2.1. 样品制备

由于尺寸较小，很难对适用于MicroED的纳米晶进行初步鉴定。而手性晶体的二阶非线性光学成像（SONICC）（基西克等。, 2011)可以提供一种自动和客观的方法来识别小晶体，到目前为止，我们一直依赖于视觉判断例如水滴浑浊，然后是阴性染色电子显微镜。当找到合适的晶体时，大约4 将溶液中的µl微晶分配到已在辉光放电装置中清洁的多孔碳或连续碳格栅上。晶体可以沉淀30 s，用滤纸吸干，从格栅中去除多余溶液。需要去除足够的溶液，以最小化背景贡献，并允许电子束在随后的曝光过程中穿透样品；然而，过多的吸墨剂会使晶体脱水并损坏晶体。因为很难在太厚的样品和被过度吸墨剂损坏的样品之间取得适当的平衡，所以准备几个吸墨剂时间、温度和湿度范围广泛的网格通常是有益的。

格栅可以用手或使用自动玻璃化设备进行吸墨剂和冷冻。自动化系统由于其高再现性和对吸墨剂条件（如时间和力）的精细控制，通常更可取。如果缓冲液太粘稠，无法有效去除，晶体很脆弱，或者如果溶液流动带走了太多晶体，则可能需要用滤纸轻轻接触网格背面，手动吸干网格。

吸液后，立即将格栅插入液态乙烷中。高导热系数液体乙烷的含量确保样品冻结得足够快，以防止破坏晶格在冷却过程中，甚至在没有低温保护剂的情况下。然后，将冷冻的格栅迅速转移到一个冷冻箱中，在那里可以在低温下长期储存。或者，在制备网格后，可以立即在电子显微镜中对其进行检查。成功的吸干和冷冻是一个反复试验的过程，必须针对每个样品单独进行优化。

2.1.1. 低剂量电子衍射透射电镜的建立

需要检查电子光学系统的对准和透镜的散光，并可能根据显微镜制造商的说明进行纠正。直射光束应聚焦并对准屏幕中心，并被光束挡块完全阻挡。此外，电网z（z）高度应调整到接近偏心高度，其中样品的图像不受其安装平台倾斜的影响。将试样摇晃至15°，即可得到粗略估计值；当网格处于常中心高度时，量子化孔或任何其他识别薄特征应保持居中。

在超低剂量率（<10⁻⁶ e（电子） Å⁻² 秒⁻¹)亮场中的低放大倍数（～100×）（图1一). 在这种配置中，可以快速测量整个网格中晶体的位置和密度以及包裹冰的厚度。一旦确定了含有晶体的区域，根据碳载体和孔洞之间的对比判断，冰的厚度尽可能薄，显微镜就会切换到过聚焦衍射模式（图1b条). 在这种配置中，可以检查单个晶体z（z）高度对偏心度进行微调，中心光斑通过在剂量率<10时最小化直射光束光斑的大小而精确聚焦⁻³ e（电子） Å⁻² 秒⁻¹。应使用显微镜的荧光屏进行验证，因为直射光束可能会损坏探测器。此外，电子滞后值得特别注意，以便在各种配置之间切换时，直射光束的光斑和图像都不会移动。通常，应以0.01–0.05的剂量率记录衍射图案 e（电子） Å⁻² 秒⁻¹，光束配置为大约5-10 直径为µm，物镜孔径完全打开，所选区域孔径设置为与晶体尺寸紧密匹配。早些时候出版了显微镜设置的详细步骤（Gonen，2013).

图1 在与样品相互作用后，光束（琥珀色光线）穿过物镜，物镜在横截面平面上形成衍射图案，并在图像平面上形成样品的图像。只有与所选区域孔径内的晶体图像相对应的衍射图案才可见。在这些简化的插图中省略了几条光线，为了清晰起见，图像平面的大小被放大了。散射角（2θ)显示。(一)在亮场中，晶体的图像被放大到探测器上（黄色光线）。(b条)在衍射模式下，衍射透镜被放置在检测器上，以形成衍射图案（绿光）的放大图像。位于横截面飞机完全打开。(c（c）)由于透镜的放大，距离d日从样品到物理探测器的距离通常比距离小得多D类到虚拟探测器。到虚拟探测器的距离对应于无透镜测量中的样本-探测器距离，使用例如X射线。

2.1.2. 微晶筛选和衍射数据采集

在网格上找到晶体后，将晶体居中，通过将晶体倾斜到所需的旋转范围来调整偏心高度，并插入选定区域的光圈和光束光阑。曝光2-5时记录初始衍射图案 s，剂量率为0.01–0.05 e（电子） Å⁻² 秒⁻¹如果衍射图案显示出高质量的衍射，则从该晶体中收集完整的数据集。低温容器的边缘将倾斜范围限制在距无螺栓方向约±70°的范围内，其中网格垂直于电子束。样品及其周围溶剂的组合厚度可能会进一步限制有用的倾斜范围，因为电子束必须穿过的物质量在高倾斜时可能变得难以控制（Shi等。, 2013). 为了避免进一步限制倾斜范围，应验证当移除所选区域光圈和光束挡块时，在整个旋转范围内没有其他晶体或网格条阻挡视图。如果数据收集的目的是补充现有的数据集，那么通常可以从初始的、未曝光的位置近似晶体取向。这样可以优化倾斜范围，以测量所需的反射。

最初的MicroED数据集是作为一系列静止镜头收集的，其中晶体在曝光期间保持静止，只有在电子束被屏蔽时才旋转到离散方向（Shi等。, 2013). 曝光时间根据晶体的衍射强度进行调整。在这种数据采集模式下，基于TVIPS TemCam-F416 CMOS的摄像头工作状态最佳；有足够的时间为每个像素的读出电子设备充电，从而使信噪比最大化。然而，静照为随后的数据解释带来了复杂性：绝大多数来自静止晶体的反射被窄带电子束击中(ΔE类/E类≃ 5 × 10⁻⁶对于200的场发射枪 kV）仅部分记录。为了有意义地将同一反射的多个观测值相互关联，将单个局部观测值相加或转换为其全强度等效值，并且随着观测到的偏倚范围的增加，该操作的精度降低。这个问题可以通过在曝光过程中振荡晶体来解决，这一直是基于角度计的X射线晶体学的标准实践（Arndt&Wonacott，1977）). 在电子显微镜上，由于难以准确定位工作台，晶体振荡变得复杂，工作台通常经过优化，以减少长时间曝光期间的振动。

这导致了MicroED数据采集的连续运行模式（Nannenga&Gonen，2014）; Nannenga，Shi，Leslie&Gonen，2014年)它捕获了每个反射的大部分，因为晶体在电子束中旋转，但通过连续移动来避免舞台的绝对重新定位。舞台以恒定速度旋转，最佳旋转速度反映冲突目标之间的折衷，并与曝光时间相协调（Holton&Frankel，2010）). 对于给定的曝光时间，高旋转速率将增加单个帧上每个反射的记录分数，但低旋转速率将确保即使是微弱的高分辨率反射也能在离开衍射条件之前在探测器上积累足够的计数。此外，过高的速率可能会导致斑点重叠，而过低的速率则会在每个图像上产生太少的斑点。

在无遮板模式下，从单晶中收集的连续旋转数据集大约需要10个 最小值。探测器不断暴露，并以有规律的间隔读出。这种操作模式以简化的实验装置换取了探测器的精度；特别是，我们发现在～0.1 s检测器的读出时间可以忽略不计（图2以及支持信息中的§2）。

图2 过氧化氢酶（0，10，8）反射的摇摆曲线d日= 13.7 奥，以“滚动快门”模式录制。在所有面板中φ=0°表示数据采集的开始，此时阶段不一定是无标签的。所有图像中的旋转范围为Δφ= 0.36°. (一)–(小时)相机记录的八个连续帧的像素强度，使得网格中的每个节点对应一个像素。(我)通过以下公式积分的剖面填充强度MOSFLM公司，其中垂直误差条跨越一个标准偏差。支持信息的§3中给出了过氧化氢酶和溶菌酶产生的其他几个斑点的额外摇摆曲线。

2.2. 图像转换

我们小组迄今为止的所有MicroED测量都是使用TVIPS TemCam-F416相机进行的。这个16 多像素相机使用预先记录的暗图和增益图在内部进行基本图像校正，应选择与电子显微镜的能量、曝光时间和样品的信号强度相匹配的图。为了满足系统在无快门或“滚动快门”模式下的实时约束，数据速率减少了2×2分格，从而得到2028×2048平方像素的有效相机尺寸，边长31.2 微米。此外，禁用显微镜任何动态变化参数的所有同步读取备份。与同步辐射源（Meyer）的典型X射线衍射实验相反等。, 2014)因此，用户必须提供附加信息，以便下游处理软件重建实验的几何结构。

(一)光束中心。直接光束与探测器平面表面的交点在数据处理期间根据用户定义的初始值进行细化（Sauter等。, 2004). 按照§2.1.1中概述的程序上面，图像的中心是一个很好的起点。另一种计算方法是根据单个图像中的强度变化来细化初始估计值（Baldwin&Henderson，1984）; 冯海因等。, 2011; 范·根德伦·奈德洛夫等。, 2013)，见支持信息§1。如果由于电子光学系统中的不稳定性，直接光束的图像在数据采集过程中漂移，这可能特别有用。

(b条)阶段的旋转速度。虽然这对于数据简化不是直接必要的，但它用于确定每个帧的旋转角度和范围（有关详细信息，请参见支持信息中的§2）。因为电子显微镜的载物台通常可以顺时针和逆时针倾斜，而小波长（§2.3)使旋转的利手性难以区分，需要特别注意旋转率的符号。

(c（c）)虚拟样本-检测器距离（图1c（c）). 原则上，这可以通过电子显微镜的放大率来确定，但优选使用已知粉末衍射图案的环间距来校准例如金或石墨。观察到的光环的圆形度也提供了一种验证任何散光的方法，这将导致非圆形图案。或者，可以使用已知单位-细胞尺寸的标准晶体进行精确校准。

我们开发了转换工具，可以解析一系列帧并输出相应的衍射图像集。通过将相机系统在其输出流中提供的信息与用户提供的信息相结合，这些工具以Super Marty View（SMV）格式生成图像，该格式直接适用于最初为X射线晶体学开发的几个现有数据简化包中的进一步处理，例如DIALS（刻度盘）（沃特曼等。, 2013)，MOSFLM公司（Leslie和Powell，2007年)和XDS公司（卡布施，2010年b条).

由于SMV格式的限制，处理程序不知道检测器的具体细节。以下参数直接输入到处理包中，可以根据数据本身确定。

(一)探测器增益的精确解释及其估计取决于下游处理软件。通常，它被确定为在足够大的背景像素区域中强度的方差和平均值的比率（Leslie，2006; 卡布施，2010年b条). 假设像素在统计上是独立的，处理程序可以在对强度值进行修正后，将检测器噪声视为泊松过程的结果。

(b条)相机不会标记死像素、热像素或其他故障像素。如果它们的存在妨碍了数据处理，可以使用特别的支持信息§1中概述的统计方法。TVIPS F416相机上的程序也可以帮助消除这些像素。

(c（c）)为了最大限度地减少对样本的辐射损伤，MicroED数据集是以低剂量模式收集的，到目前为止，即使是最强的低分辨率反射也在探测器的线性响应范围内。到目前为止，还没有必要处理过载的像素。

2.3. 衍射几何和分度

在撰写本文时，我们使用MOSFLM/无人机（莱斯利和鲍威尔，2007年; Evans&Murshudov，2013年)和XDS公司（卡布施，2010年b条). 由于这些软件包主要是为X射线晶体学开发的，因此在数据简化过程中，值得记住电子衍射的独特方面。

在200加速电压下用于MicroED数据采集的de Broglie波长 kV比通常用于晶体学的相应电磁波长短约50倍结构测定用X射线。因此，散射角较小埃瓦尔德球体弯曲度较小，并且对于光束中晶体的任何方向，衍射条件下的反射都几乎位于互易空间（Nannenga&Gonen，2014年). 这对自动索引程序提出了挑战，该程序依赖于三维空间中的周期性来恢复晶体晶格的间距和方向（Steller等。, 1997; 卡布施，2010年一; 吉尔迪等。, 2014).

在MicroED实验中，斑点的数量必须足够大，以使其周期性排列变得明显，并且其跨距体积必须足够大以确定三维晶格。通过连续旋转测量的衍射良好的晶体通常可以满足这些要求，我们发现跨越～20°楔形物的五到十幅图像为自动分度提供了足够的信息，无需先验的了解单元-单元参数。可能需要更多图像，因为对于有序晶体，电子束的窄带通（§2.1.2)导致每张图像上可识别的布拉格斑点相对较少。如果单位电池由于晶体的边长是唯一的，因此原则上可以从单个图像中确定晶体的取向（Jiang等。, 2009)但对于未知样本，上述内容就足够了。

衍射数据处理通常需要准确了解测量的几何形状，尤其是每次曝光期间样品的旋转范围。在MicroED中，样品方向在图像转换过程中计算为旋转率和相对于测量开始的曝光时间戳的乘积（§2.2以及支持信息中的§2）。这两个因素的不确定性都相对较大，导致导出的旋转角误差更大。此外，假设时间戳中的误差在零附近对称分布，则旋转速度中的任何误差都会导致计算的旋转角度偏离其真实值，并随时间而复合。因此，建议首先尝试使用几个间隔足够宽的框架来自动分度，以覆盖足够大的楔形倒易空间，但记录时间足够近，因此旋转角度的相对误差很小。

如果数据简化软件未能通过精确的误设置角度完全解释晶体取向的误差，则残差可能经常被镶嵌吸收。在这种情况下，镶嵌性起到了错误汇的作用，而不是晶格无序的精确模型。对于小单元单元，这种方法可能以降低积分精度为代价；对于较大的单元单元，随后的点重叠可能会完全阻止成功的处理。

2.4. 集成、扩展和合并

使用内部软件对第一批MicroED数据集中的强度进行了集成和缩放，为了简单起见，假设任何反射的最大强度集成与相应的全强度之间成比例（Iadanza&Gonen，2014). 这很有效，因为电子束中的时间强度波动很小。利用为X射线晶体学开发的现有软件的能力，可以直接使用更复杂的集成、缩放和合并协议。特别是，当在类似晶体方向的多次曝光中观察到反射时，建议使用积分强度的三维剖面（图2). 这种轮廓填充强度可以更好地估计相应的全强度当量，并有助于区分虚假噪声峰值。虽然很难获得测量强度中随机和系统误差的可靠估计，但合并和细化统计对于MicroED求解的结构（表1)表明数据质量与使用常规X射线技术获得的数据质量相当。

在我们的两项研究中，单个纳米晶足以让我们收集到约80%完整性的数据集（表1). 然而，对于某些晶格对称性，由于工作台的倾斜范围有限，很难收集完整的单晶数据集（§2.1.2). 如果有多个同晶数据集可用，合并来自多个晶体的综合强度通常可以增加完整性。如果晶体倾向于在类似方向上与其晶体轴对齐，则多晶体合并不一定会增加完整性（Nannenga、Shi、Hattne等。, 2014; 米仓等。, 2015). 在牛肝过氧化氢酶的情况下，它通常以晶体学平板结晶c（c）垂直于晶体平面的轴对齐，有限的倾斜角度防止了互易空间进入衍射状态。如果舞台只能倾斜±α在这种情况下互易空间假设围绕c（c）轴可以测量，由sin给出 (α). 在我们的设置中，倾斜角度限制为±70°，最多94%倒数空间可以集成到过氧化氢酶（Glaeser等。, 1989). Nannenga&Gonen（2014）给出了系统缺失数据对MicroED最终密度的影响示例). 然而，对于晶体不显示首选定向在网格上，合并来自多个晶体的数据可以得到100%完整的数据集（Shi等。, 2013).

2.5. 阶段化和细化

迄今为止，我们所有的MicroED结构都已分阶段实施分子替换，使用X射线晶体学的标准程序（Vagin&Teplyakov，1997; 麦考伊等。, 2007). 随后使用交互式工具进行手动重建，如库特（埃姆斯利等。, 2010)和精炼使用标准精炼包装（Murshudov等。, 2011; 阿富汗等。2012年)产生与X射线衍射数据导出的模型质量类似的结果，分辨率相同（Nannenga、Shi、Hattne等。, 2014; Nannenga，Shi，Leslie&Gonen，2014年). 与X射线晶体学一样，自动化工具BUCCANEER公司或phenix.ligand标识可用于减少人工劳动和密度图视觉解释的主观偏见（Cowtan，2006; 特威利格等。, 2007). 目前中枢神经系统（Brunger，2007年)，相位器,菲尼克斯定义和REFMAC公司在结构因子计算中考虑电子散射因子；其他软件可以假设衍射强度是由于X射线的散射引起的。根据MicroED迄今为止确定的数据集分辨率（表1)，电子散射因子可以对精细模型产生显著影响（Yonekura等。, 2015). 对于分子替换，在搜索模型与处理数据拟合的精确细节不太重要的情况下，电子散射因子的重要性很小。