[27]提示CD14依赖性小胶质细胞对聚集的Aβ的反应是AD病理的主要驱动因素。

胰岛素诱导的GPI-PLC激活产生第二信使，介导胰岛素的细胞内效应[54]. 因为格列美脲模拟胰岛素对GPI-PLC的影响[33,55]我们假设，正是格列美脲诱导内源性GPI-PLC的激活导致CD14的释放和细胞因子生成的抑制。这一观点得到了两个观察结果的支持；首先，PI-PLC消化的RAW 264细胞与格列美脲处理的细胞相似，因为它们比对照细胞含有更少的CD14，分泌更少的细胞因子。其次，加入GPI-PLC的选择性抑制剂p-CMPS[37]，逆转了格列美脲对CD14细胞水平和细胞因子产生的影响。

这些观察结果可能具有超越神经退行性疾病的意义，因为与许多急性传染病相关的发病机制可能部分是由巨噬细胞过度释放细胞因子引起的。例如，LPS被认为是主要的巨噬细胞刺激物，导致革兰氏阴性细菌感染中细胞因子过度产生。CD14被鉴定为介导LPS诱导的细胞活化的受体[25]在一些动物模型中，CD14基因敲除小鼠对急性败血症具有抵抗力[56]提示通过CD14依赖机制诱导细胞因子对发病至关重要。在这里，我们发现格列美脲治疗也减少了脂多糖诱导的TNF和IL-6分泌。虽然这些结果表明CD14的丢失是格列美脲处理的巨噬细胞低反应状态的原因，但我们注意到格列美肽可能会降低其他GPI锚定蛋白的表面表达，其中一些可能是LPS诱导的反应的原因。PrP公司^C类和CD55是GPI-锚定蛋白，与LPS信号有关[26]. 在这些实验中，CD14在LPS诱导的细胞因子产生中的主要作用通过CD14敲除小胶质细胞和中和CD14抗血清来证明。

由于格列美脲不能减少LPS或神经毒性肽与巨噬细胞的结合，我们研究了这些细胞中的细胞信号。LPS与CD14的结合并不单独启动细胞活化；相反，这是形成信号复合体的第一步。因此，CD14作为TLR-4的共同受体，介导髓样细胞的活化[26]. CD14以膜筏为靶点，在静止细胞中，膜筏以微区的形式存在，直径为5至200 nm[57,58]它们“准备”形成更大的木筏[59]并在特定刺激下结合，形成更大的信号平台[57,59–62]. 单个筏的结合可能将受体和信号蛋白结合成一个功能复合体；例如，LPS诱导CD14:MD2:TLR-4复合物的形成[63]. 值得注意的是，这种三受体复合物是Aβ激活小胶质细胞所必需的[64]TLR-4与小鼠AD模型中细胞因子产生增加有关[65,66].

外膜小叶筏对外界刺激的重新组织可以导致细胞质小叶上细胞内信号分子的分类[67–70]从而激活细胞。例如，细胞外LPS已被证明在特定受体参与后将关键信号蛋白TLR-4募集到筏中[26,63,70]并激活导致细胞因子产生的细胞内信号通路。在本研究中，我们证明了PrP82-146，Aβ_1–42或αSN也导致TLR-4移位到筏中，并且筏内TLR-4的数量与细胞因子产生测定的细胞活化之间存在显著相关性。至关重要的是，在使用格列美脲处理的细胞中，TLR-4向筏中的移位减少。

结论

迫切需要治疗神经退行性疾病的新方法。在这里，我们表明格列美脲触发了RAW 264细胞CD14的释放，这与内源性GPI-PLC的激活以及GPI-锚定蛋白（包括RAW 264cells中的CD14）的脱落一致。因此，格列美脲治疗显著减少了与PrP82-146、Aβ孵育的RAW 264细胞的细胞因子分泌_1–42或αSN。这些观察结果表明，格列美脲可能会减少神经退行性疾病的细胞因子分泌，从而减少神经炎症，应被视为AD的一种新的辅助治疗方法。