2.1. 冷冻水化样品的制备，并用低温电子显微镜和激光显微镜进行预检查

我们修改了冷冻电镜中广泛采用的样品制备方案（图2一; Takayama&Nakasako，2012年; Inui Takayama公司等。, 2015). 对于样品支持，我们准备了一个～20 纳米厚的碳膜粘附在定制的金属圆盘上，带有多个测量窗口（Nakasako等。, 2013)或100 nm厚的氮化硅膜（加拿大Norcada），具有碳沉积。膜表面用0.1%处理(w个/v（v）)聚赖氨酸溶液（Sigma–Aldrich，USA），增加表面对生物样品的亲和力（Takayama，Inui等。, 2015). 然后，我们使用定制的湿度控制装置和光学显微镜（图2b条; Takayama&Nakasako，2012年). 大约2个 在受控条件下，将µl浓缩样品悬浮液直接涂在支撑膜上相对湿度（相对湿度）为～100%。几分钟后，在监测剩余溶液量的同时，吸干多余的溶液数字密度样品颗粒数量等.范围。将样品支撑盘转移到冷冻装置中，同时保持相对湿度高于90%，并将其插入液态乙烷中快速冷冻。

图2 冷冻水化生物样品的制备。(一)样品支撑盘的预处理程序和受控相对湿度下冷冻水化生物样品的制备程序(b条)样品制备室安装在光学显微镜的样品台上。样品容器可以从湿度室中分离出来，并连接到冷冻装置上，同时保持湿度（Takayama&Nakasako，2012). (c（c）)一个冷冻水化叶绿体样品的LM观察C.梅罗莱，取样温度为82 K、如§2所示，在~100%RH下将样品冷冻在氮化硅膜上和面板(一). 条形代表50 微米。

用冷冻电镜和/或冷冻液显微镜检查冷冻样品。我们使用了一台JEM-2100电子显微镜（日本JEOL），其加速电压为200 kV，带626低温样品架（美国Gatan公司）和BX51光学显微镜（日本奥林巴斯），带CLM77K低温样品台（美国Instec公司）。如果数字密度目标物体的厚度和冰的厚度似乎合适，多个样品以相同的方式冷冻。湿度控制装置使程序具有高度可重复性。将样品储存在液氮中，直到冷冻XFEL CDI实验。必要时，冷冻电镜和冷冻电镜检查的样品也可以通过保持低温来回收。用于样品制备的设备安装在SACLA实验大厅旁边的生物样品室中。因此，即使在有限的波束时间内，也可以快速使用实验结果反馈给下一个样品制备。

2.2. SACLA的Cryo-XFEL-CDI实验

在SACLA BL3（Tono等。, 2013)自2012年3月起。实验装置如图1所示我们使用了KOTOBUKI-1衍射仪（Nakasako等。, 2013; 奥罗古奇等。, 2015)至2014年7月，自2015年3月起为TAKASAGO-6。在两个衍射仪的真空室内，一个低温罐被放置在一个电动平移台上。锅中充满液氮并冷却至～66 K带蒸发冷却。转移到罐中的冷冻样品支撑盘可以保持在～66 X射线照射期间通过热接触K。

其中一个衍射仪安装在Kirkpatrick–Baez聚焦镜光学系统（Yumoto等。, 2012)，样品位置设置在镜子的焦点处。镜子将X射线束聚焦至～1.5×1.5 在半最大强度下为µm（～2.0×2.0 µm（半最大振幅）和5.5的单脉冲 keV X射线提供～10¹⁰–10¹¹光子到焦点（Oroguchi等。, 2015). 放置一对L形硅狭缝10 样品位置上游的mm可以将光束线光学元件的几乎所有寄生散射消除到500–600的分辨率 纳米（Oroguchi等。, 2015). 多端口CCD（MPCCD）八进制和双检测器（Kameshima等。, 2014)串联布置（图1)以大约7–200的分辨率记录衍射图案 纳米和80–550 nm。2×2挡梁 5个可变厚度（15–100）的mm和铝制衰减器 µm）插入双检测器前面。为了获得具有最佳S/N比的衍射图案，我们将八角探测器的中心开口从9调整到3.5 mm，并更改了衰减器以避免像素饱和。

XFEL脉冲会损坏辐照中心周围的样品。受损区域至少延伸至15 微米（Nakasako等。, 2013; 平田等。, 2014). 因此，我们以25–50的步长对样品支撑盘进行光栅扫描 µm，为每次暴露提供新鲜区域。扫描方案可以在的GUI窗口中编辑艾登然后提交给样品台的控制器，以同步样品台的移动和XFEL脉冲的曝光（Sekiguchi，Yamamoto等。, 2014).

2.3. 数据处理

每次光栅扫描后，衍射数据集由G-SITENNO公司套房（Sekiguchi，Oroguchi等。, 2014; 山本胜口等。, 2014)安装在SACLA（Joti）的HPC集群系统上等。, 2015). 软件套件会自动减去暗电流从衍射图案中提取检测器，合并八角和双检测器上记录的图案对，并将具有给定信号水平的图案识别为来自大量图案的“击中”图案（Sekiguchi、Oroguchi等。, 2014). 然后，它使用混合输入输出计算所有命中模式的初步图像重建（Fienup，1982）)和收缩包装（马切西尼等。, 2003)（HIO–SW）算法。

G-SITENNO公司还提供衍射数据集的统计数据和初步重建的图形摘要（Sekiguchi，Yamamoto等。, 2014). 根据这些信息，我们可以在单光束时间会话期间调整下一次衍射测量和/或样品制备的条件。

2.4. 结构分析

在SACLA的HPC系统上，从衍射图案重建投影的电子密度图。为了提高S/N比，首先对衍射图案进行2×2装仓，使二维OS比保持在~6或更高（表1). 当OS比率高于5时，数据装箱不会影响重建的质量（Miao等。, 2003). PR计算需要定义“支持”，它应该大致包含目标对象。作为对支持度的初始估计，我们通常使用样本自相关的松散包络（Marchesini等。, 2003)通过计算帕特森地图，这是衍射图案的傅里叶变换。最初的支持还来自叶绿体的低温电子显微镜观察或Patterson-search定相方法（Takayama，Maki-Yonekura等。, 2015)用于含有胶体金颗粒的样品。然后，从随机密度和支持度出发，我们进行了数百到数千次独立的HIO–SW PR计算，以生成目标物体的初始重建。主成分分析（PCA；Sekiguchi等。, 2016)用于选择最可能的初始重建组。对最能代表该组的前100个重建进行平均，并用于改进支持。当从Patterson-search阶段确定的支持开始时，PR计算收敛到一个定义良好的解决方案，并且这种情况不需要像以前报告的那样进行PCA（Takayama、Maki-Yonekura等。, 2015).

表1 衍射图案统计和PR计算 衍射图案上Friedel mate的相关性计算如下：C类sym（对称）= (E类-O（运行）)/(E类+O（运行）),,哪里我0(x个,年)和我sym（对称）( -x个, -年)分别用100×100像素及其Friedel mate表示感兴趣区域的衍射强度。当衍射图案显示出理想的弗里德尔对称性时C类sym（对称）值变为1（Sekiguchi、Oroguchi等。, 2014). 最大分辨率定义为最高分辨率外壳，包括至少两个探测器像素和四个或更多光子（Sekiguchi，Yamamoto等。, 2014). 重建地图的OS比定义为衍射图案中的像素数与支持地图的像素数之比，它对应于数据的冗余（Miao等。, 2003). R（右）F类定义为，其中和是观测到的结构振幅和根据平均电子密度图计算出的振幅。K（K）是两个振幅之间的比例因子（Miao等。, 2006). 平均电子密度图的有效分辨率定义为PRTF降至0.5以下的分辨率（查普曼等。, 2006). 计算仅包括具有四个或更多光子的像素。 图中的衍射图案。 三(一) 三(b条) 三(c（c）) 4(b条) 5(b条) 6(b条) 6(e（电子）) 7(一) 7(b条) C类sym（对称） 0.75 † 0.79 0.91 † 0.91 0.97 0.90 0.91 最大分辨率 21.8 46.2 10.2 17.5‡ 42.5‡ 26.3 14.9 8.4‡ 7.7‡                     图中重建的地图。       4(c（c）) 5(c（c）)     7(e（电子）) 7(（f）) OS比率       5.8 18.9     43.5 38.5 R（右）F类       0.27 0.23     0.32 0.31 有效分辨率（nm）       192.2 51.6     28.5 23.1 †我们无法分配足够的面积来计算C类sym（对称）图3中衍射图案的值(b条)和5(b条)因为图案显示出低衍射信号。 †结构分析衍射图案的最大分辨率是在2×2装仓后计算的（见§2).

通过使用过采样平滑（OSS）算法（Rodriguez），我们再次使用精细支持度和随机密度重复了数百到数千个独立的PR计算等。, 2013). 我们通过主成分分析平均100个最可靠的重建结果，采用了最终投影的电子密度图。投影图的有效分辨率被认为是相位恢复传递函数（PRTF；Chapman等。, 2006)地图上的数字降到了0.5以下。

3.1. 有效收集生物样品最佳衍射信号的样品制备

数据收集效率每个样本的支撑盘在很大程度上取决于数字密度目标对象，但孤立对象更适合PR计算。因此，理想的情况是数字密度支撑膜上的单分散颗粒。然而，由于膜和样品之间的亲和力低，生物样品在吸走多余溶液时往往会聚集。我们发现，经过多聚赖氨酸处理的碳膜在生产合适的样品方面非常有效（Takayama，Inui等。, 2015). 通过调整红藻叶绿体的浓度氰化汞，我们制备了冷冻水合样品，如图2所示(c（c）). 这里大约有2-5个 每个（10×10）的叶绿体 µm），这是低温-XFEL-CDI的合适浓度。这个数字密度只有用聚赖氨酸处理过的膜才能重现。

低温XFEL-CDI获得的衍射图样受到入射光束强度、样品物体相对于光束中心的相对位置以及总散射等因素的强烈影响横截面梁内样品的数量。此外，样品制备过程中的湿度和周围冰的厚度对于从生物样品中获得最佳衍射信号也至关重要（图3). 在100%RH条件下制备的叶绿体样品嵌入薄玻璃冰中，可获得良好的衍射信号（图3一; 另见表1统计数据）。该图案由~5×5像素的斑点组成，与尺寸为~1.5的单个氯塑料有关 微米。该模式的特征可能反映了叶绿体的内部结构。相反，从低于90%RH制备的样品中获得的衍射图显示出弱得多的信号（图3b条和表1)表明较细的叶绿体结构在较低湿度下被破坏。嵌入较厚冰层中的样品也产生了强衍射图样，扩展到更宽的衍射角（图3c（c）和表1). 然而，该图案显示出较少的特征和更小的斑点，很可能反映出一个冰块。生物物体发出的信号在这里用处不大，因为它们比厚冰发出的信号弱。

图3 冷冻水化叶绿体样品的衍射图案。衍射数据来自于在~100%RH下冷冻在薄玻璃冰中的叶绿体(一)，低于90%相对湿度(b条)嵌入较厚的冰中(c（c）). 从左至右列的数字分别对应于代表性的衍射图案，这些衍射图案显示出更高的信号、从以相同方式冻结的样品中收集的衍射数据集的总强度直方图以及最高分辨率的直方图。参见表1的脚注用于定义最大分辨率。箭头输入(一)指来自叶绿体的特征信号。直方图中的箭头表示左栏中相应衍射图案的强度和最大分辨率。总强度表示MPCCD八进制探测器上中心512×512探测器像素内的原始衍射强度之和，该区域不包括双探测器上缺失的中心部分。直方图是根据六个样本支撑盘的3135个XFEL快照计算得出的(一)，两张光盘167张(b条)三张光盘167张(c（c）). 在样品制备过程中，通过LM监测大致估计了冰的厚度。所有衍射图案的色标相同，显示在(一).

如上所述，生物样品的低温XFEL-CDI高度依赖于合适的样品。因此，使用低温电子显微镜和/或激光显微镜对样品进行预先检查，对于有效收集最佳衍射信号非常有帮助。根据图2所示的样品种类(c（c）)，超过65%的XFEL放炮产生的衍射信号的分辨率高于70 纳米。一个约1-2的生物物体 µm通常衍射X射线，分辨率为40–45 nm（图3一)，但我们有时观察到衍射信号的分辨率超过20 nm距离可能位于光束中心附近的生物物体（Inui Takayama等。, 2015).

3.2. 冷冻水合生物样品的结构分析

在这里，我们描述了冷冻XFEL CDI在两个生物样品中的应用：从甜瓜梭菌和由大肠杆菌菌株ME8077（Adler等。, 1967). EM和LM的互补使用在这些应用中也非常有用，如下所示。

我们首先采用了相关的LM和EM方法（CLEM；de Boer等。, 2015)用于叶绿体样本。冷冻水化的叶绿体在低温-LM下呈绿色，表明存在叶绿素（图4一). 同一叶绿体具有近乎完美的圆形，尺寸为～1.7 µm，在更高放大倍率下低温电子显微镜下（图4b条). 图4(c（c）)图2显示了从冻结的水化叶绿体样品中用一次XFEL拍摄获得的代表性衍射图案(c（c）). 表1总结了该模式的统计数据.图案的斑点大小为～5×5 像素，这与根据图4中的尺寸估计的叶绿体大小一致(b条). 由于叶绿体的尺寸大约是图案小角度分辨率的三倍（参见§2)，模式中没有记录光束中心附近的许多斑点。然而，我们成功地重建了叶绿体的投影电子密度图（图4d日)有效分辨率为192的衍射图样 nm（表1). 这一重建从一个圆形支架开始，其直径与cryo-EM观察到的直径相同（图4b条). 相反，当从样本的自相关包络线开始时，PR计算失败（参见§2)或直径比低温电子显微镜观察结果大1.2倍的圆形支架。这表明可靠的初始支撑非常重要，尤其是对于较大的物体。该图清楚地分辨出两个投影电子密度高的区域。这一特征与之前通过荧光LM和低温XFEL-CDI（Inui Takayama等。, 2015)并且可能代表一堆折叠的类囊体膜层，其中包含许多光合蛋白复合物和叶绿素（French，1971). 重建的图谱是样品的投影电子密度与高斯型光束振幅的乘积。这导致远离光束中心的密度逐渐降低，但即使物体尺寸略小于或相当于～2.0的光束宽度，也不会严重影响重建的外观 在半最大振幅下为µm。

图4 从中分离的叶绿体的结构分析C.梅罗莱.灯光(一)和电子(b条)从中分离出的冷冻水化叶绿体的显微照片C.梅罗莱在低温条件下观察。将样品冷冻在多孔碳膜上（Quantifoil Micro Tools GmbH，德国），如§2所示和图2(一). 81岁时拍摄了显微照片 K（LM）和97 K（EM）。(c（c）)冷冻水化叶绿体的衍射图案。图案为2×2装箱。(d日)根据衍射图案重建的叶绿体投影电子密度图(c（c）). 这是由HIO–SW PR获得的，但OSS PR在(c（c）)（见§2). 条形代表5 微米(一), 1 微米(b条)和500 纳米(d日). 色标显示在中的面板顶部(c（c）)和(d日).

A典型大肠杆菌微型细胞具有直径为～800的圆形细胞体 nm和一个直径为30的鞭毛 nm（图5一). 一些细胞在生长过程中失去鞭毛。冷冻水化微型细胞的单次衍射图显示同心环，反映了圆形细胞体（图5b条和表1). 微型电池的投影电子密度图（图5c（c）)以52的有效分辨率从衍射图样中成功重建 nm（图5b条)通过使用传统的PR协议，从自相关包络开始。该图解析了可能代表细胞成分分布的不均匀密度，这是通过化学固定和薄切片的EM观察报告的（Dennis&Rogerson，1975). 同样，无需这些处理，低温XFEL-CDI可以研究完整的细胞。图中还显示了一个鞭毛状结构从细胞体中伸出（图5c（c）). 单个鞭毛的尺寸与此分辨率下瑞利准则的可分辨尺寸一致。该结构由省略差分傅里叶图确认（Drenth，2007)通过掩盖重建图中的鞭毛样密度，在观测和计算振幅与计算相位之间（图5d日). 我们还发现，当从不包括鞭毛样密度的支撑物开始计算时，PR计算导致融合重建较少。为了确认该结构是否代表鞭毛，我们需要以更高的分辨率解析特征螺旋结构（Yonekura等。, 2003). 我们现在正试图通过使用强散射体成像（见下文）来扩展分辨率，以更清楚地解析鞭毛和其他细胞成分。

图5 结构分析大肠杆菌微型电池。(一)微型电池的电子显微照片(大肠杆菌菌株ME8077）用磷钨酸负染。箭头表示鞭毛从细胞中伸出。(b条)冷冻水化微电池的衍射图案。图案为2×2装箱。(c（c）)根据所示衍射图案重建的微型电池投影电子密度图(b条). 箭头表示类似鞭毛的密度。(d日)通过掩蔽重建图中的鞭毛状密度，将观察到的和计算出的结构振幅与计算出的相位之间的差值傅里叶图省略。省略差分傅里叶图理论上给出了省略结构的密度为原始结构重量的一半（Drenth，2007). 条形代表500 纳米。色标显示在中的面板顶部(b条)–(d日).

3.3. 较弱散射体衍射信号的增强

如上所示，通过当前的XFEL-CDI实验，生物样品可获得的空间分辨率由于其较差的散射能力而被限制在几十纳米。我们提出了一种通过将生物物体与胶体金（CG）颗粒一起成像来扩展空间分辨率的方法（Takayama，Maki Yonekura等。, 2015). 生物物体发出的微弱信号可以通过与来自CG的强衍射波的干扰增强到可检测的水平（Shintake，2008, 2010; Oroguchi&Nakasako，2013年; 基姆等。, 2014; 高山真纪元等。, 2015). 我们可以从Patterson-search方法确定的CG位置导出可靠的初始相位，如X射线晶体学（Jacobson&Beckman，1979）; 谢尔德里克，1997年).

在这里，我们演示了厚度为100的多孔氮化硅膜衍射信号的增强 nm（加拿大诺卡达），通过在其上分散CG颗粒（图6一). 图6(b条)和6(c（c）)显示具有良好信号的衍射图案，以及仅膜衍射图案的统计信息。A类帕特森地图根据此衍射图案计算（图6b条)露出一个直径为3.6的环 µm，代表直径为~1.8的孔 µm（图6d日). 多孔膜的衍射信号被检测到分辨率为26 nm或更低（图6b条和表1). 相反，来自～80的衍射信号 多孔膜上的nm CG颗粒（英国BBI Solutions公司）使空间频率宽度加倍（图6e（电子）和6（f）). 增强模式（图6e（电子）)清晰地分辨出膜上孔的同心环特征，直到衍射图案的边缘，证明孔信号的分辨率提高了两倍或更多。由于增强信号的方向反映了金颗粒相对于孔的相对位置，衍射图案（图6e（电子）)应源自与图6中类似的字段(一). 干涉条纹产生一对全息图像，代表帕特森地图（图6克). The intensity of the帕特森地图由于CG粒子的高投影电子密度，被放大了大约十倍（Als-Nielsen&McMorrow，2011).

图6 通过干扰CG粒子的信号增强多孔氮化硅膜的衍射信号。(一)多孔氮化硅膜上CG粒子簇的电子显微照片。(b条)(e（电子）)仅多孔膜的衍射图案(b条)和多孔膜上的CG颗粒(e（电子）). 中的插图(b条)对应于内部中心衍射图案的放大视图 微米−1显示了孔的同心环特征。箭头在(e（电子）)指示延伸至图案边缘的特征干涉条纹。(c（c）)(（f）)衍射强度直方图和仅多孔膜图案的最大分辨率直方图(c（c）)多孔膜上的CG颗粒(（f）). 从578收集(c（c）)和788个XFEL快照(（f）). 直方图中的箭头(c（c）)和(（f）)指示相应衍射图案的强度和最大分辨率(b条)和(e（电子）)分别是。另请参见图3的标题用于直方图。(d日)(克)根据(b条)和(e（电子）)分别是。为了最大限度地减少光束中心附近缺失数据的影响，将1−高斯高通滤波器与衍射图案相乘（Chapman等。，2006年). 与孔的自相关揭示了帕特森地图(d日). 孔和CG粒子的投影密度的交叉相关或卷积产生一对孔的全息图像（箭头）。酒吧(一)代表500 纳米。中的色阶(b条)和(e（电子）)相同，显示在的左侧(e（电子）). 请注意(克)是中的三倍(d日)由于CG粒子的高投影电子密度。

我们现在正在改进CG粒子成像生物目标的样品制备和初始相位算法。如前所示（Takayama，Maki-Yonekura等。, 2015)生物靶标和CG粒子的密度和排列对该方法至关重要。同样，湿度控制样品制备装置和低温电子显微镜观察有助于重复制备合适的样品（参见Takayama，Maki-Yonekura的补充图3等。, 2015).

3.4. 分布式CG粒子实验衍射图案的Patterson-search定相演示

当从包含多个分布式物体的场中获得衍射图案时，如上述信号增强示例中所述，由于OS比较小以及衍射图案中心周围缺乏信息，传统的PR计算通常会失败（Miao等。, 2003; 小林寺等。, 2014). 图7(一)和7(b条)显示～250的衍射图案 nm CG颗粒（英国BBI Solutions）。～6×7和～8×12像素的散斑大小对应于～1.2×1.0的有效样本大小 µm和～1.2×0.7 µm，而尺寸大于~520–610的结构信息 纳米，即CG粒子的排列由于中心光束停止而丢失。从样本的自相关包络开始的常规PR重建中，只有15.2%和2.4%收敛到合理的投影电子密度图（表2).

表2 通过Patterson-search阶段化实现HIO–SW PR的融合 根据重建CG颗粒的大小、形状和排列判断重建是否成功。尽管SW截止值不同，以增加PR收敛到正确解决方案的速度，但在SW过程中，失败的重建显示出无法解释的特征或丢失了几个CG粒子。 图中的衍射图案。 7(一) 7(b条) 独立重建数量 500 165 成功重建次数      常规 76 4  模式搜索阶段 414 155 R（右）F类通过Patterson-search阶段化成功重建 0.295–0.347 0.294–0.345 Patterson-search阶段化改进 5.4倍 38.8次

图7 用Patterson-search相位法从分布CG粒子的实验衍射图案重建图像。(一)(b条)CG粒子的衍射图案。图案为2×2装箱。(c（c）)A削尖了帕特森地图根据中所示的衍射图案计算(一). CG粒子的多面体性质在交叉峰周围产生“条纹”。(d日)由锐化函数导出的叠加最小函数图帕特森地图英寸(c（c）)五次迭代后（参见Takayama，Maki-Yonekura的方法等。, 2015). 在图中，在CG粒子的位置可以找到正确的峰值，但在(c（c）)也会出现在正确的峰值周围。通过忽略过于接近强峰的弱峰（接近CG平均直径的1.5倍），我们将用黄色虚线表示的圆形支撑指定到峰值位置上作为初始支撑。圆圈的直径设置为CG颗粒平均直径的1.5倍。(e（电子）)(（f）)投影电子密度图(e（电子）)和(（f）)根据衍射图案重建(一)和(b条)分别使用Patterson-search定相方法。整个过程是半自动化的，如Takayama，Maki-Yonekura所述等。(2015). 条形图代表500 纳米。同一行中的面板中的色标是相同的，并显示在每行的左侧。

然后我们应用了Patterson-search定相方法（Takayama，Maki-Yonekura等。, 2015)这些模式（图7一和7b条)并成功解决了锐化的Patterson地图（图7c（c）). 从分配到CG颗粒位置的松散圆形支架开始（图7d日; 另请参见图7的标题)通过HIO–SW计算成功重建的数量显著提高了5倍和39倍（表2). 进一步之后精细化通过使用OSS（参见§2)，我们以28.5的有效分辨率重建了CG粒子的投影电子密度图 nm和23.1 nm（图7e（电子）, 7（f）和表1). 由于之前报告的可靠初始阶段，OSS计算的收敛性也很显著（Takayama，Maki-Yonekura等。, 2015). 图7中的重构清晰地解析了密度较低的CG粒子(e（电子）)可能偏离光束中心的粒子。相比之下，传统PR倾向于在SW过程中去除该颗粒。此外，我们的协议甚至从指定到CG位置的圆形支撑开始，重建出棒状和三角形的CG粒子。这些结果表明了我们使用Patterson-search阶段化的方法的鲁棒性和通用性。