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巨噬细胞抑制因子(TKP)或凝集素(TKPR)对小胶质细胞/巨噬细胞活化的调节可减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎的病程

摘要

背景

髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是多发性硬化(MS)最常用的小鼠模型。在EAE的进展过程中,脑的免疫活性细胞小胶质细胞被激活,并在脱髓鞘病变周围积聚。小胶质细胞活化由细胞外蛋白酶组织纤溶酶原激活物(tPA)介导,缺乏tPA的小鼠表现出改变EAE进展的迹象。在本研究中,我们使用了小胶质细胞/巨噬细胞激活的药物抑制剂和刺激物来检查EAE进展中小胶质细胞激活的时间要求,并确定这些方法是否可能具有治疗价值。

结果

使用三肽巨噬细胞/小胶质细胞抑制因子MIF(TKP)和四肽巨噬细胞/微胶质细胞刺激剂tuftsin(TKPR)进行干预可减轻EAE症状,并揭示巨噬细胞/小神经胶质细胞激活的时机对EAE的临床结局至关重要。我们表明,通过改变小胶质细胞激活的时间,可以在早期有利地控制疾病进展,而小胶质细胞活化反过来又改变了系统免疫反应,有利于上调促进EAE恢复的T辅助细胞2基因。

结论

巨噬细胞/小胶质细胞活性的预防性和治疗性调节在症状阶段显著改变EAE的结果。已经确定了代表治疗和预防MS的潜在探索途径的特定分子靶点。

背景

多发性硬化(MS)是一种中枢神经系统(CNS)自身免疫性疾病,其症状包括神经损伤和运动障碍。多发性硬化症是由于髓鞘受到免疫攻击,导致轴突和神经元变性。一种常用的MS动物模型是实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)。EAE不会自发发生,但会模仿MS的一些病理和组织学特征。在EAE期间,识别髓鞘成分的T细胞被激活,迁移到中枢神经系统并引起自身免疫性炎症[1]导致CD4+、CD8+T细胞和B细胞在中枢神经系统浸润。炎症过程包括分泌促炎性T辅助因子1(Th1)细胞因子[2]以及Th1、T辅助细胞2(Th2)和调节性T细胞之间的失衡[,4]. 当Th1细胞与Th2细胞的比率倾向于以Th2为主时,Th1细胞因子的促炎特性被抵消,自身免疫疾病的严重性得到缓解[5,6]. 在EAE诱导前,将分化的Th2细胞优先表达的可溶性Tim-2给予小鼠,导致Th2细胞因子过度分泌和EAE症状改善[7]. 最近,另一种Th细胞亚类Th17被证明参与EAE症状的调节,主要通过细胞因子IL-17发挥作用[8].

小胶质细胞是驻留于中枢神经系统的巨噬细胞相关细胞,在中枢神经系统损伤中起着关键作用[911]. 研究小胶质细胞参与的工具包括刺激或阻止其活化的药物小分子。凝集素(苏氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸,TKPR)促进表达凝集素受体的单核细胞来源的细胞的吞噬活性,如中性粒细胞、巨噬细胞和小胶质细胞[12,13]. 凝集素阳性细胞被招募到炎症部位,凝集素对其受体的亲和力和特异性足够强,可以利用凝集素进行成像和治疗[1416].

MIF(苏氨酸-赖氨酸-脯氨酸三肽,凝集素片段1-3,TKP)[17]通过未知机制抑制巨噬细胞/小胶质细胞的激活。在逆行性视网膜神经节细胞变性中,MIF延缓神经元死亡,增强轴突再生,并诱导活化的小胶质细胞形态转变为椭圆形、分支较少的形状[18]. MIF是兴奋性毒性发作期间小鼠海马小胶质细胞活化和神经变性的有效抑制剂[19].

触发小胶质细胞活化的内源性因子是丝氨酸蛋白酶tPA,它将纤溶酶原转化为纤溶酶。在急性期MS病变和MS患者脑脊液中tPA活性增加10倍,但在慢性MS中没有增加[20,21]. EAE期间小鼠tPA mRNA和活性增加[22]. tPA的约束合作伙伴,annexin II[23]和纤溶酶原激活系统的其余部分[24]MS病变中也上调。

tPA缺乏(tPA-/-)与野生型小鼠相比,小鼠表现出改变的EAE过程[22]. 症状出现延迟,表明tPA对疾病过程有贡献;然而,疾病的程度最终超过了在野生型小鼠中观察到的程度,并且持续时间更长,这揭示了tPA在恢复过程中的额外作用。tPA对其他模型系统的神经病理学至关重要,例如兴奋毒性:tPA-/-小鼠对谷氨酸诱导的海马神经变性不太敏感[25]. 有趣的是,早期药物阻断AMPA/KA谷氨酸受体导致EAE改善,表明谷氨酸诱导的兴奋毒性导致EAE神经功能障碍[26,27]. 兴奋性毒性伴随着小胶质细胞的激活和进一步的谷氨酸释放。在EAE中复杂tPA作用的一个组成部分可能包括小胶质细胞动力学的改变,因为tPA-/-小鼠的小胶质细胞活化减弱[25]. 支持这一假设的是,活动性MS和EAE病变的特征是激活的小胶质细胞[28]研究表明,它能促进模拟缺血发作的系统的神经退化[29].

在这项研究中,我们研究了EAE过程中改变巨噬细胞/小胶质细胞激活时间的后果,并表明在临床症状开始时操纵这一途径可以改善预后,可能是通过促进Th2表型的偏向。

结果

在EAE诱导前抑制小胶质细胞活化对EAE进展的影响不大

鉴于tPA和小胶质细胞在EAE中的作用在本质上似乎是复杂的,即退化和保护机制似乎都起作用,我们选择检查小胶质细胞激活和小胶质抑制的后果,并在疾病过程中的不同时间点进行检查。

我们首先评估预防性抑制小胶质细胞活化的结果,即在第一次注射MOG的前一天服用活化抑制剂。对于注射MOG、PBS治疗(对照)的小鼠,EAE症状发生在第7天(第7天),并逐渐恶化,直到第21天,之后小鼠开始恢复(图。1安培). 使用巨噬细胞/小胶质细胞活化抑制剂MIF进行预防性治疗后,疾病进展速度略有下降,尽管发病日期、最终严重程度和恢复速度与对照组小鼠没有显著差异。

图1
图1

预防性MIF输注不会改变EAE的发病、严重程度或恢复(A)在EAE诱导前一天开始,给Wt小鼠注射MIF 30天。每天对小鼠称重,并使用中概述的严重程度量表对症状进行评分方法。平均每日得分。PBS n=18;MIF d-1 n=12。Wilcoxon试验显示,在发病、严重程度或恢复方面没有统计学上的显著差异,但疾病的进展更为缓慢。(B) 冰冻脊髓切片用Luxol Fast Blue染色以显示髓鞘化区域。虚线和星号划定了脊髓的腹柱。使用NIH图像免费软件量化腹柱内的鲁索耐晒蓝染色强度,并将其归一化为第0天染色。减去背景染色。(C) 在冰冻脊髓切片中使用F4/80对活化的巨噬细胞/小胶质细胞进行免疫组织化学。(D) 使用抗CD3抗体浸润T细胞的免疫组织化学。

在不同的时间点评估髓鞘丢失。在第12天,当症状在性质上仍然轻微时,PBS输注的小鼠表现出正常水平的髓鞘形成(图。1B年). 然而,到了第23天,即达到症状严重程度的时候,广泛的脱髓鞘明显。d30发生再髓鞘形成,与临床疾病症状的下降相一致。相反,注射MIF的小鼠在任何时间点均未观察到明显的髓鞘丢失,这与适度改善的临床评分一致。

在第12天或之前,PBS或MIF处理小鼠的脊髓切片中未检测到巨噬细胞/小胶质细胞激活(图。1摄氏度). 然而,到第23天,在PBS治疗的小鼠中观察到许多激活的变形虫巨噬细胞/小胶质细胞,出乎意料的是,MIF治疗的小鼠也出现了显著的激活。到第30天,PBS治疗小鼠的巨噬细胞/小胶质细胞激活减弱,这与我们之前的报告一致(Lu等人,2002),MIF治疗小鼠也观察到类似的结果。相反,根据T细胞标记物CD3(图一维).

总之,尽管巨噬细胞/小胶质细胞活化没有完全抑制,但在MOG免疫前用MIF治疗小鼠时,观察到临床结果和脱髓鞘的中度改善。小胶质细胞进行神经毒性作用需要形态激活和迁移到损伤部位[30]; 在这种情况下,观察到的临床益处可能来自于对迁移的干扰大于对形态激活的干扰。

EAE发病时抑制小胶质细胞活化显著降低EAE进展

鉴于图中观察到的适度改进。1在早期进行MIF干预后,治疗性使用MIF(注射MOG后第7天开始治疗)获得了意外的阳性结果,这导致EAE症状显著消失,到第27天完全恢复(图。2安培). 髓鞘形成的组织学减少(图。2B型)MIF治疗的动物没有观察到巨噬细胞/小胶质细胞的活化,与使用MIF进行预防性治疗所观察到的情况相反(图。2摄氏度)T细胞向脊髓的浸润明显减少(图。二维). 正如讨论部分所述,多种可能性可以解释这种结果差异。

图2
图2

治疗性MIF输注严重缩短EAE病程(A)在wt PBS和wt MIFd7小鼠之间,EAE发病率无统计学差异。然而,与wt-PBS相比,wt-MIFd7的症状严重程度显著降低(p=0.0005);完全恢复(p=0.0005)。重量PBS n=18;重量MIF d7 n=11。(B) Luxol Fast Blue染色显示,在第23天,wt MIFd7小鼠几乎没有脱髓鞘。虚线和星号划定了脊髓的腹柱。使用NIH图像免费软件量化腹柱内的鲁索耐晒蓝染色强度,并将其归一化为第0天染色。减去背景染色。(C) 使用F4/80抗体对反应性巨噬细胞/小胶质细胞进行免疫组织化学。(D) CD3+T细胞的免疫组织化学。

在野生型小鼠EAE发病前刺激巨噬细胞/小胶质细胞活化可促进低水平EAE和早期症状恢复

MIF对wt小鼠巨噬细胞/小胶质细胞状态的药理学调控表明,与其他范式一样[18]巨噬细胞/小胶质细胞可以影响疾病的结局和进展。因此,我们试图确定在野生型小鼠中过早激活巨噬细胞/小胶质细胞对EAE的影响。

在诱发EAE(tuf)前一天输注tuftsin可降低症状严重程度并提前恢复,尽管发病日期未受影响(图。3A级). 在第29天左右观察到完全恢复之前,症状稳定在较低水平(临床评分为1)。

图3
图3

在野生型小鼠中预防性给予凝集素可使疾病进程减缓(A)wt-tufd-1小鼠的疾病发作与wt-PBS小鼠没有差异。严重程度显著降低(p=0.008),恢复完全(p=0.016)。重量PBS n=18,重量簇-1 n=13。(B) Luxol固蓝组织学染色显示髓鞘化水平。虚线和星号划定了脊髓的腹柱。使用NIH图像免费软件量化腹柱内的鲁索耐晒蓝染色强度,并将其归一化为第0天染色。减去背景染色。(C) 在不同时间点,在实验小鼠的冠状切片中可以看到反应性巨噬细胞/小胶质细胞。(D) 用抗CD3抗体免疫组织化学检测浸润T细胞。

与PBS处理的动物相比,凝灰岩处理的小鼠在第12天明显脱髓鞘(图。3B公司),但重髓鞘化发生得更快,并且在d23时已被检测到。

在第12天,虽然PBS和tuff处理的小鼠都有相似的疾病评分,但wt tufd-1动物对F4/80表现出强烈的免疫反应,F4/80是小胶质细胞激活的标志(图。3C公司). 然而,在稍后的时间点,尽管输注了凝集素,与wt PBS小鼠相比,wt tuwd-1小鼠没有明显的巨噬细胞/小胶质细胞激活。巨噬细胞/小胶质细胞的激活缺乏伴随着受损脊髓中CD3+细胞的实际缺失(图。三维).

在野生型小鼠EAE发病时刺激巨噬细胞/小胶质细胞活化可减轻EAE症状

MOG免疫(tuf)7天后,在野生型小鼠中输注tuftsin可显著减轻临床症状(图。4A级). 在第12天,凝灰岩处理的小鼠中观察到轻微脱髓鞘(图。4B类)脱髓鞘增加d23;然而,到d30时,髓鞘再形成过程变得明显,并扩展到与PBS处理的动物相当的水平。

图4
图4

在wt小鼠中治疗性使用Tuftsin会导致严重的病程取消(A)wt-tufd7小鼠和wt-PBS小鼠的疾病发作相同。严重程度大大降低(p=0.004),恢复完全(p=0.0002)。重量PBS n=18,重量簇7 n=13。(B) 髓鞘化水平用鲁索坚牢蓝显示。虚线和星号划定了脊髓的腹柱。使用NIH图像免费软件量化腹柱内的鲁索耐晒蓝染色强度,并将其归一化为第0天染色。减去背景染色。(C) 用F4/80染色观察巨噬细胞/小胶质细胞活化。(D) 使用抗CD3抗体浸润T细胞的免疫组织化学。

在第12天,凝灰岩处理的小鼠几乎没有活化的巨噬细胞/小胶质细胞免疫反应(图。4摄氏度). 然而,到第23天,观察到巨噬细胞/小胶质细胞的活化程度有限。在所有时间点,在经凝乳处理的脊髓中观察到非常有限的CD3+细胞浸润(图4D(四维)).

早期刺激tPA缺乏小鼠的巨噬细胞/小胶质细胞活化可加速EAE样症状的出现,但可防止疾病发展到严重程度

由于在EAE症状出现时抑制野生型动物的巨噬细胞/小胶质细胞活化可降低疾病的严重程度,因此我们接下来研究了在巨噬细胞/小神经胶质细胞活化程度不高的情况下,是否会加剧EAE的进展。我们使用tPA缺乏的动物,与野生型动物相比,在兴奋性毒性和EAE诱导的损伤中,小胶质细胞的激活减弱[25,22]. 在EAE之前或期间,Tuftsin被用于激活动物体内的巨噬细胞/小胶质细胞。

tPA预防性应用凝集素-/-小鼠早期(d3)出现EAE样症状(图。第5页)与PBS处理的wt小鼠(在第7天开始)或tPA相比-/-小鼠(第10天发病,数据未显示)。尽管发病较早,但观察到疾病进展迟缓,即症状从未达到PBS治疗小鼠的严重程度。

图5
图5

第一天注射预防性凝集素治疗tPA-/- 小鼠导致EAE显著提前发作(A)tPA患者在第3天发病-/-tuwd-1小鼠,比wt PBS早得多(p=0.03)。严重程度显著降低(p=0.03),恢复保持在较低水平(p=0.08)。重量PBS n=18,tPA-/-簇-1 n=11。(B) Luxol Fast Blue染色显示脱髓鞘水平。虚线和星号划定了脊髓的腹柱。使用NIH图像免费软件量化腹柱内的鲁索耐晒蓝染色强度,并将其归一化为第0天染色。减去背景染色。(C) 活化巨噬细胞/小胶质细胞的F4/80免疫组织化学。(D) 使用抗CD3抗体浸润T细胞的免疫组织化学。

在第12天未观察到髓鞘形成丢失(图。5亿). 然而,在临床评分最严重的时间点,即第23天,经凝集素治疗的小鼠在脊髓腹柱中显示出低水平的脱髓鞘,尽管比用PBS治疗的wt小鼠制备的切片中观察到的脱髓磷脂水平低得多。第30天,tPA中持续存在低水平脱髓鞘-/-tuftsin处理的小鼠。

巨噬细胞/小胶质细胞活化虽然有限,但在tPA中可见-/-早在第3天对d-1小鼠进行凝乳处理(图。5摄氏度)并在检查期间持续。然而,在第23天和第30天观察到活化的巨噬细胞/小胶质细胞的数量高于tPA的数量-/-PBS治疗的小鼠没有野生型小鼠高。在tPA的所有时间点,浸润性CD3+细胞的数量也减少-/-用凝集素进行预防性治疗(图。第五天).

虽然在第2天观察到的症状表现为EAE样,但可能是凝集素引起了与MOG注射无关的作用。为了证实这些症状确实是由早期EAE引起的,我们在d-1注射了凝集素,然后注射了完全弗氏佐剂和百日咳毒素,用PBS替代MOG。没有一只小鼠在EAE临床评分量表上表现出任何症状(数据未显示),这表明tPA的早期症状出现-/-在第1天进行凝灰岩治疗的小鼠依赖于MOG免疫。

当EAE症状开始时,刺激tPA缺乏小鼠的巨噬细胞/小胶质细胞活化并不影响EAE的进程

凝集素在tPA中的治疗应用(第7天)-/-(tPA-/-tuf)小鼠导致的疾病模式在统计学上与野生型疾病相似,发病日、严重程度高峰日和恢复过程相似(图。第6页). 凝集素治疗组动物的峰值严重程度稍低,但差异无统计学意义。

图6
图6

凝集素在tPA中的治疗应用-/- 小鼠不会改变EAE的发病、严重程度或恢复(A)Wilcoxon检验显示EAE参数没有显著差异(p>0.05)。重量PBS n=18,tPA-/-凝灰岩7 n=7。(B) 脱髓鞘可通过勒克索固蓝观察。虚线和星号划定了脊髓的腹柱。使用NIH图像免费软件量化腹柱内的鲁索耐晒蓝染色强度,并将其归一化为第0天染色。减去背景染色。(C) 80层/四层+-免疫组织化学检测反应性巨噬细胞/小胶质细胞。(D) 使用抗CD3抗体的T细胞免疫组织化学。

正如我们之前报告的那样[22],对于注射了wt或tPA的MOG,没有观察到髓鞘形成水平的损失-/-小鼠在d12时间点(图。6亿). d23在wt小鼠中观察到脱髓鞘([22]和图。1B年),但在tPA中延迟-/-在第30天观察到鲁索坚牢蓝(LFB)持续丢失的小鼠,此时wt小鼠已经重髓鞘化。相反,tPA中观察到易于检测到的脱髓鞘区域-/-12日龄的tuf小鼠。在第30天,当tPA-/-PBS小鼠仍表现出髓鞘形成丧失,tPA中检测到髓鞘再形成-/-tuf,小鼠类似于wt PBS小鼠。

tPA中巨噬细胞/小胶质细胞活化水平-/-第12天,tuf小鼠比用PBS治疗的野生型小鼠高(图。6摄氏度). 到第23天,wt PBS处理的小鼠和tPA-/-tuf处理的小鼠表现出强大且可比较的活化巨噬细胞/小胶质细胞水平。相反,tPA中的巨噬细胞/小胶质细胞-/-PBS治疗的小鼠只表现出较弱的激活。到第30天,wt PBS处理小鼠中的巨噬细胞/小胶质细胞已开始恢复到静止形态,但在tPA中仍保持激活状态-/-凝乳处理小鼠。tPA与CD3+细胞的数量相当-/-PBS和tPA-/-凝灰岩动物,但与wt PBS小鼠相比数量减少(图第6天).

MIF和tuftsin降低血管紧张素转换酶的活性

血管紧张素转换酶或ACE催化血管紧张素(Ang)I转化为Ang II。血管紧张素II与炎症有关[31]粘附分子表达上调从而影响血脑屏障的通透性[32]. 研究表明,服用ACE抑制剂卡托普利(含二肽KP)对Lewis大鼠EAE有有益的影响[32]. 此外,凝集素已被证明可将血管紧张素II的功能降低20%[33]. 由于MIF(TKP)和凝集素(TKPR)在凝集素C末端只有一个氨基酸不同,我们试图确定MIF或凝集素是否会作为ACE抑制剂发挥作用。当在MIF或tuftsin存在的情况下量化ACE活性时,我们发现MIF使ACE活性降低了33%,而tuttsin抑制了24%(数据未显示)。这一结果表明,这两种化合物可以作为ACE抑制剂来降低全身免疫反应,但并没有解决它们对EAE过程的不同影响。

免疫反应中的Th2转移

利用转录因子T-bet和GATA-3的差异表达分析EAE小鼠在所有条件下的Th1/Th2平衡,因为T-bet控制Th1标记的转录,GATA-3驱动Th2标记的转录。PBS处理、MOG注射重量和tPA-/-小鼠的特征是强烈的Th1反应,表现为T-bet表达水平的增加和GATA-3水平的降低。这一结果与报告一致,报告表明EAE主要是一种Th1介导的疾病[34]. 然而,向MOG注射wt小鼠注射MIF和tuftsin均导致GATA-3表达增加,表明转换为Th2反应。同样,在tPA中输注凝集素-/-小鼠产生了强烈的Th2反应(图7). 通过RT-PCR和ELISA测定脊髓提取物中Th1-(TNFalpha)和Th2-(IL10)特异性细胞因子的表达水平,进一步证实了这些结果(数据未显示)。

图7
图7

T-bet(Th1转录因子)和GATA-3(Th2转录因子)表达的定量对MIF和凝乳酶在不同时间点进行不同处理后提取的脊髓匀浆RNA进行实时RT-PCR。T-bet和GATA-3的表达水平与同一样本中同一时间点的肌动蛋白水平进行了标准化。#,表示两组在具体治疗和时间点上存在显著差异(p<0.05)。

讨论和结论

当前研究中提供的数据表明,在EAE过程中的不同时间点给予巨噬细胞/小胶质细胞调节剂可以显著影响疾病的结果。我们使用4种不同的方式修改MOG注射野生型小鼠的巨噬细胞/小胶质细胞激活,其中三种方式改善了EAE临床评分。在EAE症状开始时进行MIF治疗,或在症状出现前或出现时进行tuftsin治疗是有效的,而MIF的预治疗效果有限。该疾病的复杂性不允许我们直接解释导致不同方式的小胶质细胞激活操作导致疾病结果差异的分子事件。连接这三种成功模式的一个相关性是观察到平衡的T细胞反应与激活的T细胞的Th2命运占主导地位(图。7). 另一个可能起作用的因素是巨噬细胞/小胶质细胞迁移到损伤部位的需要。MIF巨噬细胞/小胶质细胞抑制剂可能比形态学激活更有效地阻止迁移(图。1),这仍然可以带来(适度)有益的结果,并且tuftsin的加速激活可能导致巨噬细胞/小胶质细胞的原位形态激活,而不是通常的趋化性迁移和增殖,然后是局部形态激活。该模型可以解释为什么在感兴趣的区域经tuftsin治疗后观察到较少的活化巨噬细胞/小胶质细胞。下文讨论了其他可能性。然而,无论如何,干预的好处是显而易见的。

在我们之前的研究中,我们发现tPA缺乏的小鼠表现出EAE症状的改变,包括临床疾病发病的时间和疾病的恢复[22]. 由于这些小鼠已经减弱了小胶质细胞的激活,我们在这里探讨的问题是,是否正是这种缺陷通过系统传递巨噬细胞/小胶质细胞激活调节剂来驱动EAE反应的改变,并评估其对EAE进展的影响。虽然使用全身给药在临床上最为相关,但一个值得关注的问题是给药化合物是否达到了中枢神经系统的治疗水平。我们的数据表明,交付的化合物影响了CNS中细胞的状态。此外,当在EAE诱导前给予MIF/TUF时,我们观察到在某些情况下,在很早的时候(例如,在tPA缺乏动物第1天给予凝集素的情况下),表面上是在有效的BBB分解之前,出现了显著的效果。

多发性硬化症的许多治疗方法都侧重于控制血脑屏障的通透性;炎症与血脑屏障的开放有关,因为它允许炎症细胞渗入中枢神经系统。活化的小胶质细胞释放细胞因子和趋化因子,通过受损的血脑屏障吸引和激活白细胞[35]. 已经使用了许多药物,它们本身具有抗炎作用,或者增加抗炎细胞因子的分泌并减少促炎细胞因子的分泌[36].

内源性小胶质细胞的激活过程将其从静止分支细胞转化为免疫活性炎症细胞,与抗原提呈、髓磷脂和组织分解、活性氧和氮的产生以及促炎细胞因子有关[37,38]. 在没有激活的情况下,例如在MIF等激活抑制剂的存在下,小胶质细胞无法介导这些作用[18]. 因此,抑制小胶质细胞活化可能是MIF注入小鼠脱髓鞘减少的原因。

另一方面,注射MIF的小鼠可能发生脱髓鞘,尽管程度较低。然而,由于缺乏活化的巨噬细胞/小胶质细胞,任何髓鞘碎片都可能无法清除。与这种可能性一致,Luxol Fast Blue将染色未被灭活的巨噬细胞/小胶质细胞吞噬的髓磷脂脂蛋白降解产物,从而解释了尽管注射MIF和注射PBS的wt小鼠的症状相似,但LFB染色增加的原因。治疗性(第7天)给予MIF可严重消除EAE症状。因此,巨噬细胞/小胶质细胞抑制的时机对疾病的结局至关重要。在疾病开始时缺乏活化的小胶质细胞似乎具有有益的作用。

tPA缺乏小鼠巨噬细胞/小胶质细胞的预防性激活,通常表现为小胶质细胞激活减弱[22]导致第3天症状提前出现,并在实验期间持续存在。谢克德.,在一个视神经挤压损伤模型中显示,早期吞噬细胞活性的出现和小胶质细胞抗原的提呈导致了对损伤的抵抗和神经元存活[9]. 小胶质细胞的早期激活可能以类似的方式改善EAE,通过招募和与适应性免疫反应相互作用而不是使其恶化,从而潜在地诱导保护性自身免疫。

关于保护性自身免疫的研究发现,中枢神经系统轴突损伤会触发系统性T细胞反应。一些小鼠株中缺乏成熟T细胞会导致中枢神经系统恢复受损[39]. 因此,早期激活小胶质细胞可能通过向辅助T细胞提供抗原并随后协调由此产生的适应性免疫反应来改善疾病。根据Shaked的建议保护性自身免疫和自身免疫疾病之间的平衡可能取决于小胶质细胞激活和初始免疫反应的时间和强度[9]. 使用凝集素后,tPA缺乏小鼠体内明显的Th2抗炎开关进一步支持了凝集素可能促进保护性自身免疫的观点。

当激活延迟时,早期小胶质细胞激活所赋予的保护作用减弱。第7天在tPA中给予Tuftsin-/-小鼠的EAE过程与注射PBS的小鼠非常相似。如Shaked所示,当小胶质细胞激活较晚时,保护的治疗窗口可能不太理想. [9].

我们试图以一种持续的方式过早激活野生型小胶质细胞,但这并不总是导致巨噬细胞/小胶质细胞的激活。与wt PBS小鼠相比,在第12天注射d-1凝集素的wt小鼠中,巨噬细胞/小胶质细胞的激活水平更高。然而,当在wt PBS小鼠中检测到巨噬细胞/小胶质细胞活化时,在第23天和第30天,由凝集素介导的活化似乎被逆转,并且观察到活化的巨噬细胞/小神经胶质细胞较少(图3C公司). 这一结果表明,可能存在一种不允许巨噬细胞/小胶质细胞持续过度活化的控制机制。尽管反应增加,但EAE症状有所缓解。在EAE诱导期巨噬细胞/小胶质细胞的激活可能再次起到保护(先决条件)抵抗疾病的作用。一旦疾病过程正常诱导巨噬细胞/小胶质细胞活化,凝乳酶就不再有效,这可能是由于无法使细胞过度活化。在这种情况下,治疗窗口已在早期阶段得到利用。

野生型小鼠在发病时输注Tuftsin在任何时间点都不会导致巨噬细胞/小胶质细胞过度激活(图4摄氏度). 然而,尽管取得了这一结果,该病的病程还是被严重取消了。如前所述,巨噬细胞/小胶质细胞的过早激活可能会导致抗原呈递、髓磷脂和组织分解、活性氧和促炎细胞因子的丧失,从而导致激活受到矛盾的抑制,EAE强度降低。

对MIF和tuftsin疗效的一种解释是,它们最终都作为抗炎剂发挥作用,因为它们都可以作为ACE抑制剂发挥作用。因此,在EAE的情况下,这种功能可以减少炎症,并限制免疫细胞从全身循环的渗透[31]. 事实上,在心力衰竭模型中,ACE抑制剂降低了Th1细胞因子与Th2细胞因子的比率,这表明从炎症转向[40]. 此外,研究表明,使用ACE抑制剂卡托普利对Lewis大鼠的EAE有有益影响[32]. 另一方面,虽然MIF和tuftsin确实可以作为ACE抑制剂/抗炎剂,但这并不是普遍正确的,如图所示。14,虽然这两种化合物被输送,但EAE严重性几乎没有变化。

作为中枢神经系统的第一道防线,小胶质细胞是局部损伤结果的关键决定因素。巨噬细胞/小胶质细胞激活的时间和强度似乎对疾病的进程至关重要。无论这种效应是通过与适应性免疫反应的T细胞的相互作用和/或炎症的调节来介导的,这项研究表明,仔细调节巨噬细胞/小胶质细胞的激活可能是一种可行的治疗方法。

方法

所有关于老鼠的研究都得到了纽约州立大学石溪分校实验动物资源系的批准。小鼠在21°C的无致病条件下保持12小时的光/暗循环。获得食物和水随意.

EAE的诱导

如前所述,EAE是使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)35-55(MEVGWYSPFRVHLYRNGK)主动诱导的[22,41]. MOG 35–55由质量控制生化试剂合成,并使用反相(C18)HPLC(QCB,Biosource,MA)纯化。

MOG35-55(300 ug)与含有500 ug的弗氏佐剂(密苏里州圣路易斯市西格玛)彻底均质结核分枝杆菌(密歇根州底特律市迪夫科)。将这种乳剂(200 ul)注射到雌性小鼠(野生型和tPA)的侧面-/-),年龄6–10周(第0天),以及500 ng百日咳毒素(加利福尼亚州坎贝尔市List Biological Laboratories),ip注射200 ul。两天后(第2天),再次注射百日咳毒素。在第7天,在相对的侧面进行第二次MOG注射。

EAE症状评估

一名对治疗条件和基因型一无所知的实验者监测了动物的行为症状,并每天称重。症状严重程度按0-5分进行评估,中间分数用0.5分表示。量表如下:0,无症状;1、尾音丢失;2、步态不稳;3、后肢麻痹;前肢麻痹;5、垂死或死亡[42].

定时给药

使用Alzet微渗透泵(Durect,Cupertino,CA)确保药物的时间控制输送。根据制造商的说明,用PBS、500 uM MIF(西格玛,圣路易斯,密苏里州)或500 uM tuftsin(美国肽公司,加利福尼亚州桑尼维尔)填充14天的泵(输注速度0.5 ul/hr,总容量200 ul),并在37°C下培养过夜。

成人野生型和tPA-/-雌性小鼠(6-10周龄)用静脉注射阿托品(0.6mg/kg体重)和2.5%阿维汀(0.02ml/g体重)进行深度麻醉。将泵植入动物背部皮下14天。在第14天,用新的14天泵更换泵,并在实验期间进行维护。含有PBS的泵与相应的MIF和tuftsin泵同时植入。

在早期对照实验中,我们证实在EAE诱导前(第1天)或诱导后(第7天)放置PBS泵不会改变病程。因此,所有野生型小鼠或tPA的数据-/-注射PBS的小鼠来自4个独立实验。重要的是,wt-或tPA-/--PBS小鼠被用于每一个实验,并作为对照组与实验组并排运行。

免疫组织化学和组织学染色

在疾病过程中的不同时间点从小鼠身上采集脊髓,并将其固定在4%多聚甲醛和20%蔗糖的PBS中。脊髓被分成三个等长的部分。将每段脊髓的切片嵌入Tissue-Tek(Miles,Elkhart,in)最佳切割温度复合物中,冷冻在干冰上,并在-80°C下保存直至使用。使用低温恒温器(德国莱卡、努斯洛赫)获得冠状切片,并将其安装在载玻片上(Superfrost Plus、Fisher Scientific),从而代表了所有三个初始切片。幻灯片在-80°C下保存,直至使用。

用0.3%过氧化氢抑制内源性过氧化物酶活性后,用血清隔夜封闭切片。F4/80是一种显示巨噬细胞/小胶质细胞的抗体,以1:100(北卡罗来纳州罗利市塞罗泰克)的比例加入切片中,在室温下保持1小时[43]. 将切片与二级抗体(Vector Labs)在室温下孵育1小时,添加ABC试剂(加利福尼亚州伯林盖姆Vector实验室),并使用二氨基联苯胺对亲和素-生物素复合物进行可视化[29]. 然后将载玻片依次脱水,浸入二甲苯中,然后使用Permount(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)盖玻片。除F4/80外,其他标记物也用于观察小胶质细胞激活状态,如异凝集素B4、Iba1和5-D-4(数据未显示)。

为了评估单个切片的髓鞘形成水平,将载玻片脱水,并在56°C的0.1%Luxol Fast Blue(Sigma,St.Louis,MO)的95%乙醇和冰醋酸中孵育过夜。然后用95%乙醇和蒸馏水冲洗载玻片,并依次用0.1%碳酸锂和70%乙醇进行区分。在脱水和二甲苯处理后,使用Permount覆盖玻片。在每只动物的多个切片上量化LFB标记的强度,并进行平均和绘图。

血管紧张素转换酶(ACE)测定

对于标准曲线,在125 mM硼酸盐缓冲液中用200 ul的6.25 mM次嘌呤酸(底物)培养不同体积的0.1单位/ml ACE。为了测试ACE活性的抑制,在添加200 ul底物之前,将不同体积的0.5 mM MIF或Tuftsin在室温下预培养1小时。所有样品在37°C的玻璃试管中与基质孵育90分钟。通过在硼酸盐缓冲液中添加250 ul 20 mM EDTA停止反应。添加2 ml硼酸盐缓冲液和1.5 ml 160 mM三聚氯氰(在分光光度级二恶烷中重新悬浮)。试管在6000×g下离心10分钟。用分光光度计在405 nm处读取上清液对蒸馏水的吸光度[44].

T-bet和Gata-3定量RT-PCR

使用Trizol(Invitrogen,CA)从脊髓匀浆中提取RNA。根据推荐的方案,使用SuperScript™II逆转录酶(Invitrogen,CA)合成cDNA。在含有3 mM MgCl的20μl实时PCR反应体积中使用2μl稀释的cDNA2每个底漆0.5μM,以及LightCycler建议的所有其他成分®FastStart DNA大师SYBR Green I试剂盒(罗氏应用科学)。反应在LightCycler上进行®仪器(罗氏应用科学)。

用于PCR的引物为:

T-bet(向前):GCCAGGGAACCGCTTATG

T-bet(反向):TCCCCCAAGCAGTTGACAGT

GATA3(转发):CTGACTATAGAAAGAAGCATCCAG

GATA3(背面):AAGTAGAGGGGTCGGAGGAACTCT

β-肌动蛋白(正向):GGCACTGCGCATCCTCTT

β-肌动蛋白(反向):AGAGCCTCAGGCATCGGAAC

T-bet的PCR程序为95°C 10 min,然后在95°C(10 s)、62°C(5 s)和72°C(20 s)下进行40次循环,然后是标准熔化曲线。GATA3的PCR程序为95°C 10 min,然后在95°C(10 s)、58°C(5 s)和72°C(20 s)下进行40次循环,然后是标准熔化曲线。β-肌动蛋白的PCR程序为95°C 10 min,然后在95°C(10 s)、65°C(5 s)和72°C(5s)下进行45次循环,然后是标准熔化曲线。

统计

使用GraphPad Prism分析所有EAE图。对非参数数据进行Wilcoxon检验,以比较药物治疗和PBS EAE之间的差异。对EAE的发病、严重程度和恢复三个参数进行统计分析。基于一组中所有小鼠的每个参数的第一天和最后一天来选择分析的时间点。进行学生T检验,比较对照组和实验组在每个时间点的髓鞘形成水平。P值列在相关图表上。

缩写

tPA:

组织纤溶酶原激活剂

EAE公司:

实验性变态反应性脑脊髓炎

MOG公司:

髓鞘少突胶质细胞糖蛋白

LFB(线性反馈):

Luxol坚牢蓝

PBS(公共广播系统):

磷酸盐缓冲盐水

计轴评估器:

血管紧张素转换酶

MIF公司:

巨噬细胞/小胶质细胞抑制因子

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致谢

我们要感谢迈克尔·弗洛曼博士和Tsirka实验室的成员对手稿的批判性阅读和有益的建议。这项工作得到了沃兹沃思基金会和NIH/NINDS(R01NS42168)向SET和石溪大学MS协作研究中心提供的资助。

作者信息

作者和附属机构

作者

通讯作者

与的通信斯特拉·齐尔卡.

其他信息

作者的贡献

MB进行了EAE实验(监测动物的行为得分和体重)和ACE实验,进行了统计分析,并撰写了手稿的初稿。MW协助EAE实验,进行F4/80和CD3免疫染色、LFB染色和定量以及实时PCR实验。SET设计实验,分析结果,完成手稿写作,监督项目。所有作者阅读并批准了最终手稿。

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Bhasin,M.,Wu,M.&Tsirka,S.E.巨噬细胞抑制因子(TKP)或凝集素(TKPR)对小胶质细胞/巨噬细胞激活的调节可减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎的病程。BMC免疫 8, 10 (2007). https://doi.org/10.1186/1471-2172-8-10

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