研究人员观察到，肿瘤细胞对治疗的反应取决于细胞是否是单层生长的 在体外 球体或 体内 本研究使用文献中关于用15-脱氧物单层治疗SK-N-SH神经母细胞瘤细胞的数据- 并将其与未经处理的SK-N-SH神经母细胞瘤细胞生长速率的数据结合起来。 为未经处理和处理的单层数据集构建了一个线性模型，该模型调整为单层病例的生长、死亡和细胞周期数据，用于控制和处理15-脱氧- 将单层模型扩展为五维非线性模型 在体外 包括细胞周期隔室的肿瘤球体生长和治疗( )以及静止( )和坏死的( )单元格。 15-脱氧的单层处理数据- 用于推导类似处理下球体响应的预测。 对于短期治疗，球体反应不如单层反应明显。 模拟结果表明，在实验室研究中观察到的单层培养物与球形培养物对治疗反应的差异是肿瘤球形生理学的自然结果，而不是对治疗的任何特殊抵抗。
1.简介 癌症治疗方法在单层上进行了彻底测试，以确定其有效性以及阻止细胞分裂或诱导凋亡的具体方式。 据了解，单层治疗的有效性不能预测等效的有效性 体内 然而，培养的肿瘤球体 在体外 被认为与处于血管生成前状态的小淋巴结肿瘤有点相似[ 1 ]. 这两种情况都在营养源附近有活跃的增殖细胞，离营养源较远的静止细胞，离养分较远的坏死细胞。 生长的球体 在体外 可能是小淋巴结肿瘤治疗反应的更好预测因子 在体外 单层。
作为乳腺癌节律治疗研究的一部分，Klement等人[ 2 ]发表了三个增加耐药细胞株处理浓度的例子，比较了单层培养和球形培养的效果。 他们的实验包括对耐药细胞株MD22、MVB9和CDDP-S4进行三种治疗，即阿霉素、长春花碱和顺铂。 他们的结果表明，对处理的反应存在明显差异，单层培养物的生长量随着三种处理浓度的增加而显著下降，而球形培养物的增长量则因相同浓度而显著下降。 作为这一现象的一个例子，当向MVB9单层施加足够的长春碱，以在24小时时将增殖细胞减少到未处理单层的20%左右时，在72小时后将相同浓度的长春碱应用于球体培养物，使球体减少到未经处理球体的80%左右。 这种模式也适用于其他细胞系[ 2 ]. 由于实验仅在几天后结束，目前尚不清楚继续治疗是否会完全杀死任何一种培养物。
本文的结果提出了一些可以通过仿真来解决的问题。 第一个问题是，Klement等人[ 2 ]将与其他细胞系和其他治疗重复。 特别是，该研究使用了已知对所应用的治疗有抵抗力的细胞系。 了解是否会对对特定治疗没有特别抵抗力的肿瘤细胞株产生类似的结果将很有用。 人们还应该问一问，这种对治疗的不同反应在多大程度上是肿瘤球体生理学的自然结果。 与单层细胞不同，球形细胞具有增殖、静止和坏死细胞的三部分结构[ 三 ]. 与单层不同，球体会自动停止生长[ 4 ]. 也许球体发育中固有的生理过程提供了对抗某些疗法的自然保护。 球体生长和治疗反应模型将允许 在二氧化硅中 这些实验回答了这些问题，并将成为血管生成前治疗反应的有用预测因子 体内 肿瘤结节。
肿瘤球体生长的自发停止被推测是由于营养物质无法渗透到球体的核心，随后球体发生坏死[ 4 ]. 然而，扩散的极限并不排除存在大球体，其外层由增殖细胞组成，足够薄，可以接受营养。 数值实验证实，仅营养物质的扩散不足以解释生长停止[ 5 , 6 ]. 此外 在体外 实验表明坏死的核心产生抑制增殖的肿瘤坏死因子[ 7 ]. 一种特殊因素，称为TNF- ，已被证明在活跃增殖的细胞中诱导凋亡[ 8 , 9 ]. 几个肿瘤球体模型将肿瘤坏死因子作为增殖细胞凋亡的来源，产生 在二氧化硅中 质量正确展开的球体[ 10 ]. 在这些模型中，球体的生长完全停止，而无需人工约束。 也就是说，由于肿瘤坏死因子在这些模型中的干扰，生长停止，并且当去除该因子时，生长不会停止。 此外，这些模型表现出一系列与定性观察一致的行为 在体外 球体[ 4 , 7 ].
为了理解模型模拟如何反映治疗，有必要根据特定细胞系和治疗的具体情况调整具有良好定性行为的通用模型。 本文考虑用15-脱氧物治疗SK-N-SH神经母细胞瘤细胞- Kim等人[ 11 ]进行一系列提高15-脱氧浓度的实验- 在单层上。 他们的结论是，这种治疗方法可以抑制 并在该阶段诱导细胞凋亡。 文中给出了未处理和处理细胞系的数据。 Carlsson等人给出了同一细胞系未经处理的球体的数据[ 1 ].
这两篇论文发表的数据[ 1 , 11 ]以及球体生长的一般模型[ 10 ]是开发更复杂的球体模型的基础，该模型结合了细胞周期动力学。 它保留了在球体中观察到的定性行为[ 4 , 7 ]，同时调整到中测量的细胞周期动力学[ 11 ]和球体生长动力学[ 1 ]. 然后将Kim等人的单层实验得出的治疗参数应用于球体生长模型，并将结果与单层的响应进行比较。
2.分析 这里开发的非线性动力学模型包括五个隔间， , , , 、和 前三个， , 、和 ，对应于细胞周期的各个阶段。 细胞周期导致包括四个同名量的方程， , , 、和 然而，文献中的数据倾向于结合以下测量值： 和 ，所以在模型中 和 组合成一个隔间， 为了反映球体的解剖结构，静止的细胞， ，是一个附加隔间。 死亡的坏死核心， ，必须包括在内，因为它是总球体尺寸测量的一部分，并且因为它通过TNF对增殖有影响- 隔间模型如图所示 1 .
2.1. 单层膜生长的调谐线性模型 单层细胞表现出指数增长，至少在短期内是如此，这种培养物的细胞周期由以下给出的常微分方程系统建模。
变化率 通过转换（加倍时）从 减去过渡到 以下为：
变化率 通过从 到 负过渡到 以下为：
变化率 通过从 到 负跃迁（加倍时） 减去一些死亡率：
将系统写入为 ，我们期待形式的解决方案
在这里 满足 ，其中 和 是文化的倍增时间。 数字 是限制中每个阶段的单元格比例。 由于单层实验中使用的培养物不同步，因此它或多或少也是运行开始时每个阶段的细胞比例。 平板实验通常表明对照（未经处理）培养物的死亡率，这使我们可以推断 或因凋亡而自然死亡。
方程式 得出三个线性方程，可以用实验导出的量来求解， ，给予 这些方程被调整为Kim等人的单层数据[ 11 ].
使用Routh-Hurwitz准则，我们确定当 否则将继续。 注意线性系统的特征方程为 ，其中 , 、和 Routh-Hurwitz准则指出，特征多项式的所有根都具有负实部当且仅当 、和 .后三个不等式立即得到满足，并且 当且仅当 。因此， 代表单分子膜消光和持久性之间的阈值。
2.1.1。 将控制（未处理）单层模型调整为数据 表 1 给出了根据神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH单层数据得出的常数。主要源文件中未给出加倍时间[ 11 ]并被视为文献中给出的几个值的平均值[ 1 , 12 – 16 ]. 平衡比例， 从Kim等人的对照组中提取细胞周期每个阶段的细胞[ 11 ]，稍作调整，使其总和达到100%。 正如同一研究报告所述， 被认为是 用于控制运行。
2.1.2. 单层上的建模处理 Kim等人描述的实验[ 11 ]包括15-脱氧治疗的数据- 在不同浓度下，应用于SK-N-SH细胞系。 作者得出结论，15-脱氧- 这两种行为都是为了逮捕 诱导细胞凋亡。 这些操作对应于参数的更改 和 在细胞周期模型中。 对这些参数进行了调整，以通过优化 , 、和 死亡率在合理范围内。 结果模拟数据见表 2 以及用于比较的报告测量数据。 对于低剂量，模拟与数据的匹配更好。 初始条件设置为总体积1，比例由 .
2.2. 一个包含细胞周期的球体模型 华莱士和郭[ 10 ]描述一类考虑增殖、静止和坏死细胞的球体生长模型。 根据一系列定性观察结果对这些模型的不同版本进行了测试[ 4 , 7 ]. 为了保留前面给出的细胞周期模型的特征，这些早期模型中的增殖室被替换为整个细胞周期，增殖室和其他室之间的简单过渡被替换为取决于营养物相对可用性或TNF存在的过渡- 。目标是在[ 10 ]包括细胞周期动力学，同时与球体生长的定性观察保持一致，并同时匹配来自[ 1 ]. 隔间图如图所示 1 .
进入静态的路径， ，假定由位于 舞台作为进入的替代品 .已观察到从静止到非静止的回归[ 17 ]，假定将单元格移动到 阶段。 坏死对增殖细胞的影响被认为是在分裂阶段通过凋亡发生的[ 8 , 9 ]. 这些假设如图所示 1 ，得出以下方程式。 所有单位均为体积，10 6 μ 米 三 .
变化率 通过转换（加倍时）从 ，带分数 TNF导致细胞凋亡- 和分数 套房 ，减去转换 带分数 套房 和 套房 以下为：
变化率 由以下转换给出 和 ，减去转换 进入之内 以下为：
变化率 由以下转换给出 ，减去的转换 带分数 TNF导致的细胞凋亡- ，分数 套房 以及自然或治疗引起的死亡率 以下为：
变化率 通过从 带分数 套房 ，减去的转换 要么返回 或者死后进入 以下为：
变化率 由细胞死亡引起 ，减去材料的溶解 以下为：
什么时候？ 和 ，这些方程与细胞周期的方程相同，产生大量增殖细胞，并呈指数增长。 对于球体的新情况， 和 被视为描述过渡过程对养分可用性的依赖性的函数，在以下情况下 或坏死量，如果 .参数 取决于营养素的可用性 被非静止隔间的吸收所阻挡 , 、和 。为了方便起见，添加了一个新变量， ，描述了模型中所有隔间的总和，以及第二个变量， ，描述了活的非静态细胞( ). 治疗导致额外的细胞凋亡， ，假设发生在从 到 如线性模型中所示。
通过 到 在线性模型中由常数控制 ，在扩展模型中，它被视为这些隔间之间的最大传输速率 单元格被发送到 隔间。 功能 因此必须介于0和1之间。 假设营养素（包括氧气）以球形边界进入细胞，因此对于固定量的 函数 应增加到1或减少到0，表面积与 随着增殖细胞的比例相对于表面积的增加， 应降至零，将更多单元格分配给 隔间。 下面给出了一类具有这种行为的函数
当营养素不再被非静止细胞阻挡时，某些细胞会从静止状态恢复到增殖状态， 。关于这一过程的可用数据很少，尽管已经观察到缺氧条件缓解时会发生这种情况[ 17 ]. 在这里，该过程由以下函数建模 表面积与 ，假设最大速率为 当表面积与 当表面积比 .
下面给出了一类具有这种行为的函数
两种功能 和 具有这样的性质：当整体球体大小为零时，它们会变为零。 这在生物学上是不合理的行为，因为没有一个细胞会在非常小的球体大小时变得静止。 生物学上更合理的函数将由 ，但在较小的值上可能会出现数值困难。 函数的给定公式 和 适用于大于1的球体。 由于该模型是为10阶球体设计的 6 μ 米 三 很容易避免接近零的影响 和 .两者 和 已设置为 .
最后 繁殖或死亡的阶段取决于TNF的存在- [ 8 , 9 ]假定其与坏死组织的数量成比例， 。假设细胞凋亡发生的最大速率小于固有速率 细胞周期的这一阶段。 描述此选择的一类函数如下所示
这些方程根据Carlsson等人的球体培养数据进行了调整[ 1 ]，同时固定从单层数据导出的常数。
2.2.1. 将控制（未处理）球体培养模型调整为数据 细胞周期参数 , , 、和 与表中所述的控制单层数据保持相同 1 球体直径随时间的变化在Carlsson等人[ 1 ]. 表 三 给出了从该表中读取的估计值。 根据表中的直径数据计算球体体积 三 ，在表中报告 4 虽然本文没有给出细胞周期数据，但它确实报告了40-50小时的单层倍增时间，与表中使用的平均值一致 1 在实验的最后一天，通过光学显微镜记录活细胞边缘的厚度。 对20多个球体进行了测试，很明显，这个数字变化很大。 表 4 给出了根据表中的数据计算出的活隔室和坏死隔室的体积 三 .
从数据中识别最困难的两个参数是 和 描述了增殖细胞和静止细胞对营养物质存在的功能反应。 虽然它在球体生理学中起着重要作用，但静止的隔室， 如果没有明确的细胞周期数据，很难进行测量。 该模型调整的研究中未对其进行测量。 一个更简单的假设是，功能响应是按正比给出的 相反，可以任意选择 给出了几乎是直接比例的函数响应，同时避免了分母变小时可能出现的任何数值困难。 这个选择是在一些实验之后做出的，并且仍然与数据进行了适当的匹配。
还有四个参数有待确定。 其中两个( )控制活隔室与死隔室的相对大小。 求和( 6 )通过( 10 )平衡时产生关系
数值探索表明，该方程中出现的两个参数， 和 ，确实对 和 为了在平衡状态下有正数量的增殖细胞， 必须大于 。实验上，球体的最大体积约为 。从大约两倍的值开始， 和 按优先顺序进行了调整，以在 （29天）接近36个，活细胞和死细胞体积在报告范围内。
保留两个参数， 和 ，描述从 到 和来自 到 分别是。 作为 这些参数的影响在总体增长模式中是严格可见的。 增殖室中的更多细胞将产生更快的生长。 为了进行拟合，对总体积随时间的增长数据使用了MATLAB最佳拟合程序。 表中报告了拟合参数 4 .
除了匹配数据外，还将模型的总体长期行为与定性观察结果进行了比较，发现模型表现良好。 所有数据匹配和治疗模拟的初始条件由中第一个数据点的体积设置[ 1 ]假设所有细胞都在增殖室( )，按下面给出的比率分布 .
2.2.2. 球体处理的模拟 对于未经处理的SK-N-SH球体模型的所有参数，只需更改与15-脱氧处理相对应的参数- .所涉及的参数， 和 ，根据表中的导出值进行设置 2 线性单层模型运行24小时，而球体模型运行72小时，以观察更大的效果。 Klement等人的研究[ 2 ]单层培养物和球形培养物的反应有显著差异。 这种反应是通过甲基-3H-胸腺嘧啶掺入试验来测量的，该试验标记了 细胞周期的阶段[ 18 ]. 这种测量有时被认为是增殖室的代表。 图 6 显示了15-脱氧的相对影响大小- Kim等人研究的浓度[ 11 ].
2.2.3. 球面模型的分岔分析 为了确定处理强度对球体体积和球体持久性的影响，我们对球体模型进行了分岔分析。 特别是，我们通过数值计算（使用MATLAB函数“lsqnonlin”），将处于平衡状态的增殖、静止和坏死细胞的体积作为 ，比率 凋亡，供选择 对应于五种处理强度， 和 .
3.结果 3.1. 单层模型 快速生长的肿瘤单层显示出特征性的倍增时间、死亡率和细胞周期比例，足以完全确定线性模型，从而得出所有参数的简单代数表达式。 处理过的单层膜的数据是另一回事。 在这里研究的例子中，有两个参数， 和 对应于研究人员对15-脱氧作用的最佳理解- 在SK-N-SH细胞系上进行改变，以匹配2、4、8和12的处理强度 μ M浓度，如图所示 2 .对于低浓度（2和4）获得了良好的拟合 μ M） ●●●●。 8点 μ m、 死亡率与细胞周期比例的精确性有所牺牲相匹配。 12点 μ M模型产生的细胞周期比例与数据不匹配，如图所示 三 2、4和8的均方误差 μ M次治疗共3.5个百分点。 所有治疗的MSE为18个百分点。 这表明，在高浓度下，除了 到 过渡。
3.2. 球体模型 可以将单层生长中细胞周期的线性模型扩展为球体生长的非线性模型，如图所示 1 非线性包括在增殖细胞向静止细胞的转化率和TNF的作用中- 诱导细胞凋亡 阶段。 该模型中的所有转化率都受单层细胞周期数据确定的转化率的限制，但从静止到增殖的转化率除外，这一点没有测量。 模型被调整到特定的细胞系和治疗，给出了如图所示的生长曲线 4 该模型产生一个停止生长的球体，有一个坏死的核心，其增殖室仍然活着； 文献中报道了定性观察结果[ 4 , 7 ]. 调整后的模型很好地拟合了初始和最终数据，但低估了中间测量值，如图所示 5 .
3.3. 球体与单层的处理 构建这些模型的目的是模拟单层培养物和球形培养物对处理的不同反应。 图 6 说明了这种效果。 15-脱氧浓度增加的模拟- 在SK-N-SH球体上产生的影响明显小于单层，即使球体处理72小时而不是24小时。 在这个特定的例子中，单分子膜在2和4微摩尔浓度下仍在增长，但速度大大降低。 8点 μ M、 单层膜的菌落尺寸减小。 相比之下，对于球体，总体积是有限的，并且通过所有处理都会减少。 然而，效果大小很小。 即使总体积减小，球体仍可能存在。 图 7 显示了球体模型的数值计算分岔分析，其中垂直线标记了单层模型中的临界值。 该图表明，较低的处理强度可能足以大幅减小球体的尺寸，而不是单层。 然而，短期治疗（2-3天）的效果可能在球体中产生不太显著的反应，如图 6 .图 8 对于单层模型临界值附近的参数，显示了长期持续的处理效果。 尽管使用这些参数进行治疗在生物学上可能不可行 8 强调了长期动态的差异。
4.讨论 单层模型在处理条件下的行为与[ 11 ]这种治疗阻止了 到 过渡（减少 )并诱导细胞凋亡（增加 ). 随着治疗强度的增加，这两个拟合参数都朝着预期的方向移动。 高强度（12 μ M浓度）模型与细胞周期分析数据的匹配性不好，这表明在这种强度下，细胞周期的其他转变可能也受到影响。 因此，单层模型有助于指出数据和结论之间可能存在的不一致[ 11 ]在较高的治疗强度下。
用线性模型拟合单层细胞的细胞周期信息可以进行统计学处理。 在( 5 )我们给出了计算此类模型参数的代数表达式。 考虑到非同步培养的加倍时间、死亡率和细胞周期分析，这些方程产生了线性模型所需的其余参数。
图 6 是模仿克莱门特等人（Klement et al[ 2 ]，其中对细胞系（MD22、MVB9和CDDP-S）和治疗（分别为阿霉素、长春碱和顺铂）的三种选择进行了单层和球体培养物之间的治疗比较。 本文中示例的可用数据比较粗糙，但总体效果是相同的。 随着处理强度的增加，球体显示出单层所没有的弹性。 这种韧性并不是由于进化出的耐药菌株造成的，这些菌株既没有出现在单层实验中，也没有内置在模拟中，而是由于模型所代表的肿瘤球体的整体解剖和生理学。 这里的模拟表明，人们应该预期非耐药菌株和耐药菌株对治疗强度的反应会相似地降低。
我们的结果给出了一个不仅具有正确的定性增长行为的椭球模型[ 4 ]不仅匹配控制的定量增长数据[ 1 ]而且与单层实验相比，对治疗的反应定性正确[ 2 , 11 ]是判断模型定性准确性的重要新基准。 这里给出的结果是构建一个包含基本特性的隔间模型的重要步骤 体内 肿瘤生长。 与空间模型相比，此类常微分方程系统非常简单，但其优点是可以在未来的工作中充分利用分析和控制理论方法的力量。
模型能够近似球体随时间的增长，同时包括细胞周期动力学，这对于希望预测血管前肿瘤特定治疗作用结果的实验者来说应该是有用的。 它作为预测器的实用性符合McGuire等人提出的工作流模型[ 19 ]. 特别是，它可以帮助研究人员为 体内 实验。 图 6 指出，对于本文给出的示例，实验者可能难以区分2、4和8之间的效果差异 μ M浓度。 很容易看出，更广泛的数据集，即使是单层治疗，也可以与该模型结合，以更深入地了解治疗强度可能产生显著反应。
图 8 表明 对球体模型的长期动力学有很大影响。 接近单层临界值，降低 对最终肿瘤大小的影响比增加更大 此数学结果突出了阻止 到 将过渡作为治疗目标。 它表明，一种毒性较低的治疗方法可以阻止这种转变，但不一定会杀死细胞，并且持续时间更长，这可能是一种有用的治疗工具。 像这里介绍的模型应该是节律疗法对话的一部分，因为它们确定了低水平干预的可能性，持续足够长的时间，可能会产生治疗效果。
一个精确的增长模型 在体外 球体及其对处理的响应是构建的重要步骤 在二氧化硅中 的表示 体内 肿瘤生长。 这里给出的示例显示了模型的能力，它能够同时适应球体生长和治疗反应的定性和定量观察，深入了解特定治疗的机制，并建议未来治疗的策略。
竞争性利益 作者声明，他们没有相互竞争的利益。
致谢 作者感谢达特茅斯学院对本科生实习生的慷慨支持。
