非裔美国人三阴性乳腺癌细胞对一氧化氮诱导的线粒体介导的凋亡的敏感性增加

摘要

背景

乳腺癌是一种复杂的异质性疾病，有许多不同的亚型。年轻的非裔美国人（AA）女性经常表现出具有独特生物学特性的侵袭性乳腺癌，这种癌症很难治疗。更好地了解AA乳腺肿瘤的生物学特性可以帮助制定有效的治疗策略。我们以前的研究表明，AA而非高加索（CA）三阴性（TN）乳腺癌细胞对亚硝基应激诱导的细胞死亡敏感。在这项研究中，我们阐明了一氧化氮（NO）诱导AA TN乳腺癌细胞凋亡的可能机制。

方法

用不同浓度的长效NO供体DETA NONOOAte处理乳腺癌细胞，并通过台盼蓝排斥试验测定细胞活力。凋亡由TUNEL和caspase 3活性以及线粒体膜电位的变化决定。免疫印迹分析评估半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和Bax裂解、铜/锌超氧化物歧化酶（SOD）和锰SOD水平。在NO诱导的细胞凋亡中测量钙蛋白酶抑制剂对Bax切割的抑制、活性氧（ROS）水平以及SOD活性。评估NO对乳腺癌干细胞（MCSCs）的体内外作用。

结果和讨论

NO诱导所有AA细胞的线粒体介导凋亡，但在CA TN乳腺癌细胞中没有。我们发现，仅在暴露于NO的AA TN乳腺癌细胞中，存在显著的TUNEL阳性细胞、Bax和caspase-3活化的裂解以及线粒体膜电位的去极化。抑制Bax裂解和ROS的淬灭部分抑制了NO诱导的AATN细胞凋亡。ROS的增加与AA TN乳腺癌细胞中SOD活性的降低相一致。此外，NO处理AA TN乳腺癌细胞可显著降低表达MCSCs和异种移植形成的醛脱氢酶1（ALDH1），但在CA来源的乳腺癌细胞中没有。

结论

乳腺肿瘤的种族差异决定了需要定制更适合该疾病独特生物学特性的治疗方案。

背景

乳腺癌是一种复杂的疾病，不同类型的细胞参与其发生和发展[1,2]. 它被广泛地分为雌激素受体阳性（ER+）和雌激素受体阴性（ER-）亚型，每种亚型的发育都依赖于特定的环境线索和信号通路[三]. 在年轻的非裔美国人（AA）女性中，经常诊断为侵袭性三阴性（TN）（ER、孕酮受体阴性（PR）和Her2 Neu）形式的乳腺癌，表明这种致命疾病的发展存在差异[4,5]. 这些侵袭性TN乳腺肿瘤的有限治疗选择导致AA女性的高死亡率[6]. 与此形成鲜明对比的是，高加索人（CA）妇女通常在绝经后发生ER+或TN乳腺肿瘤，与AA患者相比，这些肿瘤通常预后更好，死亡率更低[7]. 即使在调整了社会经济因素后，AA乳腺肿瘤似乎也表现出特定的侵袭性特征，这表明存在肿瘤细胞和宿主微环境共同促成的独特生物学[8].

利用激光捕获显微切割和全基因组mRNA表达分析，有报道称，与高加索人群的类似肿瘤相比，AA乳腺肿瘤的基质具有更高的炎症和血管生成[9]. 此外，在AA的肿瘤上皮中发现一些细胞周期调节因子，如p16、CCNA2、CCNB1和CCNE2，以及包括内质网（ER）相关降解在内的一些生物过程，都比CA人群中高很多[9]. 与CA乳腺肿瘤相比，AA中促进转移的候选癌基因AMFR的表达增加存在种族差异[9]. 此外，与CA乳腺肿瘤相比，AA中发现肿瘤抑制因子CDH13高甲基化[10].

我们以前的研究表明，AA和CA乳腺癌细胞对一氧化氮（NO）诱导的亚硝化应激反应不同，一氧化氮是由一氧化氮合酶（NOS）产生的多效性分子[11——13]. 由活性氧（ROS）/活性氮（RNS）产生的氧化/硝化应激分别影响乳腺癌的所有亚型[14,15]. 内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）已在大量人类乳腺肿瘤中检测到，其表达模式与肿瘤分级相关[16]. 然而，对一氧化氮合酶表达的种族差异以及AA和CA乳腺癌细胞对氧化/亚硝化应激的反应仍缺乏研究。我们以前曾报道过AA TN乳腺癌细胞系MDA-MB-468对NO诱导的凋亡高度敏感[17]. NO能够上调MDA-MB-468细胞中MAP激酶磷酸酶（MKP-1）的表达，从而促进ERK1/2的失活，Bax整合到线粒体膜导致caspase-9和-3活化[17,18]. 然而，NO不能增加MDA-MB-231（一种CA TN乳腺癌细胞系）中MKP-1的表达或诱导凋亡[17]. 另一方面，低（nM）浓度的NO通过增加细胞周期蛋白D1和鸟氨酸脱羧酶的翻译显著上调MDA-MB-231细胞的增殖[19]. 在这项研究中，我们进一步研究了来自每个民族的三个额外的TN乳腺癌细胞系对亚硝化应激的反应。与我们之前的研究一致，我们发现AA和CA-TN乳腺癌细胞株在亚硝化应激方面存在显著差异。NO特异性灭活超氧化物歧化酶（SOD），增加ROS，部分促进AA TN乳腺癌细胞株的凋亡。更重要的是，NO处理AA乳腺癌细胞株会降低乳腺癌干细胞（MCSC）的含量在体外减少异种移植形成体内因此，我们的研究提供了进一步的证据，证明TN乳腺肿瘤的生物学存在种族差异，应针对每个人群中的特定参与者进行有效的治疗干预。

方法

材料

DETA-NONOate购自Cayman Biochemicals（密歇根州安娜堡），Calpain Inhibitor III购自Calbiochem（德国达姆施塔特），N-乙酰-l-半胱氨酸（NAC）购自Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）。Ac-DEVD-AMC从Pharmingen（美国加利福尼亚州圣地亚哥）购买。ApoAlert DNA片段分析试剂盒来自Clontech（加州山景城）。SOD活性通过使用Cayman Chemical Company（密歇根州安阿伯）提供的检测试剂盒进行测量。Aldetect脂质过氧化检测试剂盒来自Enzo Life Sciences（美国密歇根州安娜堡）。MitoTracker Red CMX-Ros染料来自纽约州格兰德岛的Life Technologies。

人类细胞系

所有人类乳腺癌细胞系均于2013年从美国类型培养收集（ATCC）（弗吉尼亚州马纳萨斯）获得。ATCC使用Promega PowerPlex 1.2系统和Applied Biosystems Genotyper 2.0软件分析扩增子。我们尚未在实验室中进行任何进一步的测试。MDA-MB-231、MDA-MB-157和MDA-MB-436乳腺癌细胞系在含有10%FBS的Leibovitz的L-15培养基中繁殖。HCC-1806、HCC-70、MDA-MB-468和HCC-1395在含有10%的FBS的RPMI 1640中繁殖。BT-549在含有10%胎牛血清的DMEM F-12中繁殖。

细胞活力

接种在六孔板（7.5×10）中的细胞⁵每口井）允许隔夜生长。收集用不同浓度DETA-NONOate处理24 h的细胞，并用台盼蓝排除法测定细胞活力。每个浓度和时间点的活细胞数用血细胞仪测定三份[20].

标记法

如前所述，使用Clontech的ApoAlert DNA片段分析试剂盒进行TUNEL分析[21]. 简单地说，电池（2×10⁵)将细胞置于6孔板中，在4°C的1%甲醛-PBS中固定20分钟。用PBS清洗细胞，并在70%乙醇中储存过夜。用含有末端脱氧核苷酸转移酶（Tdt）的核苷酸混合物处理细胞，并在37°C下孵育1 h。在荧光显微镜下对细胞进行清洗和分析。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3测定

细胞在昆虫细胞裂解缓冲液{50 mm HEPES、100 mm NaCl、2 mm EDTA、0.1%3-[（3-胆酰胺丙基）二甲基氨]-1-丙基磺酸（CHAPS）、10%蔗糖、5 mm DTT和1×蛋白酶抑制剂}中在4℃下裂解30 min。裂解产物用于使用Ac-DEVD-AMC底物的caspase-3（3μg）分析，该底物在特异性裂解后释放荧光AMC，该荧光AMC使用荧光计（Versa Fluro；Bio-Rad）进行量化，在380 nm激发，在440 nm发射，如前所述[22].

西方分析

为了分析细胞溶质蛋白，细胞在细胞裂解缓冲液中进行裂解[50 mm HEPES（pH 7.5）；1 mm DTT、150 mm NaCl、1 mm EDTA、0.1%吐温20、10%甘油、10 mmβ-甘油磷酸、1 mm-NaF、0.1 mm原钒酸盐、10μg/ml亮氨酸蛋白酶、10μg/ml抑肽酶和0.1 mm PMSF]，并在4°C下培养30分钟。蛋白质浓度是使用生物-Rad蛋白质分析染料浓缩物测量的。将裂解液（30μg）在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳拆分，并使用罐印迹程序（Bio-Rad Mini-Protean II）将其电转移至聚二氟乙烯膜（Bio-Rad）。用以下主要抗体培养细胞膜：血红素加氧酶-1（HO-1）（Santa Cruz，Cat#sc-10789）、裂解caspase-3（Cell Signaling，Cat#9661）、Bax（Santa Cruz Biotechnologies，Cat#20067）、Bcl2（BD-Transformation Laboratories，Cat#551052）、β-actin（Cell信号技术，Cat#4967）、NOX4（Abcam，Cat#ab60940）、，Mn-SOD（Abcam，Cat#13533）、Cu/Zn SOD（Abcam，Cat#13498）、COX IV（Abcam，ab14744）和1:1000稀释的相应辣根过氧化物酶连接F（ab）片段二级抗体（Amersham Corp.，Piscataway，NJ）1小时。免疫反应条带通过增强化学发光（ECL）检测系统（Amersham）可视化如前所述[20,22].

流式细胞术测定基质金属蛋白酶

电池（1X10⁶)在各种处理后收获，用冷1xPBS洗涤两次，用100 nM MitoTracker Red CMX-Ros染料在37°C的黑暗中孵育15分钟，用冷PBS洗涤二次，然后立即用流式细胞仪进行分析，如前所述[20].

丙二醛和4-羟基烷的测量

按照前面描述的制造商说明，使用Aldetect脂质过氧化检测试剂盒（cat#BML-AK170-0001，Enzo Life Sciences，Ann Arbor，MI，USA）测量丙二醛和4-羟基烷（4-HAE）的水平[23].

线粒体和胞质细胞分离

使用Thermo Scientific（美国伊利诺伊州罗克福德）的线粒体和细胞质提取试剂进行细胞分离。分馏如前所述[17].

超氧化物歧化酶活性测定

电池（1×10⁶)接种在六个孔板中汇合，收集时不使用蛋白水解酶。SOD活性通过使用Cayman Chemical Company（密歇根州安阿伯）提供的检测试剂盒进行测量。根据制造商的方案进行活性分析。

氟化铝测定和流式细胞术

如上所述进行Aldfluor测定[24,25]根据制造商的（cat#01700，干细胞技术，加拿大温哥华）指南。简单地说，将乳腺癌细胞悬浮在含有ALDH底物bodipy-氨基乙醛（BAAA）的Aldefluor检测缓冲液中1.5μM，并在37°C下培养40分钟。区分ALDH⁺和ALDH⁻细胞，一部分细胞在相同条件下在ALDH抑制剂二乙基氨基苯甲醛（DEAB）10倍摩尔过量的存在下培养。这导致ALDH的荧光强度显著降低⁺并用于流式细胞仪的补偿。为了测定CD44的表达，将悬浮在PBS中的MDA-MB-231和HCC1806细胞暴露于PE结合的抗人CD44抗体（cat#555479，BD-Pharmingen™，CA，USA）中，并进行流式细胞术分析。

异种移植形成

使用6至8周龄的裸鼠（印第安纳波利斯哈兰实验室公司）进行异种移植。对照组或DETA-NONOate处理的（24小时）MDA-MB-468、HCC-70、HCC-1806和MDA-MB-231细胞（2x10⁶细胞/100μl）与基质凝胶（1:1）混合后植入裸鼠皮下（背外侧后部）。在15周内对肿瘤进行监测，并按照前面所述计算肿瘤体积[24,26]. 本研究严格按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中的建议进行。该方案由Charles R.Drew医学和科学大学动物实验伦理机构动物护理和使用委员会批准（许可证号：I-1103-261）。

统计分析

数据以平均值±S.D.表示，并使用ANOVA分析组间差异。如果总体方差分析显示出显著差异，则采用Newman–Keuls多重比较测试对各组进行配对比较。所有比较都是双尾的，并且第页-数值<0.05被认为具有统计学意义。实验至少重复了三次，并显示了代表性实验的数据。

结果

一氧化氮优先诱导AA TN乳腺癌细胞死亡

通过不同浓度的长效NO-受体DETA NONOate处理，检测NO对乳腺癌细胞活性和增殖的影响。我们分析了从每个种族人群中获得的四种不同的乳腺癌细胞系。用不同浓度的DETA-NONOate对AA（HCC-1806、HCC-70、MDA-MB-157和MDA-MB-468）和CA（BT-549、MDA-MB-436、HCC-1395和MDA-MB-231）乳腺癌细胞株进行不同时间点的治疗。我们和其他人之前已经证明，较低浓度（1-100μM）的DETA-NONOate释放生理范围（nM），而较高浓度（0.2-1mM）分别释放高病理生理范围（μM）NO[27,28]. 在本研究中，我们观察到50μM的DETA-NONOate诱导（HCC-1806:19.37±2.58%；MDA-MB-468:43.94±1.26%）；100μM（HCC-1806:17.21±0.18%；MDA-MB-468:47.01±0.36%）；200μM（HCC-1806:41.11±0.89%；MDA-MB-468:76.46±1.25%）；和300μM（HCC-1806:23.54±0.27%；MDA-MB-468:84.78±0.58%）细胞在48小时时死亡（图1a个). 此外，高NO在48小时诱导500μM时细胞死亡显著增加（HCC-70:52.10±5.76%；HCC-1806:82.84±3.36%；MDA-MB-468:95.35±1.82%；MDA-MB-157:94.71±1.71%）和1mM（HCC-70:84.72±1.83%；HCC-1806:92.80±2.98%；MDA-MB-468:96.66±1.57%；和MDA-MB-157:99.23±0.769%）（图1亿). 在所有四种CA细胞系中，在低浓度no下未观察到明显的细胞死亡，而在高浓度no下，MDA-MB-231（27.07±4.56%）和MDA-MB-436（27.19±5.57%）癌细胞在48小时内仅观察到20-28%的细胞死亡（图1亿). 即使在24小时，1mM DETA-NONOate也能选择性诱导AA TN乳腺癌细胞的显著细胞死亡（HCC-70:40.00±3.99%；HCC1806:46.23±3.42%；和MDA-MB-468:98.14±0.66%），而CA细胞中未观察到明显的细胞死亡（图1c个). 我们进一步进行了末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）分析，以评估DETA-NONOate治疗24和48小时后TN-AA乳腺癌细胞中是否发生DNA片段化。DETA-NONOate（1mM）治疗后，AA中TUNEL阳性细胞显著增加，但CA乳腺癌细胞系中TUNEL-阳性细胞没有显著增加（图第1d-e页). MDA-MB-468细胞中TUNEL阳性细胞的定量分析显示，在24小时（28.71±4.49%）和48小时（43.27±7.78%）时均显著增加（图第1页). 在类似处理后的两个时间点，在MDA-MB-231细胞中未发现TUNEL阳性细胞的显著增加（图第1页). DNA片段化是细胞凋亡的标志，其中caspase-3是主要的执行酶[29]，我们同时检测了用NO处理的TUNEL阳性AA TN细胞中caspase-3的活性。我们发现早在24小时用1mM DETA-NONOate处理的AA TN电池（HCC-1806和MDA-MB-468）中caspase-3的活性增加，而CA TN细胞的活性没有增加（图第1页). 由于来自CA的乳腺癌细胞在NO处理下没有发生凋亡，我们进一步检测了HO-1的诱导，HO-1是一种早期应激反应标志物[30]. 我们能够在所有检测的AA细胞系中检测到早期（治疗后8小时）HO-1蛋白水平的上调，而在CA TN乳腺癌细胞中没有发现显著变化（图1克). 这些数据表明，NO增加了AA细胞凋亡导致的细胞死亡，而在CA TN乳腺癌细胞中未观察到可检测到的反应。

图1

一氧化氮优先诱导AA乳腺癌细胞死亡。AA和CA乳腺癌细胞系在各自的培养基中增殖，并用不同浓度的一)DETA-NONOate（DN）（0.01-0.3mM）48小时。b条)DETA非燕麦（0.5-1mM）48小时c（c）)DETA-NONOate（1mM）持续8-24小时。在这些不同的处理之后，收集细胞，并使用血细胞仪通过台盼蓝排除法测定其活性，以进行细胞计数。d日)在8孔室载玻片上繁殖的细胞用DETA NONOate（1mM）处理24和48小时。经过这些处理后，用4%多聚甲醛固定细胞30分钟，并通过TUNEL分析测定DNA片段。显示了对照组和TUNEL阳性MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞的代表性图片。e（电子）)在放大100倍的图像上对TUNEL阳性细胞进行定量。显示了每个时间点/细胞线的TUNEL阳性细胞数/场（平均3场）。（f）)用DETA-NONOate（1mM）处理48h的细胞在昆虫细胞裂解缓冲液中进行裂解，并使用荧光底物对3μg总细胞裂解物进行caspase-3活性测定。给出了3个不同实验的结果。克)使用从DETA-NONOate（1mM）处理的细胞中获得的100μg总细胞裂解物在不同时间点（0-24h）进行血红素氧化酶-1（HO-1）的免疫印迹分析。我们使用β-肌动蛋白作为内务控制。对A、B、C、E和F进行双向方差分析统计。数据表示为平均值±SD，显著值表示为*第页 < 0.01, **第页 < 0.001, ***第页 < 0.0001

NO诱导AA TN乳腺癌细胞线粒体介导的凋亡

我们进一步研究了线粒体是否参与了NO诱导的AA-TN乳腺癌细胞凋亡。线粒体膜的完整性由促凋亡和抗凋亡蛋白的比例维持，释放细胞色素C类当半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3被激活时[31]. Cleaved Bax是一种促凋亡分子，已被发现整合到线粒体膜中以释放细胞色素C类[17]. 用DETA-NONOate（1mM）处理48小时后，在所有AA中都检测到裂解caspase-3和裂解Bax，Bax是Bax的活性形式，但在CA TN乳腺癌细胞中没有检测到（图2a-b号机组). 有趣的是，在HCC-1806中未检测到抗凋亡分子Bcl2的基础水平，而在接受NO治疗的MDA-MB-468和MDA-MB-157 AA TN乳腺癌细胞中其水平显著下降（图2a-b号机组). 与此形成鲜明对比的是，在所有CA TN乳腺癌细胞中检测到显著的Bcl2水平，并且在NO暴露后保持相对稳定，甚至略有增加（图2a-b号机组). 由于Bax裂解在所有凋亡的AA TN细胞中普遍存在，我们抑制Bax裂解以检测其对NO诱导的凋亡的贡献。钙蛋白酶被氧化应激激活，在N处分解Bax-末端产生有效的促凋亡18kDa片段，促进Bcl-2依赖性细胞色素C类释放与凋亡细胞死亡[32]. 通过台盼蓝排斥试验（图2厘米). 在含有或不含钙蛋白酶抑制剂III的No处理的CA乳腺癌细胞中，未观察到细胞活力的变化。免疫印迹分析表明，除了减少细胞死亡外，在AA中，经钙蛋白酶抑制剂II处理的Bax和caspase-3裂解减少，但在CA乳腺癌中没有（图第二天到第二天)。

图2

一氧化氮诱导AA乳腺癌细胞线粒体介导的细胞凋亡。一-b条)接种细胞汇合并用DETA NONOate（0.5-1mM）处理48小时。对裂解的caspase-3（19和17kDa条带）、总Bax（完整Bax 20kD和裂解Bax 18kD条带）和Bcl2进行免疫印迹分析。β-肌动蛋白的表达作为内务管理对照。CA细胞株中未发现caspase-3和Bax裂解。c（c）)用DETA-NONOate（1mM）暴露细胞，并用不同浓度（10-30μM）的Calpain III（Ci III）抑制剂预处理或不预处理（1h）。数据表示为平均值±SD，有效值表示为***第页 < 0.001.d日,e（电子）)用DETA-NONOate和钙蛋白酶抑制剂III处理的细胞进行裂解caspase-3和Bax的免疫印迹分析。（f）)收集DETA NONOate处理24h（蓝色曲线）或48h（红色曲线）的细胞，用Mito Tracker染料孵育，用流式细胞仪测量线粒体膜去极化。解偶联剂羰基氰化物-4-（三氟甲氧基）苯肼（FCCP）用作阳性对照（绿色曲线），而未经处理的细胞作为对照（黑色曲线）

凋亡刺激引起线粒体的一系列变化，这些变化对死亡程序至关重要[33,34]. 其中一个变化是线粒体膜上大孔的开放导致线粒体通透性转变（PT）和线粒体膜电位（MMP）的破坏，这是死亡程序的早期必经步骤[35]. 我们进一步检测了NO治疗后AA和CA TN乳腺癌细胞中MMP的变化。我们发现，暴露于NO后，AA TN乳腺癌细胞在24小时时MMP显著去极化，48小时时进一步增加（图第2页). 相反，在NO治疗下，CA乳腺癌细胞系中线粒体膜超极化（图第2页). 这些数据表明，NO诱导线粒体特异性地介导AA乳腺癌细胞的凋亡，而不是CA TN乳腺癌细胞。

NO增加氧化应激诱导AA TN乳腺癌细胞线粒体介导的凋亡

已发现NO与ROS反应，特别是与超氧物（O₂^-)产生过氧亚硝酸盐和氧化/亚硝化应激，这可能有助于MMP去极化和线粒体介导的凋亡[28]. 我们测量了NO处理细胞中丙二醛和4-羟基烯醛，它们被用作脂质过氧化和氧化应激的指标。对照细胞和NO处理细胞的浓缩裂解物使用试剂盒和制造商说明书进行比色测定，以检测丙二醛和4-羟基烯醛，如材料和方法中所述。在HCC-70（273.79±27.27%）、HCC-1806（151.04±9.38%）、MDA-MB-468（204.20±25.26%）和MDA-MB-157（218.87±40.07%）AA TN乳腺癌细胞中，使用DETA-NONOate（1mM）治疗6h时氧化应激增加（图3a年). 在所检测的任何CA TN乳腺癌细胞中，均未检测到氧化应激的显著增加（图3a年). 我们进一步用N-乙酰半胱氨酸（NAC）（一种ROS猝灭剂）预处理AA乳腺癌细胞，以确定NO处理后ROS增加是否有助于细胞凋亡。用NAC预处理细胞可显著降低HCC-1806中NO-介导的细胞死亡（67.13±1.57%）（图3亿). 免疫印迹分析表明，NAC预处理可以减弱HCC-1806细胞中NO诱导的高Bax裂解（图3厘米). 相反，在CA TN细胞系中，NAC处理以浓度依赖的方式导致细胞死亡轻微增加（图三维). 在任何一种治疗方法下，CA乳腺癌细胞中均未观察到Bax的显著裂解（图第三版). 这些数据表明，NO处理的AA TN乳腺癌中ROS水平的增加可能有助于观察到的细胞死亡。

图3

一氧化氮诱导AA乳腺癌细胞凋亡依赖于活性氧的增加。一)将接种在96孔板中的细胞用DETA NONOate（1mM）处理不同时间点（6-24h）。根据制造商的说明，使用Aldetect脂质过氧化测定试剂盒测量4-羟基烯醛水平。接种细胞汇合，用DETA NONOate（1mM）处理24h，用不同浓度（10-30mM）的N-乙酰半胱氨酸（NAC）预处理或不预处理（1h）。b条,d日)用血细胞仪进行细胞计数，用台盼蓝排除法测定细胞活力。c、 e）对Bax（下面板）的总细胞裂解物进行免疫印迹分析。数据以平均值±标准偏差表示，显著值表示为*第页 < 0.01和**第页 < 0.001

NO灭活SOD仅增加AA TN乳腺癌细胞活性氧

由于NO暴露能够增加AA TN乳腺癌细胞中的ROS水平，我们进一步检测了线粒体锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）和细胞液铜/锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD。这些金属酶是最有效的细胞内酶促抗氧化剂，已知可将活性氧水解为H2O2，H2O2进一步分解为O₂和H₂O（运行）[36]. 用DETA-NONOate（0.5-1mM）治疗24和48小时后，检测两种SOD的水平。DETA-NONOate治疗24小时后，AA或CA乳腺癌细胞中的Mn-SOD或Cu/Zn SOD水平均未出现显著下降（数据未显示）。然而，在48小时时，DETA-NONOate（0.5-1mM）导致AA中Mn-SOD和Cu/Zn-SOD的水平显著降低，但CA乳腺癌细胞中没有显著降低（图4a-c型). 相反，在一些CA细胞系中，Mn-SOD水平增加（BT-549和HCC-1395），而在另一个细胞系（MDA-MB-436）中，与no处理的对照组相比没有显著变化（图4a-c型). 通过细胞分离，我们在CA（BT-549）的线粒体中发现了大量的Mn-SOD，但在AA（HCC-70和HCC-1806）乳腺癌细胞中没有发现（图第4天). 我们没有发现AA和CA乳腺癌细胞中NOX4蛋白的水平有任何差异（图4a-d型). 通过检测线粒体部分的COX IV蛋白水平来评估线粒体的纯度（图第4天). 由于NO处理后期SOD蛋白水平的降低与ROS早期增加不一致，我们进一步检测了这些细胞中的SOD活性。我们发现暴露于NO（DETA NONOate 1mM，48h）会降低SOD活性（HCC-70:19.15±7.81%；HCC-1806:17.22±6.51%）第四版). 与AA乳腺癌细胞的下降形成鲜明对比的是，所有经NO处理的CA TN乳腺癌细胞中的SOD活性都有所增加（BT-549:3.80±2.87%；MDA-MB-231:8.63±2.06）（图第四版). 我们进一步检测了AA TN乳腺癌细胞系（HCC-1806）在短时间暴露于不同浓度NO后的SOD活性。随着NO水平的降低（DETA NONOate 500μM），我们发现SOD活性早在3h（25.01±9.94%）就下降了，一直下降到8h（72.83±7.73%），之后16-24h恢复到接近对照（图第4页). 随着NO（DETA-NONOate 1mM）的升高，SOD活性持续下降，直至8h（76.91±5.2），之后仍低于对照组（图4克). 由于较低浓度的NO降低AA乳腺癌细胞系的增殖，我们进一步研究了其对Mn-SOD和Cu/Zn-SOD以及各种增殖（cyclin D1和PCNA）、凋亡（Bax和Bcl2）和氧化应激（NOX4）标记物的影响。我们没有发现任何被检测细胞系中Mn-SOD或Cu/Zn-SOD水平的变化，而用低浓度NO处理的MDA-MB-468细胞中cyclin D1水平下降（图5a、b). 此外，虽然Bax和Bcl2没有发现显著变化，但两种细胞系中的NOX4蛋白水平都有所下降。我们进一步检测了用非特异性蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺处理细胞不同时间点后这些蛋白质的稳定性。在MDA-MB-468、MDA-MB-231和BT-549乳腺癌细胞中未观察到Cu/Zn SOD水平的显著变化，而在HCC-1806细胞中，先是下降，然后是在放线菌酮治疗的后期增加（图5立方英尺). 此外，经环己酰亚胺处理后，Mn-SOD水平无显著差异。然而，与经环己酰亚胺处理的CA乳腺癌细胞相比，AA中的Bcl2水平迅速下降并保持较低水平（图5立方英尺). 然而，在这些细胞中Bax的水平保持不变，而在环己酰亚胺处理的后期，Bax的裂解增加（图5立方英尺). 经环己酰亚胺处理的所有细胞系的增殖细胞核抗原（PCNA）水平保持不变（图5立方英尺). 上述数据表明，NO使SOD失活，以增加AA乳腺癌细胞中的氧化应激，而不是CA TN乳腺癌细胞。此外，AA和CA TN乳腺癌细胞中Mn-SOD或CU/Zn-SOD的稳定性没有显著差异。

图4

一氧化氮使SOD失活，从而增加AA TN乳腺癌细胞中的ROS。一-c（c）)DETA-NONOate（0.5 mM和1mM）处理细胞48小时后，以β-actin为对照，对NOX4、Mn-SOD和Cu/Zn-SOD进行免疫印迹分析。d日)对照组和DETA NONOate（1mM）处理的细胞按照制造商的说明使用试剂盒进行细胞分离，以分离细胞质和线粒体部分。进一步对这些组分进行NOX4、Mn-SOD和Cu/Zn-SOD的免疫印迹分析。COX4被用作线粒体部分纯度的阳性对照。e（电子）,（f）,克)用DETA-NONOate（0.5 mM和1mM）处理不同时间点（3-36小时）的细胞，按照制造商的说明使用试剂盒进行SOD活性测定。数据以平均值±标准偏差表示，显著值表示为*第页 < 0.01和**第页 < 0.001

图5

一-b条)用不同浓度（1-300μM）的DETA NONOate处理细胞系（AA和CA TN细胞）24小时，然后收获、裂解并进行BAX、Bcl2、Mn-SOD、Cu/Zn SOD、NOX4、cyclin D和PCNA的免疫印迹分析。以β-actin为对照。至少重复了三次实验，并显示了具有代表性的数据。c（c）-（f）)用不同浓度的环己酰亚胺（CHX）处理细胞后，对BAX、Bcl2、Mn-SOD、Cu/Zn-SOD，NOX4、cyclin D和PCNA进行免疫印迹分析。以β-actin为对照

NO治疗降低AA乳腺癌细胞中乳腺癌干细胞含量

乳腺癌干细胞（MCSC）是乳腺肿瘤中未分化细胞的一小部分，与乳腺癌的发生和发展密切相关[37]. 大多数治疗和化疗药物被发现杀死更多分化细胞，而MCSC逃避这些治疗[38]. MCSCs群体存在异质性，具有高醛脱氢酶1（ALDH1）活性和CD44（细胞表面标记物）表达增加[39]. 有报道称，ALDH1在非洲女性乳腺肿瘤中高表达[40,41]. 我们发现ALDH1在所有检测的3个AA TN乳腺癌细胞中都有高表达，NO治疗显著降低了这些细胞中ALDH1的表达（图第6页). ALDH1在AA TN乳腺癌细胞中的较高表达与其在CA TN乳腺癌细胞中的低得多的基础表达形成鲜明对比（图第6页). 然而，我们发现CA乳腺癌细胞中CD44的表达更高，并且随着NO的治疗而进一步增加（图第6页). 我们进一步通过Western blot证实，经NO治疗的AA TN乳腺癌细胞系中caspase裂解的增加与MCSC人群的减少同时发生（数据未显示）。

图6

一)使用DETA NONOate（1mM）处理24和48小时的乳腺癌细胞株，通过免疫印迹分析检测MCSC标记物ALDH1和CD44。b条-c（c）)乳腺癌细胞株HCC1806和HCC70用DETA NONOate（1mM）治疗24-36h。对照细胞和处理过的细胞悬浮在ALDH1检测缓冲液中，并使用荧光活化细胞分析法进行ALDH1活性检测。对照细胞和处理细胞中的死亡和活细胞均被门控以检测ALDH1活性。d日)将MDA-MB-231细胞系悬浮在ALDH1检测缓冲液中，并使用荧光激活细胞仪分析ALDH1活性。e（电子）-（f）)对照组MDA-MB-231和HCC1806细胞用PE偶联CD44染色并进行细胞分析。克-我)乳腺癌细胞（2x10⁶)在裸鼠皮下（腹侧位）植入DETA NONOate（1mM）治疗前后24小时，并监测肿瘤体积15周(n个 = 5). 数据表示为平均值±SD（**，第页 ≤ 0.01, ***,第页 ≤ 0.001，ns：无显著性）

我们进一步测量了DETA-NONOate治疗后（1mM，24-36h）HCC-1806和HCC-70中ALDH1的活性。我们发现HCC-1806（11.8%）和HCC-70（11.3%）细胞中ALDH1的基础活性较高（图6b-c类). NO暴露后，两种细胞系HCC-1806（6.8%）和HCC-70（5.6%）的ALDH1活性均显著下降（图6b-c类). NO处理后，两种细胞系均出现大量死亡细胞。我们无法在MDA-MB-231细胞中检测到任何ALDH1活性（图6天). 另一方面，大量MDA-MB-231细胞（17.4%）表达CD44，这在HCC-1806细胞中未检测到（图第6e-f页)。

我们进一步研究了NO对AA和CA乳腺癌细胞的治疗是否影响肿瘤形成体内为此，我们植入了对照组和经NO-处理的（24小时）AA和CA TN乳腺癌细胞（2x10⁶)裸鼠皮下注射（腹侧位），并监测肿瘤体积15周。与未经处理的对照细胞相比，经NO处理的AA TN乳腺癌细胞显著降低了裸鼠的肿瘤体积（图6b、c). 这些结果与在CA TN乳腺癌细胞中观察到的结果形成鲜明对比，在CA TN乳腺癌细胞中，与AA TN乳腺癌细胞的类似治疗组相比，NO治疗导致形成更大的异种移植物（图6天). 因此，我们的数据表明，NO治疗AA TN乳腺癌细胞可显著降低MCSC含量和异种移植形成。

讨论

AA女性的乳腺癌通常具有侵袭性特征和独特的生物学特性。在本研究中，我们报告了NO诱导的亚硝化应激优先促进所有AA细胞的凋亡，但不促进CA TN乳腺癌细胞的凋亡。具体而言，NO处理诱导AA细胞中促凋亡Bax的裂解和caspase-3活性的增加，但在CA TN乳腺癌细胞中没有。有趣的是，在AA乳腺癌细胞中观察到抗凋亡Bcl2下降和MMP去极化。与此形成鲜明对比的是，在NO处理的CA来源乳腺癌细胞中，Bcl2水平保持稳定，甚至随着MMP的超极化而升高。在对亚硝基化应激敏感的AA乳腺癌细胞中，有一种应激反应基因HO-1的早期诱导。在任何暴露于NO的CA细胞中，HO-1水平都没有变化，这进一步表明它们对亚硝化应激不敏感。在另一项研究中，与MDA-MB-468（AA TN来源）乳腺癌细胞相比，NO治疗可诱导MDA-MB-231（CA TN来源[42]. NO似乎在CA乳腺癌细胞中引发促癌反应，这与AA细胞中的致死信号形成鲜明对比。我们之前已经证明，低浓度NO除了增加MDA-MB-231细胞的增殖外，还激活哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）以增加蛋白质的翻译[18]. 研究还表明，ROS/RNS驱动DNA加合物的连续过程，该加合物可交联并促进脂类和蛋白质的翻译后修饰，从而提高存活率、免疫抑制和抑制凋亡[43]. 这些可能是NO影响CA乳腺癌细胞促癌行为的一些机制。

在我们的研究中，ROS的基础水平在两个种族的乳腺癌细胞中具有可比性。然而，NO治疗仅能增加AA TN乳腺癌细胞的ROS。ROS的增加与AA TN乳腺癌细胞中总（线粒体和胞浆）SOD活性的降低相一致。我们的研究进一步表明，AA和CA TN乳腺癌细胞中SOD的稳定性没有显著差异。有报道称，AA中SOD活性降低与亚硝基化应激增加有关，而CA脐静脉内皮细胞（HUVEC）中则没有[44]. 高血压患者血浆中NO和SOD活性也呈明显的负相关[45]. 与类似的CA患者组相比，年龄较大的AA患者以及自发性早产患者的SOD活性较低[46]. AA和CA患者乳腺肿瘤中Mn-SOD Ala-9Val多态性没有差异[47]. 然而，据报道，AAs线粒体SOD中10T/9T内含子3多态性的频率存在显著差异[48]. 虽然AA人群对NO-介导的SOD失活的敏感性得到了很好的证明，但对SOD失活性的分子机制和后果仍知之甚少。

AA和CA乳腺肿瘤生物学的显著差异表明，肿瘤细胞和这些肿瘤发展的微环境都存在差异。尽管生物学上存在显著差异，但这些肿瘤的治疗策略没有太大差异。低分化乳腺癌中的肿瘤浸润巨噬细胞表达活性iNOS，可促进血管生成，增大肿瘤大小并导致患者生存率降低[16]. 最近，通过选择性iNOS和pan-NOS抑制剂，在两个CA乳腺癌细胞系MDA-MB-231和BT-549中靶向内源性iNOS，被发现可有效降低小鼠模型中的肿瘤体积[49].

我们以前的研究表明，AA TN乳腺癌细胞优先利用精氨酸合成多胺[21,22]. 精氨酸酶和一氧化氮合酶（NOS）分别与细胞精氨酸竞争产生多胺和NO[21,22]. 研究发现，细胞中精氨酸酶活性的升高通过与NOS竞争以增加L-鸟氨酸，从而降低了NO的细胞可用性。我们已经证明精氨酸酶在AA乳腺癌细胞中的表达上调，AA乳腺癌依赖多胺维持生存和增殖[21]. 因此，利用精氨酸代谢的种族差异有可能提供选择性药物靶点，从而有效降低CA和AA TN乳腺肿瘤的侵袭性。尽管有充分证据表明AA TN乳腺肿瘤具有独特的生物学特性，但迄今为止还没有发现或利用潜在的药物靶点来降低疾病的严重性。

使用NO诱导AA乳腺肿瘤细胞凋亡的潜力似乎有望用于治疗干预。根据细胞类型的不同，NO有望成为减少肿瘤体积的治疗剂[50,51]. NO-供体的治疗潜力取决于其在最佳浓度下以暂时调节的方式释放NO以杀死肿瘤细胞的能力。许多潜在的NO-施主包括有机亚硝酸盐-甘油三亚硝酸盐（GTN）、金属-硝基苯络合物-硝普钠（SNP）、S-亚硝基谷胱甘肽（GSNO）和重氮二元酸盐。研究表明，GTN可诱导结肠癌细胞凋亡，抑制B16F10小鼠黑色素瘤细胞低氧介导的转移潜能，并提高人前列腺癌异种移植物的化疗敏感性[52——54]. 二乙烯二氮芥二元酸盐（NONOates）被发现是一种有效的化学预防剂，可预防骨转移性乳腺癌和侵袭性乳腺癌细胞株[55]. 不幸的是，许多NO-供体缺乏靶向规范和控制释放动力学，因此无法测试其疗效体内考虑到NO的双重作用以及缺乏理想的NO捐赠者，我们在技术上没有配备使用NO进行治疗。

结论

AA和CA TN乳腺癌细胞对亚硝化应激的反应不同，表明它们的生物学特性不同。AA TN乳腺肿瘤对亚硝基化应激介导的细胞凋亡的敏感性增加表明，应探索NO作为治疗剂的潜力。治疗策略应根据疾病的独特生物学特性进行调整。

缩写

AA，非裔美国人；CA，白种人；TN，三阴性；NO、一氧化氮；超氧化物歧化酶；活性氧；醛脱氢酶1；乳腺癌干细胞；雌激素受体；孕酮受体；一氧化氮合酶；RNS，反应性硝化应激；MKP-1，MAP激酶磷酸酶-1；末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记；HO-1，血红素加氧酶1；线粒体膜电位；PT，线粒体通透性转换；NAC，N-乙酰半胱氨酸