Smyd2的鉴定和表征：一种与Sin3组蛋白脱乙酰酶复合物相互作用的分裂SET/MYND结构域组蛋白H3赖氨酸36特异性甲基转移酶

摘要

背景

破坏组蛋白赖氨酸甲基化的平衡会改变参与肿瘤发生的基因的表达，包括原癌基因和细胞周期调节因子。赖氨酸残基的甲基化通常由含有SET结构域的蛋白质家族催化。在这里，我们报道了SET结构域蛋白Smyd2的鉴定和表征。

结果

northern分析和就地杂交。过度表达的Smyd2定位于293T细胞的细胞质和细胞核。尽管越来越多的证据表明组蛋白3、赖氨酸36（H3K36）的甲基化与活性转录基因相关，但我们表明Smyd2的SET结构域介导H3K36-二甲基化，Smyd2抑制SV40-荧光素酶报告子的转录。Smyd2与Sin3A组蛋白去乙酰化酶复合物特异性相关，该复合物最近与酵母活性基因编码区内的H3K36甲基化有关。最后，我们报告了外源性Smyd2表达抑制细胞增殖。

结论

我们认为，活性基因编码区内的Sin3A介导的脱乙酰化与Smyd2的组蛋白甲基转移酶活性直接相关。此外，Smyd2似乎通过直接调节染色质结构来抑制细胞增殖。

背景

细胞增殖和分化由同步的基因表达模式协调。这些模式的调控部分是通过表观遗传机制实现的，这些表观遗传机理影响DNA包装到染色质中的性质[1]. 具体来说，组蛋白尾部的翻译后共价修饰影响核小体的结构动力学，从而影响DNA对转录复合物的可及性[2–4]. 组蛋白的常见修饰包括甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化[5]. 重要的是，组蛋白甲基化和乙酰化整体水平的改变与癌症病变的生物学及其临床结果有关[6]. 许多组蛋白赖氨酸甲基转移酶（HKMT）在多种癌症类型中被破坏[7,8]. 组蛋白甲基化如何在机制上促进致癌状态尚不清楚。

所有已知的HKMT，只有一个例外[5]通过SET域催化甲基转移，SET域是许多蛋白质中编码的一个模块，可调节多种过程，包括对细胞周期的发育和正常进展至关重要的过程[2,9,10]. 特定残基上的组蛋白赖氨酸甲基化通常与不同的基因表达状态相关[5]. 组蛋白3（H3）包含组蛋白甲基转移酶的大多数已知靶向赖氨酸，因此充当这种表观遗传调控的管道。一般来说，H3K9、H3K27和H4K20上的赖氨酸甲基化与基因沉默相对应，而H3K4、H3K36或H3K79的甲基化与活性转录基因相关[5]. H3K36（H3K36me）的甲基化与活性转录基因密切相关[11,12]和似乎主要对应于编码区域内。最近观察到酵母中H3K36通过Set2甲基化，通过Eaf3的色域直接识别H3K36me，从而招募Rpd3介导的组蛋白脱乙酰酶复合物[13–15]. Rpd3是一种组蛋白去乙酰化酶（HDAC），具有公认的转录阻遏物功能[13]. Rpd3结合成几个共抑制复合物，包括一个含有Pho23、Sds3、Sap30、Ume1、Cti6/Rxt1和Sin3的复合物[13]. 然而，最近的证据表明，HDAC也可能在活性转录过程中发挥作用。因此，H3K36的甲基化通过Rpd3-Sin3与组蛋白脱乙酰化直接相关，而Rpd3-Sin3又在活性转录期间起到维持染色质结构的作用[13–15]. 这些发现揭示了组蛋白修饰的新的复杂性，并表明我们需要更好地理解催化这些修饰的酶。

在这里，我们描述了一个含有SET结构域的蛋白质亚家族，它具有独特的结构域结构。这个蛋白质家族由一个SET结构域定义，该结构域被MYND结构域分成两段，然后是富含半胱氨酸的SET后结构域[16]（图。1安培). 该家族成员可能是重要的发育调节因子，因为Smyd1基因的靶向破坏会导致心肌细胞成熟受损、心脏形态发生缺陷和胚胎致死[17]. 功能上，Smyd1被认为通过与组蛋白脱乙酰酶活性的关联来调节基因表达[17]. Smyd3因参与癌细胞增殖而闻名[8]. 在大多数肝细胞癌和结直肠癌中过度表达，其在NIH3T3细胞中外源性过度表达显著促进了生长[8,18,19]. 与Smyd1类似，Smyd3通过其固有的H3K4特异性HKMT活性调节染色质结构[8]. 虽然Smyd2与Smyd1和Smyd3高度保守，但其生化或功能活性尚不清楚。在这里，我们证明Smyd2含有SET域依赖性H3K36 HKMT活性。Smyd2与Sin3A组蛋白去乙酰化酶复合物特异性结合，表明两种独立的染色质修饰活性之间存在联系。此外，我们观察到Smyd2在NIH3T3细胞中的过度表达显著抑制其生长。我们认为Smyd2介导的染色质修饰调节对正常和肿瘤细胞增殖具有重要意义的特定基因表达。

图1

哺乳动物Smyd家族蛋白的比对和Smyd2定位。（A） 五种哺乳动物Smyd蛋白的示意图。分割的SET域以浅灰色显示；MYND结构域以黑色表示，富含半胱氨酸的SET后结构域以深灰色显示。显示了氨基酸的位置。（B） 组织中Smyd1、Smyd2和Smyd3转录物的表达。顶面板：Smyd3 mRNA在胸腺和骨骼肌中表达最高[8]。中间面板：Smyd2 mRNA在心脏和大脑中表达最高。底部面板：Smyd1的表达仅限于心脏和骨骼肌[20]。Smyd1、Smyd2和Smyd3的转录物在胚胎中表达。（C） 氨基酸末端SET残基、MYND结构域和核心SET残余物的ClustalW对齐，然后是Smyd1、Smyd2、Smyd3、Smyd4和Smyd5中存在的SET后结构域。（D） Smyd2定位于细胞质和细胞核。用1μg质粒转染指数生长的293T细胞，编码myc标记的Smyd2。转染48小时后，将细胞固定、清洗、渗透并暴露于单克隆小鼠抗myc抗体。用DAPI对细胞核进行复染。右图：Smyd2（红色）定位于293T细胞的细胞核和细胞质。左面板：Nuclei用DAPI（蓝色）复染。实验重复三次，结果相同。（E） Smyd2 mRNA在E13.5定位于大脑的心脏和下丘脑。整体安装就地性交后第13.5天胚胎中Smyd2转录物的杂交是通过将Smyd2特异性的正（右）和反（中）DNA探针暴露到切片上进行的。而与感测探针杂交未产生信号（右图），因此作为对照，在性交后第13.5天胚胎的心脏和大脑下丘脑中很容易检测到Smyd2 mRNA（中图）。

结果

Smyd2的结构特征和表达

尽管人类基因组中编码了50多种SET结构域蛋白，但只有一小部分被证明甲基化组蛋白。在所有SET蛋白中，有五个簇合成一个亚家族，其中包含一个SET结构域，该结构域被MYND结构域/锌指基序分为两段，这在蛋白质相互作用中有牵连(S公司ET和我的N个D类)（图。1摄氏度). 该家族成员是癌症（Smyd3）和基本发育过程（Smyd1）的直接调节者[8,17]. 因此，鉴于Smyd2与Smyd1和Smyd3具有高度同源性，因此了解其生化和生物学特性非常重要。来自Expressed Sequence Tags的数据表明Smyd2在广泛的正常、肿瘤和疾病组织中表达（数据未显示）。为了确定基因表达最高的组织，使用Smyd1、Smyd2或Smyd3特有的探针通过多组织印迹进行northern印迹。北部分析（图。1B年)证明与Smyd1相比，Smyd2和Smyd3 mRNA在多种组织中表达更广。如前所述，Smyd1仅在T淋巴细胞、心肌和骨骼肌中表达[20]. Smyd3在骨骼肌中的表达最高[8]和胸腺（图。1B年)尽管它的转录物在大脑、肾脏和卵巢中也被高度检测到（图。1B年). Smyd2 mRNA转录水平最高的组织包括心脏、大脑、肝脏、肾脏、胸腺和卵巢（图。1B年此外，Smyd2和Smyd3转录物在胚胎mRNA中均可检测到，这表明Smyd1、Smyd2及Smyd3可能与发育有关（图。1B年). 为了确定哪些胚胎组织表现出最高水平的Smyd2转录物就地在第13.5天使用小鼠胚胎和Smyd2特异性探针进行杂交。在妊娠中期，Smyd2转录物定位于心脏和大脑的下丘脑（图。1E级).

Smyd1和Smyd3的免疫组织化学染色表明，这两种蛋白均定位于C2C12的细胞质和细胞核内[21]和Huh7细胞[8]分别是。为了确定Smyd2的亚细胞定位，使用myc标记的Smyd2融合蛋白进行免疫组织化学染色。与Smyd1和Smyd3类似，Smyd2定位于细胞质和细胞核内（图。一维).

Smyd2是一个依赖SET的HKMT

Smyd2含有SET结构域的催化核心残基，对Smyd1和Smyd3的组蛋白甲基转移酶活性至关重要（图。1摄氏度) [22,8]. 这表明Smyd2也可能具有HKMT活性。在野生型Smyd2-Myc（或Smyd3-Myc作为阳性对照）与S-腺苷-L–[甲基]孵育后测试组蛋白甲基化-^三以小牛胸腺中的甲硫氨酸（SAM）和混合组蛋白为底物。17 kD频带对应于^三荧光图中，Smyd3和Smyd2均可见H标记的H3（图。2安培，车道1和3），表明Smyd2具有内在的HKMT活性。核心SET结构域C末端区域的酪氨酸在催化活性SET结构区蛋白中保守（图。1摄氏度). 因此，为了测试观察到的Smyd2的HKMT活性是否需要SET结构域，在Smyd3-Myc（Y239F）和Smyd2-Myc（Y240F）的这个残基中进行了点突变。Smyd3（Y239F）-Myc和Smyd2（Y240F）-Mac均未显示HKMT活性（图。2安培，车道2和4）。

图2

Smyd2二甲基化物组蛋白H3赖氨酸36（A）Smyd2甲基化组蛋白H3在体外使用小牛胸腺的混合组蛋白作为底物进行组蛋白甲基转移酶（HKMT）测定。荧光图显示在上面板中；显示与组蛋白H3相对应的17 kD带；考马斯染色SDS-PAGE凝胶用于验证等负荷，并在下部面板中进行了描述。通道1和3在H3分别通过myc标记Smyd3和myc标记的Smyd2显示出阳性的HKMT活性。通道2和通道4表明Smyd3（Y239F）和Smyd2（Y240F）催化突变体均不具有HKMT活性。结果表明，Smyd3的HKMT活性取决于Smyd2的Y239和Y240。（B） Smyd2甲基化组蛋白H3在体外以重组八聚体为底物的组蛋白甲基转移酶检测。荧光图显示在上面板中；显示了与组蛋白H3相对应的17kD带；考马斯染色SDS-PAGE凝胶用于验证等负荷，并在下部面板中进行了描述。组蛋白H3被Smyd2用重组八聚体作为底物甲基化体外HKMT分析。（C） Smyd2甲基化组蛋白H3在体外以重组组蛋白H3为底物的组蛋白甲基转移酶检测。荧光图显示在上面板中；显示了与组蛋白H3相对应的17 kD带；考马斯染色SDS-PAGE凝胶用于验证等负荷，并在下部面板中进行了描述。组蛋白H3被Smyd2用重组八聚体作为底物甲基化体外HKMT分析（通道1）。催化缺陷突变体Smyd2（Y240F）未能甲基化重组组蛋白H3（通道2）。因此，Smyd2的HKMT活动取决于Y240。（D） Smyd2不使用重组组蛋白H3作为底物在赖氨酸4处二甲基化组蛋白H3体外HKMT分析。显示了使用特异性与二甲基化组蛋白H3，赖氨酸4反应的抗体的西方结果；与组蛋白H3相对应的17 kD带被显示出来。通道1和通道4表明免疫沉淀和myc标记的Smyd3，而非myc标记Smyd2，赖氨酸4处的二甲基化组蛋白H3。通道2和5显示Smyd2（Y240F）和Smyd3（Y239F）在赖氨酸4处均未二甲基化组蛋白H3。我们得出结论，Smyd2在赖氨酸4处不使组蛋白H3二甲基化。（E） Smyd2二甲基化组蛋白H3赖氨酸36，使用重组组蛋白H4作为底物体外HKMT分析。西方的结果显示，使用与二甲基化组蛋白H3、赖氨酸36特异反应的抗体；与组蛋白H3相对应的17 kD带被显示出来。通道1和3表明Smyd2二甲基化物在赖氨酸36处重组组蛋白H3，与myc或Gal4标签无关。催化失活突变体Y240F在赖氨酸36（通道2）处不二甲基化重组组蛋白H3。Smyd3以及催化缺陷突变体Y239F在赖氨酸36（通道4和5）处不二甲基化重组组蛋白H3。我们得出结论，Smyd2二甲基化物在赖氨酸36处重组组蛋白H3，而Smyd3不显示这种活性。

接下来在重组组蛋白H3底物上测试Smyd2 HKMT活性。野生型Smyd2-Myc甲基化H3（图。2摄氏度，车道1），但Smyd2（Y240F）-Myc未显示HKMT活动（图。2摄氏度，车道2）。为了测试未标记Smyd2蛋白的活性，Smyd2在大肠杆菌中表达为GST融合，随后裂解GST部分。与重组Smyd2孵育后，检测重组组蛋白八聚体的甲基化。一致地，重组Smyd2被观察到甲基化组蛋白H3（图。2B型，车道1）。因此，我们得出结论，Smyd2具有SET域依赖性的内在HKMT活性。

Smyd2二甲基酯H3K36

鉴于Smyd1和Smyd3对H3K4均具有特异性[22,8]，我们测试了Smyd2是否具有类似的特异性。使用重组H3进行组蛋白甲基转移酶检测，并使用针对各种甲基赖氨酸残基的抗体通过western blotting测定特异性。这些检测中使用的抗体包括抗二甲基H3K4、抗三甲基H3K4、抗二甲基H3K9、抗三甲H3K9，抗三甲基H3K27、抗二甲基H3K36和抗二甲基H3K79。当用抗二甲基H3K4探测反应时，在Smyd3中观察到对应于H3的17 KD带，但在Smyd2中没有观察到（图。二维（分别为通道4和1）或抗三甲基H3K4（数据未显示）。这表明Smyd2与Smyd1或Smyd3具有不同的靶向特异性。相反，Smyd2的HKMT活性对H3K36具有特异性，这是通过用抗二甲基H3-K36抗体进行免疫印迹法测定的（图。第二版，车道1和3）。使用上述其他抗体，Smyd2似乎没有靶向其他残留物（数据未显示）。因此，我们得出结论，Smyd2二甲基化物H3K36。

Smyd2与HDAC1和Sin3阻遏复合物相关

Smyd3通过与特定启动子序列结合诱导转录激活[8]. 相反，已知Smyd1与GAL4融合时通过与HDAC活性相关抑制转录[17]. 鉴于Smyd2对与活性转录相关的标记H3K36具有活性，我们测试了Smyd2的转录调节活性。使用Smyd2生成GAL4融合蛋白，并在10T1/2细胞中进行瞬时荧光素酶分析。出乎意料的是，Smyd2-GAL4抑制了包含GAL4结合位点的SV40启动子的转录（图。3B公司)，表明其功能可能与Smyd1类似。

图3

Smyd2与Sin3抑制复合物结合，并参与转录抑制。（A） GAL4-Smyd2融合蛋白在293T细胞中的表达。指数生长的293T细胞转染所示结构，转染48小时后，使用RIPA缓冲液制备全细胞裂解液，并使用针对GAL4标签的抗体进行西方分析。在适当的分子量（约66 kD）下检测到反应带。用GAL4-DBD构建物转染的细胞提取物[17]作为阴性对照。（B） Smyd2抑制荧光素酶报告子的转录。顶部面板：所用报告器构造的示意图。底部面板：10T1/2细胞与5XGAL4-SV40-荧光素酶报告子（1μg）和GAL4-DBD或GAL4-Smyd2（各2μg）瞬时共转染。荧光素酶的活性百分比与GAL4-DBD有关。Smyd2显著抑制10T1/2细胞中荧光素酶报告子的转录。（C） Smyd2与HDAC1相关。指数生长的293T细胞与GAL4-DBD或GAL4-Smyd2以及标记有Flag的HDAC1（HDAC1-F）瞬时共转染。使用抗GAL4抗体免疫沉淀全细胞RIPA提取物，并使用抗FLAG抗体检测免疫印迹。如图所示，Smyd2与HDAC1关联。GAL4-DBD转染细胞的RIPA全细胞提取物[17]作为阴性对照。通过使用抗Flag抗体分析5%的输入，证明免疫沉淀分析中的蛋白质量相等。（D） Smyd2与Sin3A相互作用，但不与NuRD复合体相互作用。指数生长的293T细胞转染所示结构，转染48小时后，制备完整的RIPA裂解物。针对GAL4的抗体用于免疫沉淀，然后使用所示抗体进行西方分析。Smyd2与HDAC1和Sin3A相关，但与NuRD复合物、MBD3或MTA2的成分无关。

虽然H3K36的甲基化与活性转录基因相关，但最近的三份报告表明，在酵母中，Set2对H3K363的甲基化激活了Rpd3-Sin3组蛋白脱乙酰酶复合物[13,14]. 我们在上述实验中发现Smyd2含有H3K36甲基化活性和抑制转录的功能，这促使我们研究Smyd2是否与Rpd3-Sin3复合物的人类同源物相互作用。在293T细胞的瞬时转染实验中，Rpd3的人类同源物HDAC1在用抗GAL4抗体免疫沉淀后与Smyd2-GAL4特异性相互作用（图。3C公司). 一致地，当过表达Smyd2-GAL4的293T细胞的细胞提取物用抗GAL4抗体免疫沉淀时，免疫复合物包含内源性Sin3A（图。三维). 相反，Smyd2-GAL4未能免疫沉淀FLAG标记的MBD3和MTA2，这是含有HDAC1的NuRD复合物的成分（图。三维). 因此，我们得出结论，Smyd2优先与不同的含HDAC1的配合物，即Sin3A相互作用。

Smyd2抑制细胞增殖

Smyd3作为组蛋白甲基转移酶在转录调控中的作用与其增强细胞增殖的能力有关[8]. 为了研究Smyd2对细胞增殖的影响，用Smyd2-Myc或Smyd3-Myc转染NIH3T3细胞。相对于对照，并与之前的研究结果一致[8]Smyd3的过表达显著增加了细胞生长（图。4). 相反，用Smyd2转染3T3细胞导致其增殖减少（图。4)表明Smyd2在维持细胞周期进展中具有潜在作用。

图4

Smyd2抑制NIH3T3细胞增殖。用编码myc标记Smyd2或myc标记的Smyd3的质粒转染指数生长的NIH3T3细胞。用空表达结构（Mock）转染的细胞作为对照。使用台盼蓝排除法通过细胞计数来监测所有细胞。插入物显示了转染后0和144小时Smyd2-myc和Smyd3-myc的表达水平，表明所用NIH3T3细胞系中外源性蛋白的水平相似。体外引入Smyd3可促进细胞增殖，但Smyd2对NIH3T3细胞的生长速度有负面影响。

讨论

在解释共价组蛋白修饰在转录调控中的作用方面取得了很大进展。组蛋白赖氨酸甲基化影响染色质的结构，从而建立复杂的基因表达模式[23]. 在某些情况下，这些模式是明确定义的。例如，H3K4甲基化通常与常染色质的形成以及随后局部基因表达的激活有关[三]. 反过来，H3K9的甲基化通常与异染色质的形成和随后的邻近基因转录沉默有关[三,4]。

酵母HKMT Set2的初步数据表明，它通过甲基化H3K36发挥转录抑制作用[24]. 然而，Set2的HKMT活性后来与RNA聚合酶II（RNAPII）的延伸期有关[25,26]. 同样，在一项更现代的研究中，对后生动物中H3K36甲基化的分布进行了分析，将这种修饰与活性转录基因相关联[11]. 最近，Set2使H3K36甲基化与组蛋白去乙酰化酶复合物Rpd3的募集有关[13]. 组蛋白去乙酰化在活性基因编码区内的整体作用和意义尚不清楚。

在哺乳动物表观遗传学中，NSD1是第一批对H3K36起作用的HKMT之一[27]. NSD1是否在转录激活或抑制中起作用尚待确定。最近的一项研究报告称，人类HYPB蛋白甲基化H3K36，这种酶活性是HYPB作为转录激活物发挥作用所必需的[28]。

我们的研究结果将Smyd2引入H3K36特异性HKMT，作为转录抑制因子。显然，还有其他转录调控机制与H3K36的甲基化相关。似乎我们对组蛋白标记在哪里定位以及哪些蛋白质促进了这一过程了解得越多，我们就越不确定这种定位最终如何促进基因调控。虽然这使我们应用组蛋白修饰的广义解释的能力复杂化，但它为寻求“组蛋白密码”的深层折叠提供了明确的方向

Smyd2监管功能

转录分析表明Smyd2可以抑制荧光素酶报告基因的转录（图。3B公司). 最近在酵母中的一项研究表明，H3K36的甲基化激活了组蛋白去乙酰化酶复合物Rpd3[13]. 同时，另一个研究小组得出结论，H3K36甲基化诱导Rpd3复合物的募集导致与RNAPII延伸期相关的赖氨酸乙酰化的逆转，这表明它具有阻止基因内转录起始的功能[14]. 这让人想起FACT复数的作用机制。也就是说，当延伸复合体穿过编码区时，FACT促进染色质结构的失稳，以传递有效的加工延伸，以及染色质的重组，以防止转录的基因内启动[29]. 虽然H3K36甲基化招募Rpd3复合物，但有人认为FACT招募可能通过其与CHD1的关联发生，CHD1识别三甲基化的H3K4[30]. 众所周知，Rpd3复合体含有Sin3[13]，发现Smyd2也与Sin3有关，这一发现尤其有启发性。进一步确定是否体内Sin3的招募需要H3K36甲基化、Smyd2的存在或两者兼而有之。

Smyd2在NIH3T3细胞中过度表达显著降低细胞生长。在之前的一项研究中，细胞增殖试验表明，Smyd3被引入NIH3T3细胞后可以促进细胞生长[8]. 众所周知，细胞增殖和分化是由基因转录的同步模式协调的。就Smyd3而言，细胞生长的增强取决于Smyd3蛋白的H3K4特异性HKMT活性[8]. 这将有助于确定Smyd2对细胞生长的抑制作用是否需要其作为H3K36特异性HKMT的功能。这样的确定，再加上对Smyd2假定的基因靶向特异性的鉴定，将为Smyd家族的功能提供更广泛的机制模型。

组蛋白赖氨酸甲基化比其他已知的翻译后修饰更稳定，可持续数轮细胞分裂[31–33]. 这使得赖氨酸甲基化在多种持久的信号网络中具有潜在价值，不仅在组蛋白和非组蛋白（如p53和TAF10）的细胞核中，而且可以想象在细胞质中。发现Smyd1和Smyd3可以定位在细胞质中[21,8]我们观察到Smyd2也能进行细胞溶质定位，这也证实了这一观点。Smyd1在肌源性分化过程中从细胞核向细胞质移动的发现进一步加强了这一论点[21]. 另一个含SET结构域的HKMT，Ezh2及其伙伴Eed和Suz12，主要位于各种小鼠和人类细胞的细胞质中[34,35]. 在细胞核内，Ezh2复合物催化H3K27甲基化，而细胞溶质Ezh2结合Rho家族GTPases的控制器Vav1，并且Ezh2对于之前归因于Vav1的信号事件很重要[34–36]. 没有证据表明Ezh2甲基化了Vav1，因此细胞质中赖氨酸甲基化的意义尚不清楚。然而，我们目前正在测试Smyd2介导的赖氨酸甲基化在与Smyd2相互作用伙伴形成稳定且可能遗传的细胞溶质信号复合物中的作用，并且我们计划跟踪这些复合物一旦形成，在静止和分裂细胞中。

Smyd家族

Smyd HKMT通过其set结构域的分裂性质与其他此类染色质修饰酶区分开来。每个Smyd蛋白的SET结构域被一个MYND结构域分割（图1安培&1摄氏度)，一个锌指基序，介导蛋白质-蛋白质相互作用。这个结构域存在于几个转录调控因子中，这些转录调控因子被证明调节不同的生物功能[37,38]. 例如，Smyd1的MYND结构域对其与肌肉特异性转录因子skNAC的相互作用至关重要[21]. 此外，ETO是急性髓细胞白血病染色体易位的常见靶点，通过完整的MYND结构域指导转录抑制[39]. 因此，MYND结构域在基因调控中的重要性已经得到了很好的证实，它可能为通过Smyd2影响其转录调控活性整体结果的其他机制提供一些见解。Smyd2的完整功能体内除HDAC1和Sin3A外，它还可能依赖于其他蛋白质和复合物，与之相关。我们目前正在筛选其他几个候选相互作用伙伴，其性质可能为Smyd2调节的机制和途径提供进一步线索。

Northern印迹分析显示Smyd2和Smyd3在多种组织中表达（图。1B年)而Smyd1在组织分布上更受限制[20]. 我们和其他人对Smyds1-3的研究表明，Smyd家族成员通过一种共同的机制发挥作用，特别是赖氨酸甲基化。可以合理地假设，单个Smyd蛋白与不同的转录因子和其他最终决定特定基因调控的效应蛋白相关。没有其他Smyd家族成员在功能上与Smyd1重复，因为纯合Smyd1-null小鼠在E10.0天因心肌细胞分化受损而导致胚胎致死[17]. Smyd2在胚胎心脏中的显著表达（图。1B、E)提示与Smyd1一样，Smyd2可能调节心脏发育。对Smyd家族蛋白生物学功能的鉴定无疑将揭示染色质修饰与特定组织发育和分化之间关系的新见解。

结论

我们得出结论，Smyd2二甲基化物H3K36和HDAC1介导的活性基因编码区的脱乙酰化与Smyd2的组蛋白甲基转移酶活性直接相关。我们进一步认为Smyd2在基因表达调控中的作用最终会抑制细胞增殖。从这项研究中可以清楚地看出，未来对Smyd蛋白的研究将着重于独特的生物背景，这将有助于阐明Smyd家族蛋白的生物学功能，揭示了染色质修饰与组织和有机体的发育和分化之间关系的新的迷人见解。

方法

计算分析

使用国家生物技术信息中心（NCBI）网站上的蛋白质数据库，从BLAST比较中确定Smyd家族成员网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ClustalW和BOXSHADE程序用于Smyd家族蛋白的比对和着色

细胞培养

细胞系在37°C的DMEM中生长，补充10%胎牛血清、1 mM L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、青霉素、链霉素和真菌酮（均来自Life Technologies），湿度为5%CO₂在本研究中，我们使用了来自ATCC的293T、10T1/2和NIH3T3细胞。

构件

SV40-荧光素酶报告子包含五个GAL4-UAS拷贝，来自J.Milbrandt[25]. pRL-TK从Promega购买。GAL4-哺乳动物表达结构GAL4-DBD（DNA-结合域）已在前面描述[17]. Smyd2和Smyd3全长EST克隆来自Invitrogen。通过PCR扩增（5’ATG CGC GCC GAG GCC CGC；3’TCA GTG GCT CTC AAT CTC CTC CTG）和限制性消化（Not I；Xba I）构建GAL4-Smyd2哺乳动物表达载体，然后亚克隆到GAL4-DBD质粒[17]. Myc-Y240F和Myc-Y239F点突变分别产生于Myc-Myd2的SET域（5'CGA GGT GTT CAC CAG CTT CAT CGA CCT GCT ATA TCC；3'GGA TAT AGC TCG ATG AAG CTG AAC TCG）和Myc-Myd 3（5'GGA GCT CAC CAT CTG CTT CCT GGA CAT GCT GAT GAT GCC；3'GGT CAT CAG CAT GTC CAG GAA GCA GAT GAG CTC），使用GeneEditor在体外根据制造商的说明，现场定向突变系统（Promega）。FLAG标记的HDAC1-F哺乳动物表达质粒是S.L.Schreiber赠送的礼物[40]. GST融合蛋白制备于大肠杆菌并使用谷胱甘肽琼脂糖珠（Sigma-Aldrich）进行纯化。GST的切割是使用PreScission蛋白酶（Amersham bioscience）完成的；用SDS-PAGE凝胶银染法验证产物的纯度。标记有FLAG的MBD3-F和MTA2-F表达质粒由R.M.Evans提供[41]. 所有构建物的序列均经DNA测序证实。

瞬时转染和荧光素酶分析

根据制造商的说明，使用FuGENE6试剂（Roche）进行所有转染。在免疫沉淀实验中，293T细胞以2×10的密度被培养⁶转染前24小时，每100 mm平板上的细胞数。每100 mm平板使用8μg总DNA加24μl FuGENE6试剂。转染48小时后收集细胞。对于荧光素酶报告分析，10T1/2细胞以2×10的密度接种⁵转染前24小时每6孔板的细胞数。每个孔使用3.5μg总DNA加10.5μl FuGENE6试剂。根据制造商的说明，使用双荧光素酶报告分析系统试剂盒（Promega）进行荧光素酶分析。使用Dynex测光仪读取样品。

抗体

抗Myc小鼠单克隆抗体（9E10）和单克隆抗FLAG抗体（M2）购自Sigma-Aldrich。抗GAL4小鼠单克隆抗体（RK5C1）和抗Sin3A兔多克隆抗体（K-20）购自Santa Cruz Biotechnology。用于确定HKMT活性特异性的抗体详述如下。过氧化物酶结合全IgG二级抗体购自Jackson ImmunoResearch Laboratories。如前所述进行蛋白质印迹和免疫沉淀实验[21]。

多组织北方分析

根据制造商的说明，使用ULTRAhyb杂交缓冲液（Ambion）进行Northern印迹。全长Smyd2和Smyd3的探针是通过限制性消化切除（Not I；Xba I）从它们各自的GAL4哺乳动物表达构建体和Strip EZ DNA探针合成试剂盒（Ambion）中产生的，如手册中所述。全长Smyd1探针是通过限制性消化切除（EcoRI）从前面描述的pBK-CMV-Smyd1B表达结构中生成的[21]. 多组织Northern印迹购自Ambion（FirstChoice Northern blot Mouse blot I）。使用磷光成像仪检测斑点。

现场杂交

全长Smyd2的DNA探针是通过限制性消化切除（Not I；Xba I）从其上述GAL4哺乳动物表达结构中生成的。如Lu等人所述，进行探针合成、杂交和放射自显影术[42]稍作修改。简单地说，胚胎在性交后第13.5天获得，并在4%多聚甲醛中固定过夜。组织切片与正反义DNA探针杂交在55°C、7.5×10的温度下过夜⁵每张幻灯片的cpm。通过严格清洗去除未杂交探针，并将载玻片涂上K.5核乳剂（英国伊尔福德），然后在4°C下暴露21天。显影后，用苏木精对载玻片进行复染，并用亮场和暗场光学观察。

荧光成像细胞定位

根据制造商的说明，使用Fugene 6（Roche）将1μg质粒转染293T细胞，编码myc标记的Smyd2。转染48小时后，将细胞固定（4%多聚甲醛在PBS中放置10分钟），清洗并渗透（0.5%Triton X-100在PBS内放置15分钟）。在室温下培养单克隆小鼠抗myc抗体45分钟。洗净后，将山羊抗鼠Alexa 488（分子探针）在2%BSA中以1:400的比例稀释，并在室温黑暗中孵育15分钟。用DAPI对细胞核进行复染。将载玻片清洗两次，持续45分钟，并用VectaStain固定。细胞通过连续共焦激光扫描显微镜（Leica SP2 AOBS）进行分析。

细胞增殖试验

用6μg Smyd2-Myc、Smyd3-Myc或pcDNA3单独转染NIH3T3细胞。在6天的时间内观察每种蛋白质的过度表达对细胞生长的影响，并通过使用台盼蓝染色的细胞计数来评估。

体外组蛋白甲基转移酶测定

用表达Myc-tagged野生型Smyd2（Smyd2-Myc）、野生型Smid3（Smyd3-Myc）或突变型Smyd3（Smid2（Y240F）-Myc）的质粒转染293T细胞，并用抗Myc抗体通过免疫沉淀纯化过表达的标记蛋白。组蛋白甲基转移酶分析如Hammamoto等人所述[8]. 简单地说，Smyd蛋白与1μg来自小牛胸腺（Sigma）或重组H3（Upstate）的混合组蛋白孵育。此外，2μCi S-腺苷-L–[甲基-^三H]蛋氨酸（SAM；Amersham Biosciences）作为甲基供体。所有反应均在30°C的40μl HKMT反应缓冲液（10 mM二硫苏糖醇、100 mM NaCl和50 mM Tris-HCl，pH 8.8）中进行3小时。使用18%的SDS-PAGE凝胶来解析样品，并使用荧光成像法显示甲基化阳性。考马斯蓝染色观察底物负载。

为了确定Smyd2活性的特异性，将免疫沉淀的Smyd蛋白与重组H3和20μM未标记SAM（Sigma）在40μl HKMT反应缓冲液中在30°C下孵育1小时。使用抗二甲基化H3K4、三甲基化H3 K4、二甲基H3 K9、三甲基H3K9、三甲基H3 K27、二甲基H 3K36或二甲基H 3 K79（均来自美国弗吉尼亚州夏洛茨维尔的Upstate）的抗体进行Western blot分析。