摘要
涉及弓状核小胶质细胞激活的下丘脑炎症被认为是肥胖、胰岛素和瘦素抵抗的一种新的潜在机制。然而,激活的小胶质细胞是否影响ARC神经元的活动,进而影响基础和激素诱导的食物摄入,尚不清楚。我们发现在ARC小胶质细胞中表达的toll-like receptor-4(TLR4)的激动剂脂多糖抑制了大多数食欲刺激基因相关蛋白/神经肽Y神经元的放电活动,而增加了大多数食欲不振原阿片黑素神经元的活动。通过抑制小胶质细胞功能或阻断TLR4受体,阻断了刺鼠基因相关蛋白/神经肽Y(但不包括前阿片黑素皮质素)神经元中的脂多糖效应。最后,我们报告了抑制下丘脑小胶质细胞改变了基础食物摄入,也阻止了对ghrelin的中枢致食欲反应。我们的研究支持TLR4介导的小胶质细胞信号通路在控制ARC神经元活动和进食行为中的主要作用。
中枢神经系统(CNS)和免疫系统之间的相互作用能够协调对其他生理过程的免疫反应,从而最大限度地提高机体对复杂环境的适应性(1). 现在人们认识到,除了适应性免疫外,复杂的神经免疫相互作用还牵涉到先天免疫系统(2)其激活会引起各种行为变化,包括食物摄入量减少、疾病和抑郁(2,三). 然而,在特定行为的背景下,先天免疫与大脑相互作用背后的精确的大脑电路和信号仍然难以捉摸。
除了感知外周先天免疫反应(三)大脑拥有自己的先天免疫系统,其中小胶质细胞是主要的先天免疫效应细胞。因此,小胶质细胞是损伤和感染的第一反应者,释放包括细胞因子和趋化因子在内的促炎信号(4).
下丘脑弓状核(ARC)在食物摄入和体重调节中起着关键作用(5,6)它与包括肥胖和糖尿病在内的代谢性疾病直接相关。两种主要的ARC神经元类型包括食欲原性促食欲基因相关蛋白(AgRP)神经元[与神经肽Y(NPY)共存]和厌食原性阿片黑皮素(POMC)神经元。这些神经元是循环瘦素和ghrelin的靶点,它们的激活会对进食和代谢产生相反的影响(7,8).
肥胖和糖尿病的实验模型中报告了下丘脑ARC炎症的证据,包括活化的小胶质细胞、小胶质细胞IgG积聚和增强的炎症细胞因子,支持小胶质细胞介导的炎症与肥胖、胰岛素和瘦素抵抗之间的病理生理学联系(9——14). 然而,将活化的小胶质细胞与ARC功能改变联系起来的确切细胞机制,最终反映在ARC神经元输出改变中,尚不清楚。此外,即使在更基本的层面上,激活的小胶质细胞是否会导致ARC神经元活动的变化,目前还没有进行探索。
脂多糖(LPS)是一种常用的激活小胶质细胞的炎症原(15). 类收费受体-4(TLR4)是模式识别受体大家族中的一员,在先天性免疫反应中起关键作用(16),是主要的LPS受体(17,18). TLR4主要表达于脑小胶质细胞(19,20),调节小胶质细胞对脂多糖的反应(21——23). 重要的是,下丘脑TLR4的激活触发了促炎细胞因子的产生,干扰了瘦素和胰岛素信号(19,24).
在这项研究中,我们分析了ARC中小胶质细胞激活在单个神经元和整个系统水平上的功能后果。利用大鼠和小鼠ARC神经元的全细胞斑贴记录,我们研究了TLR4介导的小胶质细胞激活对POMC和AgRP/NPY神经元放电活动的影响。此外,我们测试了体内下丘脑小胶质细胞功能的丧失是否影响了中枢神经系统对基础和饥饿素诱导的食物摄入的控制。
材料和方法
动物
数据来自购自Harlan Laboratories的雄性Wistar大鼠(200–250 g)和杂合转基因NPY绿色荧光蛋白(GFP)雄性/雌性小鼠(20–35 g)(在C57BL上回交7代[Horvath等人(31)]由Matthias Tschöp博士(德国慕尼黑亥姆霍兹中心糖尿病和肥胖研究所)提供。这些动物被安置在一个温度可控的环境中,光照12小时,暗照12小时(7:00灯亮是)并且可以随意获得食物和水。本研究中使用的所有程序均按照佐治亚州摄政大学机构动物护理和使用委员会指南进行。
电生理学
如前所述,获得了传统的全细胞补丁灯记录(25). 简言之,将雄性大鼠(n=29)或GFP-NPY小鼠(n=16,雄性=8,雌性=8)麻醉并收获大脑。使用振动切片机切割包含弓状核的冠状下丘脑切片(230μm)。对于电生理记录,将切片转移到潜水式记录室,持续灌注(~2 mL/min−130–32°C),标准人工脑脊液(ACSF)以95%O的气体混合物起泡2和5%CO2.贴片吸管内溶液包含(毫摩尔):K-葡萄糖酸130、KCl 20、HEPES 10、EGTA 0.5、Mg-ATP 0.9和Na-GTP 0.3。pH值缓慢滴定至7.25–7.30。在用脂多糖(LPS-EK,10μg/mL;目录号tlrl-eklps;InvivoGen)激活TLR4之前和期间,在电流灯模式下,记录用盐酸米诺环素(Minoc,100μM;Sigma-Aldrich)预处理或未预处理(1–2 h)的切片中的点燃活性。点火率(定义为峰值数,秒−1)在对照期(用药前2分钟)和LPS给药后1分钟开始的一段时间(8-9分钟)内进行测量。如果在对照组和LPS给药组之间观察到放电率变化至少10%,则认为神经元有反应。详细方法见补充材料和方法.
荧光免疫组织化学
为了研究小胶质细胞在ARC内的分布,雄性大鼠(n=4)被深度麻醉并经心灌注0.01 M PBS(150 mL,pH 7.4),然后灌注4%多聚甲醛(350 mL)。大脑被移除,并在4°C下用4%多聚甲醛固定3小时。通过短角−2.12和−2.8之间ARC核的连续冠状切片(25μm)(26)用冷冻器切割并在初级抗体中孵育24小时(表1)兔小胶质细胞标记物抗电离钙结合接合器分子1(IBA1)抗体(019–19 741,1:200;Wako)用于IBA1单染色,豚鼠抗AgRP多克隆抗体(ab181493,1:500;Abcam)和山羊抗POMC抗体(ab32893,1:300;Abcam)用于AgRP和POMC共染色。为了确定TLR4是否在ARC小胶质细胞中表达,在山羊抗IBA1抗体(ab5076,1:1000;Abcam)和兔抗TLR4抗体(ab13556,1:200;Abcam)的混合物中培养不同的切片。与一级抗体反应后,在(a)荧光标记的二级抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories)驴抗兔Cy5(1:250,用于IBA1)、驴抗豚鼠Cy3(1:250;用于AgRP)和马抗血清荧光素异硫氰酸盐(用于POMC)存在下孵育4小时或马抗血清Cy5(用于IBA1)和马抗兔血清Cy3(用于TLR4)。切片也用TOTO3进行复染(1:10 000,15分钟;分子探针),然后用共焦显微镜进行安装和可视化。详细方法见补充材料和方法。
肽/蛋白质靶点. | 抗原序列(如果已知). | 抗体名称. | 制造商、目录号和/或提供抗体的个人姓名. | 饲养的物种(单克隆或多克隆). | 使用的稀释. |
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IBA1级 | 17-kDa EF手蛋白 | 抗-Iba1 | 瓦戈;019-19741 | 兔,多克隆 | 1:200 |
AgRP公司 | 小鼠AGRP内的合成肽(C末端) | 抗AgRP | Abcam;约181493 | 豚鼠,多克隆 | 1:500 |
POMC公司 | 人类POMC的C端氨基酸256–267 | 阿黑皮素原抗体 | Abcam;约32893 | 山羊,多克隆 | 1:300 |
IBA1级 | 人类Iba1的氨基酸135–147 | 抗Iba1 | Abcam;约5076 | 山羊,多克隆 | 1:1000 |
TLR4级 | 与人类TLR4氨基酸420–435对应的合成肽 | 抗TLR4 | 阿布卡姆,ab13556 | 兔子,多克隆 | 1:200 |
TLR4级 | 克隆MTS510 | 单克隆抗体mTLR4/MD2 | Invivogen;单克隆抗体mtlr4md2 | 小鼠,单克隆 | 0.1微克/毫升 |
肽/蛋白质靶点. | 抗原序列(如果已知). | 抗体名称. | 制造商、目录号和/或提供抗体的个人姓名. | 饲养的物种(单克隆或多克隆). | 使用的稀释液. |
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IBA1级 | 17-kDa EF手蛋白 | 抗-Iba1 | 瓦戈;019-19741 | 兔子,多克隆 | 1:200 |
AgRP公司 | 小鼠AGRP内合成肽(C末端) | 抗AgRP | Abcam;约181493 | 豚鼠,多克隆 | 1:500 |
POMC公司 | 人类POMC的C端氨基酸256–267 | 阿黑皮素原抗体 | Abcam;约32893 | 山羊,多克隆 | 1:300 |
IBA1级 | 人类Iba1的氨基酸135–147 | 抗Iba1 | Abcam;约5076 | 山羊,多克隆 | 1:1000 |
TLR4级 | 与人类TLR4氨基酸420–435对应的合成肽 | 抗TLR4 | 阿布卡姆,ab13556 | 兔子,多克隆 | 1:200 |
TLR4级 | 克隆MTS510 | 单克隆抗体mTLR4/MD2 | Invivogen公司;单克隆抗体mtlr4md2 | 小鼠,单克隆 | 0.1微克/毫升 |
肽/蛋白质靶点. | 抗原序列(如果已知). | 抗体名称. | 制造商、目录号和/或提供抗体的个人姓名. | 饲养的物种(单克隆或多克隆). | 使用的稀释. |
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IBA1级 | 17-kDa EF手蛋白 | 抗Iba1 | 瓦戈;019-19741 | 兔子,多克隆 | 1:200 |
AgRP公司 | 小鼠AGRP内合成肽(C末端) | 抗AgRP | Abcam;约181493 | 豚鼠,多克隆 | 1:500 |
POMC公司 | 人类POMC的C端氨基酸256–267 | 阿黑皮素原抗体 | Abcam;约32893 | 山羊,多克隆 | 1:300 |
IBA1级 | 人类Iba1的氨基酸135–147 | 抗Iba1 | Abcam;约5076 | 山羊,多克隆 | 1:1000 |
TLR4级 | 与人类TLR4氨基酸420–435对应的合成肽 | 抗TLR4 | 阿布卡姆,ab13556 | 兔,多克隆 | 1:200 |
TLR4级 | 克隆MTS510 | 单克隆抗体mTLR4/MD2 | Invivogen;单克隆抗体mtlr4md2 | 小鼠,单克隆 | 0.1微克/毫升 |
肽/蛋白质靶点. | 抗原序列(如果已知). | 抗体名称. | 制造商、目录号和/或提供抗体的个人姓名. | 饲养的物种(单克隆或多克隆). | 使用的稀释. |
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IBA1级 | 17-kDa EF手蛋白 | 抗Iba1 | 瓦戈;019-19741 | 兔子,多克隆 | 1:200 |
AgRP公司 | 小鼠AGRP内合成肽(C末端) | 抗AgRP | Abcam;约181493 | 豚鼠,多克隆 | 1:500 |
POMC公司 | 人类POMC的C端氨基酸256–267 | 阿黑皮素原抗体 | Abcam;约32893 | 山羊,多克隆 | 1:300 |
IBA1型 | 人类Iba1的氨基酸135–147 | 抗Iba1 | Abcam;约5076 | 山羊,多克隆 | 1:1000 |
TLR4级 | 与人类TLR4氨基酸420–435对应的合成肽 | 抗TLR4 | 阿布卡姆,ab13556 | 兔子,多克隆 | 1:200 |
TLR4级 | 克隆MTS510 | 单克隆抗体mTLR4/MD2 | Invivogen;单克隆抗体mtlr4md2 | 小鼠,单克隆 | 0.1微克/毫升 |
共焦成像
如前所述,使用阈值范式量化免疫荧光强度(27). 使用POMC和AgRP免疫反应作为解剖标志物,手动追踪ARC核,以描绘富含POMC(侧ARC方面)和AgRP(内侧ARC方面(28,29). 随后,使用包含目标信号(IBA1)的信道。从缺乏免疫反应信号的区域的图像中减去背景荧光,并将阈值设置为背景荧光强度的1.5倍。使用相同的标定区域获得感兴趣追踪区域内IBA1阈值信号的密度,并表示为阈值面积的百分比(即包含阈值免疫反应信号的总面积的百分比)。平均免疫反应强度也来自相同的区域,并表示为任意单位(AU)(27). 详细方法见补充材料和方法。
脑室注射Minoc和ghrelin
为了抑制小胶质细胞活性和注射ghrelin,将侧脑室内(ICV)灌注探针(引导探针)放置在侧脑室(n=29只雄性大鼠)。ICV坐标系改编自先前的研究(30). 在大鼠术后恢复10天后进行急性ICV输注Minoc(100μg/5μL载剂)和/或ghrelin(10μg/5微升载剂),并于9:00注射化合物是(灯亮后2小时)通过将注射针插入导向探头。注射后2小时和4小时测量食物摄入量。为了进行更长期的研究,ICV-Minoc输注5天。第5天,9:00注射ICV ghrelin是6小时后测量食物摄入量。
统计分析
结果表示为平均值±SEM。电生理数据采用χ分析2测试或配对吨测试,如图所示。如图所示,食物摄入研究采用单因素或双因素方差分析。相关系数采用Pearson相关检验。使用GraphPad Prism 5.0(GraphPad-Software,Inc)进行统计分析。差异被认为在P(P)< .05.
结果
TLR4信号传导对大鼠弓状核神经元亚群活性的不同调节
为了评估LPS对弓状核神经元活动的影响,我们在含有ARC的下丘脑切片中使用浸提的激动剂LPS激活TLR4,并测量记录的神经元的放电频率和膜电位的变化。对TLR4激活作出反应的ARC神经元受到刺激(21个中的11个)或受到抑制(21个中的10个)(图1,一个和B类). 为了确定这些对TLR4激活的不同反应是否是由于ARC内不同的神经化学表型引起的,我们分别记录了充满生物胞素的神经元,并根据其在细胞核内的中侧分布比较了它们的反应性。如果神经元位于第三脑室壁0–140μm范围内,则被任意归类为内侧ARC,而那些位于第三心室壁260至300μm范围的神经元则被归类为外侧ARC。我们发现,大多数神经元位于外侧ARC(11个中的9个,82%)(包括POMC免疫反应神经元)对TLR4的激活表现出兴奋性反应,而位于内侧ARC的大多数神经元(10个中的8个,80%)(包括POMC免疫阴性)对TLR4s的激活表现为抑制性反应(图1C). 外侧和内侧ARC神经元的反应类型发生率有显著差异(P(P)< .02, χ2测试)。
图1
TLR4激活对ARC神经元活动的影响。A、 从ARC神经元获得的电生理记录示例,显示了对浸泡LPS(10μg/mL)的兴奋性(左侧面板)或抑制性(右侧面板)反应。下面板显示了从上面板的下划线区域获得的扩展时间范围的动作电位。汇总在集合ARC神经元中观察到的兴奋性和抑制性神经元反应的发生率(B)或根据ARC侧面或内侧的神经元分布(C)。条形图顶部的数字是每组神经元的数量。
外侧和内侧ARC神经元TLR4激活后膜电位和放电活动的变化总结如下图2大多数外侧ARC神经元的放电频率显著增加(基线1.40±0.33 Hz;LPS:2.57±0.63 Hz;n=9),同时膜去极化(基线,−40.7±3.6 mV;LPS,−37.9±3.8 mV;n=8),以应对LPS(P(P)两个变量均<0.05,成对吨测试)(图2,一个和B类). 该组显示抑制反应的神经元数量排除了有意义的统计分析。相反,LPS后大多数内侧ARC神经元(80%,8/10)的放电频率显著降低(基线,0.59±0.06 Hz;LPS,0.22±0.06赫兹;n=8,P<0.05,成对吨试验),没有伴随膜电位的变化(基线,−43.6±4.7 mV;LPS,−43.8±6.7 mV,n=8)(图2,C类和D类). 该组中显示兴奋反应的神经元数量较少,也排除了相关的统计分析。所有接受TLR4激活的神经元的放电率百分比变化与膜电位变化的关系图未能揭示这两个参数之间的显著相关性(r2= 0.36,P(P)= .11).
图2
TLR4激活对侧位和中位ARC神经元的对比作用。显示了应用LPS(10μg/mL)后位于ARC侧面的神经元的放电活动平均变化(A)和膜电位平均变化(B)。还显示了LPS(10μg/mL)应用后位于ARC内侧的神经元的放电活性(C)的平均变化和膜电位(D)的平均变化。每组最主要反应的典型例子显示在面板A和C中。注意,LPS分别增加和减少位于外侧和内侧ARC的大多数神经元的放电活动程度,P(P)<.05(成对吨在其自己的组内测试)。数据表示为平均值±SEM.*,P(P)与ACSF组相比<0.05(配对t检验)。
在选定的病例中,我们还能够将记录的生物膜填充神经元识别为POMC免疫反应性神经元(n=7)(补充图1)或POMC免疫阴性(n=6)。在大鼠中记录到的大多数ARC神经元(85%,包括POMC+、POMC-和未经免疫鉴定的神经元)在超极化保持电位(−90 mV)的去极化幅度增加时表现出较大的低阈值去极化(LTD)(补充图1). 其余细胞(未显示)的膜电位基本呈线性变化,但未观察到明显的LTD。因此,不可能根据基本的固有膜特性来区分ARC神经元表型。总之,我们的结果表明,POMC神经元表现出兴奋性反应,而AgRP神经元对TLR4激活表现出抑制性反应。
TLR4激活引起小鼠AgRP/NPY神经元的抑制反应
为了更确切地解决细胞类型依赖性ARC对TLR4激活的反应,我们在转基因GFP-NPY小鼠中进行了记录,其中根据GFP的表达很容易识别AgRP/NPY神经元(31). 小鼠下丘脑切片中记录的GFP-NPY神经元的典型示例如所示补充图2与大鼠ARC神经元类似,当受到超极化保持电位(−90 mV)增加幅度的去极化步骤时,小鼠中的大多数GFP-NPY和非GFP-NPYARC神经元显示出较大的LTD(补充图2). 对LPS反应最灵敏的GFP-NPY神经元(16个中的14个,87.5%)表现出放电减少(基线,0.63±0.12 Hz;LPS,0.09±0.03 Hz,P(P)>0.05,配对t检验)(图3,一个和B类). 然而,这种抑制并没有伴随着膜超极化(图3C). 其余反应神经元(16个中的2个,12.5%)的放电活动增强。在这些小鼠中,只检测到两个AgRP/NPY神经元(18)都没有反应。在雄性和雌性小鼠之间比较数据时,观察到类似的LPS介导的放电活性降低(补充图3). 最后,与从大鼠ARC神经元获得的记录类似,我们未能揭示放电率百分比变化与所有GFP-NPY神经元接受TLR4激活后膜电位变化之间的强烈而显著的相关性(r2= 0.45,P(P)= .06).
图3
TLR4的激活抑制了小鼠中大多数GFP-NPY神经元。A、 在没有或存在Minoc(100μM)的情况下,ARC GFP-NPY神经元对LPS(10μg/mL)反应的发生率总结。B、 LPS对GFP-NPY平均燃烧活性影响的条形图和典型示例。C、 膜电位的平均变化。D、 Minoc存在下LPS对GFP-NPY平均放电活动影响的条形图和代表性示例。E、 膜电位的平均变化(n=神经元数量)。数据表示为平均值±SEM.+,P(P)<.05(成对吨在自己的组内测试)。*,P(P)与Minoc(无LPS)组(配对)相比<0.05吨测试)。
相反,在大多数非GFP-NPY神经元(七分之四,57.1%)中,TLR4激活引起放电活动增加(未显示)。这些数据与我们在大鼠内侧ARC-AgRP/NPY神经元中获得的结果一致(参见图1C和2安培)支持TLR4主要引起AgRP/NPY活性降低和POMC ARC神经元活性增加的一般观点。
抑制激活的小胶质细胞可防止TLR4介导的AgRP/NPY效应,但对POMC神经元无影响
研究表明,TLR4s存在于ARC的小胶质细胞中,在代谢性疾病期间其表达增加(10,12,14,19). 然而,ARC中小胶质细胞的激活是否会影响局部神经元的活动尚未被研究。因此,为了测试TLR4介导的对ARC神经元活性的影响是否通过小胶质细胞活化间接介导,我们测试了抑制小胶质细胞激活的四环素衍生物Minoc的作用(32——35). 在从小鼠已鉴定的GFP-NPY神经元获得的记录中(图3,一个,D类、和E类)我们发现,在Minoc存在的情况下,大多数GFP-NPY神经元未能表现出对TLR4激活的放电活动的改变(九分之五,55.6%)。然而,仍观察到一小部分(<2 mV)被认为是显著的膜去极化(图3E). 在这种治疗中,九个神经元中只有三个(33.3%)仍显示放电率下降(基线为0.41±0.13 Hz;LPS为0.42±0.13赫兹),且没有出现膜超极化(图3,D类和E类). 总之,GFP-NPY神经元中大多数TLR4介导的抑制反应在米诺环素的存在下被钝化,导致在比较ACSF和Minoc神经元中TLR4反应时,反应类型的发生率存在总体差异(P(P)> .05, χ2测试)。
与我们在对照条件下观察到的大鼠ARC神经元不同(即兴奋和抑制反应神经元的比例大致相等)(图1B)用Minoc预处理1-2小时的大鼠切片中TLR4的激活(参见材料和方法)导致大多数反应性神经元的放电活动增强(22/29,~76%),而少数神经元的放电活性降低(7/29,~24%)(图4A). 当我们随后根据大鼠ARC神经元的地形分布分析它们时,我们发现在Minoc存在的情况下,大鼠内侧ARC神经元反应模式发生了完全改变(图4,B类和C类). 因此,与我们在控制条件下观察到的不同(参见图1C和2摄氏度),大多数内侧ARC神经元(15个中有11个,~73%)对TLR4激活表现出兴奋性反应,其特征还包括膜去极化(基线,−39.7±2.35 mV;LPS,−33.1±2.77 mV)和放电增加(基线,1.31±0.17 Hz;LPS,2.07±0.22 Hz,P(P)两个变量均<0.05,成对吨测试)(图4,C类和D类),而仅在其余部分观察到抑制反应(15例中有4例,~27%)(图4B). 因此,对照ACSF和Minoc存在时,内侧ARC神经元反应类型的总体发生率有显著差异(P(P)> .05, χ2测试)。
图4
抑制激活的小胶质细胞可阻止TLR4介导的ARC神经元内侧而非外侧活动的抑制。用Minoc(100μM)预孵育的切片中LPS(10μg/mL)引起的兴奋性和抑制性神经元反应的发生率总结,观察到混合的ARC神经元(A)或根据ARC侧面或内侧的神经元分布(B)。条形图顶部的数字是每组神经元的数量。在用Minoc(100μM)预孵育的切片中应用LPS(10μg/mL)后,位于ARC内侧面的神经元的放电活动平均变化(C)和膜电位平均变化(D)。在用Minoc(100μM)预孵育的切片中应用LPS(10μg/mL)后,位于ARC侧面的神经元的放电活动平均变化(E)和膜电位平均变化(F)。每组中最主要响应的代表性示例显示在面板C和E中的迹线中。数据表示为平均值±SEM.+,P(P)<.05(成对吨在自己的组内测试);*,P(P)与Minoc(无LPS)组(成对)相比<0.05吨测试)。
相反,Minoc不影响外侧ARC神经元对LPS的反应(图4,B类和E类). 因此,与我们在对照条件下观察到的情况类似,TLR4激活在14例中的11例(~79%)中诱导兴奋性反应,其特征是显著的膜去极化(基线,−42.89±1.91 mV;LPS,−38.06±1.68 mV)和放电增加(基线,0.92±0.20 Hz;LPS(1.50±0.29 Hz),P(P)两个变量均<0.05,成对吨测试)(图4,B类,E类、和F类). 因此,对照ACSF和Minoc存在时,外侧ARC神经元反应类型的总发生率没有显著差异(P(P)> .9, χ2测试)。综上所述,我们的结果表明,在小胶质细胞抑制剂的存在下,AgRP/NPY神经元中TLR4激活引起的抑制性(而非兴奋性)反应在很大程度上减弱,支持小胶质细胞对ARC中神经元调节的细胞类型依赖性贡献。
TLR4介导小鼠弓状神经元LPS抑制作用
TLR4是主要的LPS受体,主要在小胶质细胞中表达,并介导小胶质细胞对LPS的反应(19,20). 然而,考虑到LPS对ARC神经元活动的不同细胞类型依赖性效应以及小胶质细胞对这些效应的细胞类型依赖贡献,我们研究了TLR4对LPS介导效应的确切贡献。为此,我们使用纯化的抗小鼠TLR4单克隆抗体(表1),先前证明可有效中和TLR4对LPS的反应(36). 由于该抗体仅与小鼠TLR4反应,因此在从雄性C57BL小鼠(n=4)获得的ARC脑片上进行了实验。切片在含有0.1μg/mL mTLR4抗体的ACSF中预孵育约3.5小时,然后如上所述进行LPS应用。如所示图5,在TLR4抗体存在的情况下,对LPS的抑制反应被消除(11个中的1个),而兴奋反应仍然存在(11个中的6个)(图5A). 这种情况下的平均射速变化如所示图5B(兴奋性反应值:基线,0.46±0.19 Hz;LPS,0.82±0.29 Hz,P(P)<.05,成对吨试验),不伴有膜电位的变化(图5C). 这些结果与Minoc(大鼠和小鼠)的结果基本一致,Minoc的抑制反应减弱,但兴奋反应减弱。
图5
TLR4阻断可消除小鼠ARC神经元中LPS诱发的抑制反应。A、 小鼠ARC神经元对LPS(10μg/mL)反应的发生率总结,该反应在含有纯化的鼠抗单克隆抗体(mTLR4抗体,0.1μg/mL,)的预培养切片中进行。B、 条形图总结了LPS对平均放电活动的影响。C、 存在mTLR4抗体时膜电位的平均变化(n=神经元数量)。数据表示为平均值±SEM.+,P(P)<.05(成对吨在自己的组内测试);*,P(P)与mTLT4(无LPS)组(配对)相比<0.05吨测试)。
ARC中小胶质细胞的地形分布和TLR4的表达
小胶质细胞标记物IBA1对小胶质细胞的免疫染色(37)用于评估ARC内小胶质细胞的分布,并通过POMC和AgRP免疫染色进一步描绘。虽然我们的结果显示POMC体细胞染色较强,但AgRP仅标记薄突起,如前所述,这些突起在含ARC的POMC神经元的侧面富集(参见图6A) (28,29). 因此,为了定量目的,我们比较了外侧POMC富集区和内侧POMC阴性区的IBA1染色(参见图6,A1类——A3号). 有趣的是,尽管在整个ARC中观察到了IBA1染色的小胶质细胞,但它们似乎分布不均,优势显著,如较高的IBA1密度和强度信号所示(POMC,58.5±4.1 AU;非POMC,49.9±3.7 AU,P(P)<0.05,成对吨与更内侧的POMC阻塞区相比,ARC的外侧POMC富集区(参见图6B).
图6
大鼠ARC中小胶质细胞的地形分布和小胶质TLR4的表达。A1,显示ARC中AgRP(红色)和POMC(绿色)免疫荧光染色的典型共焦显微照片。A2,相同的图像显示了用于量化的POMC(外侧)和非POMC(内侧)区域的线条。A3,IBA1阳性(白色)小胶质细胞的免疫荧光染色。A3中的数字表示所显示的弧形的每个子区域的IBA1密度值。B、 显示POMC和非POMC ARC区域之间IBA1染色强度(左侧面板)和密度(右侧面板)的平均差异的汇总数据。C、 共焦显微照片显示ARC中TLR4(红色)和IBA1(蓝色)染色。注意小胶质细胞中存在TLR4染色(紫色)。数据表示为平均值±SEM.*,P(P)与POMC组相比<0.05(成对吨测试)。3V,第三脑室。
为了确定ARC小胶质细胞是否表达TLR4,我们使用小鼠脑组织,因为我们测试的TLR4抗体与小鼠组织反应(它也与人类组织反应,但不适用于本研究)。如中的典型示例所示图6C,我们在ARC内IBA1染色的小胶质细胞内发现了相当程度的TLR4阳性染色。
小胶质细胞抑制改变对ghrelin的摄食反应
上述结果表明,小胶质细胞激活影响ARC神经元的兴奋性,主要抑制AgRP/NPY神经元。接下来,我们研究了神经介导的小胶质细胞活动本身是否影响食物摄入以及中枢应用ghrelin的促食欲生成作用。ICV给药ghrelin(10μg/每5μL载体),这是一种基于先前研究的致食欲浓度(38)注射后2小时和4小时增加食物摄入量(P(P)<0.05和P(P)分别<.01,Bonferroni的事后检验,双向方差分析)(图7A). ICV单用Minoc(每5μL载具100μg)影响食物摄入量。注射后2小时已经观察到食物摄入量增加的强烈趋势,这在4小时时具有统计学意义(P(P)<.01,Bonferroni的事后检验,双向方差分析)(图7A). 重要的是,注射后2小时联合服用米诺克+生长激素释放肽未能增加食物摄入量,尽管在4小时时观察到食物摄入额增加(与对照组相比)(P(P)<.05,Bonferroni的事后单因素方差分析),该效果与单独使用Minoc或ghrelin观察到的效果没有差异(图7A). 这些结果表明,小胶质细胞抑制本身增加了食物摄入,干扰和/或阻断了ghrelin的促食欲增强作用。为了进一步测试这种情况是否属实,我们进行了另一组实验,其中小胶质细胞活性在注射ghrelin之前(ICV-Minoc 5天)受到抑制。如所示图7B,接受ICV生理盐水5天的小鼠表现出对急性ICV注射ghrelin的食物摄入量显著增加(P(P)<.05,Bonferroni的事后检验单向方差分析)。相反,在接受ICV Minoc治疗5天的小鼠中,已经观察到基线食物摄入量增加的趋势,ICV ghrelin未能引起食物摄入额的进一步增加(P(P)=NS,Bonferroni的事后测试单向方差分析(图7B).
图7
ICV米诺环素对基础食物摄入量和ghrelin介导的食欲生成作用的影响。A、 总结显示急性ICV注射生理盐水(对照组)、米诺克、ghrelin或米诺环素和ghrelin联合用药的平均效果(每组n=4)。在急性给药后2小时和4小时测量食物摄入量。*,P(P)<.05,**,P(P)与各时间对照组相比,<.01(Bonferroni的事后检验)。B、 在先前接受ICV注射盐水或ICV Minoc的大鼠中,急性ICV注射生理盐水或ghrelin对食物摄入的影响。组包括(急性-慢性)生理盐水(n=6)、胃促生长素生理盐水(n=6)、生理盐水Minoc(n=4)和胃促生长素Minoc(n=5)。在急性生理盐水/ghrelin输注6小时后测量食物摄入量。数据表示为平均值±SEM.*,P(P)<.05 vs生理盐水组(Bonferroni的事后试验)。
讨论
利用大鼠和GFP-NPY转基因小鼠的斑贴灯电生理和免疫组织化学方法,我们报告了以下内容:1)急性接触LPS后,大多数POMC神经元产生兴奋性反应,AgRP/NPY神经元产生抑制性反应;2) 当小胶质细胞功能被抑制或TLR4受体被阻断时,AgRP/NPY(而非POMC)神经元的LPS效应被阻断;3) TLR4受体在ARC小胶质细胞中表达,尽管小胶质细胞遍布ARC,但在POMC富集区观察到主要分布;下丘脑小胶质细胞功能的抑制影响对ghrelin的促食欲反应。综上所述,我们的结果表明,ARC小胶质细胞TLR4的激活可引起细胞类型选择性神经元反应,导致AgRP/NPY活性的显著抑制。尽管之前的研究评估了LPS/TLR4介导的炎症对ARC c-FOS和神经肽mRNA测量的影响(39——42)据我们所知,这是首次研究证实小胶质细胞激活对已确定的ARC神经元群放电活动的影响。最后,我们的结果支持小胶质细胞在调节基础食物摄入量和ghrelin对其的调节中发挥积极作用。
我们研究的一个主要发现是TLR4激活在ARC神经元的放电活动中引起了对比反应。为了确定这些是否代表选择性ARC神经元群中的差异效应,我们使用了互补方法的组合。首先,我们根据神经元在ARC内的地形位置来区分神经元,这是基于一个公认的事实,即ARC的内侧面富含AgRP/NPY神经元,而外侧面富含POMC神经元(43). 考虑到这种地形隔离并非绝对的,我们还确定了记录神经元亚群的事后神经化学表型(44). 这种方法的一个局限性是,在全细胞膜片钳记录期间进行细胞透析会降低细胞质免疫反应性,从而导致低吞吐量。此外,尽管POMC抗体标记神经元体,但AgRP抗体主要标记轴突突(例如,补充图1和图6)从而排除了AgRP/NPY免疫反应神经元的免疫化学鉴定。尽管存在这些技术局限性,但我们仍然能够确定记录的一部分神经元为POMC免疫反应性神经元,其对TLR4激活的反应模式与大多数外侧ARC神经元的报告相似(即放电活动增强)。为了进一步限制这些限制,我们还获得了转基因小鼠GFP-NPY ARC神经元的记录。考虑到所有这些联合方法,我们的结果强烈表明LPS介导的兴奋性反应主要在POMC神经元中观察到,而抑制性反应主要出现在AgRP/NPY神经元中。我们的结果与之前的研究一致,即LPS治疗减少了NPY ARC神经元中禁食诱导的c-FOS表达的数量(39)同时增加ARC POMC和可卡因和安非他明调节转录物mRNA水平(42).
此外,一个重要的观察结果是,在一些情况下,LPS介导的放电活动的变化并没有与膜电位的变化同时发生。事实上,观察到这两个参数之间的相关性很弱,这表明除膜去极化/超极化之外的其他机制也有助于LPS效应。由于本研究中的大多数ARC神经元都是自发活动的,因此影响动作电位波形的电导变化,以及突触后电位的频率或随机性变化,都可能影响放电的程度,而不一定引起膜电位的持续变化。
除了LPS对POMC和AgRP/NPY神经元之间神经元活动的差异净效应外,我们的结果还表明,这些效应背后存在差异细胞基质和信号机制。我们发现Minoc对小胶质细胞的抑制作用(33)在很大程度上减弱了TLR4介导的AgRP/NPY神经元的抑制作用,而没有实质性影响POMC神经元的兴奋性反应。然而,需要考虑的一个重要警告是,尽管Minoc被广泛用作小胶质细胞抑制剂(32——35),也可以针对其他信号通路(32,45,46). 进一步支持小胶质细胞的参与,我们发现TLR4的阻断也在很大程度上减弱了对LPS的抑制性(但不是兴奋性)反应。如上所述,先前的研究表明TLR4主要在小胶质细胞中表达(19,20),我们在对IBA1染色的ARC小胶质细胞的研究中证实了这一事实(图6). 因此,综上所述,我们的结果强烈支持ARC中小胶质细胞TLR4受体的激活导致AgRP/NPY神经元抑制。
与这些作用相反,我们发现LPS介导的ARC放电活性的增加(POMC神经元中观察到的主要反应)并不依赖于激活的小胶质细胞(即,未被Minoc或TLR4抗体阻断)。我们的研究发现,大鼠和小鼠ARC神经元的Minoc效应之间存在显著差异。在大鼠AgRP/NPY神经元中,Minoc不仅减弱了抑制反应,而且还揭示了对TLR4激活的兴奋反应(即Minoc前后的主要反应分别从80%的抑制转变为73%的兴奋)。因此,尽管大鼠ARC中的AgRP/NPY神经元能够接受LPS的抑制(通过TLR4小胶质细胞依赖机制)和刺激(通过TLR小胶质细胞独立机制),但抑制效应占主导地位。相反,在小鼠AgRP/NPY神经元中,Minoc治疗在很大程度上阻断了对TLR4激活的抑制性反应,导致更多的无反应神经元,而不会改变兴奋性反应的发生率。目前,我们无法解释这些物种依赖性差异对ARC神经元的Minoc效应。
尽管目前的结果强烈支持ARC中小胶质细胞TLR4激活的细胞类型分化反应,但重要的问题仍有待回答。例如,与小胶质细胞介导的主要TLR4对AgRP/NPY神经元的功能作用相反,我们发现小胶质细胞主要分布在外侧POMC丰富的ARC区域。这些结果表明,激活的小胶质细胞下游的机制,例如神经元对小胶质细胞衍生信号的不同敏感性,可能促成了这种细胞类型选择反应。鉴于已知活化的小胶质细胞释放出过多的分子,包括细胞因子、趋化因子和各种神经活性物质,如一氧化氮和活性氧物种,因此,解决它们对此处报告的效应的相对贡献超出了本工作的范围。基于Borner等人最近的研究(47)然而,LPS以诱导型一氧化氮合酶依赖的方式抑制了食欲生成型ghrelin敏感的ARC神经元,可以合理推测诱导型N一氧化氮O合酶一氧化氮对TLR4介导的小胶质细胞抑制AgRP/NPY神经元的作用。
同样重要的是要认识到,在Minoc和TLR4受体阻断后,LPS兴奋性反应持续存在。这些结果表明,小胶质细胞TLR4依赖性机制参与了这些作用的介导。已有证据表明TLR4对脂多糖具有依赖性反应,包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的激活(48)神经酰胺活化蛋白激酶(49). 显然,未来的研究需要研究TLR4介导的ARC神经元活性作用的确切信号机制。
基于我们的结果,TLR4介导的小胶质细胞激活对AgRP/NPY神经元产生了显著的抑制作用,预计小胶质细胞活化后会产生促厌食效应。这与LPS诱导炎症所介导的公认的厌食效应相一致(50)以及认为这些效应是与中枢黑素皮质素系统相互作用的结果(51,52).
最后,为了更深入地了解小胶质细胞对ARC神经元活动的作用,我们进行了体内研究,评估了小胶质细胞在基础食物摄入量以及ghrelin的促食欲作用中的作用。我们的结果表明,Minoc对小胶质细胞的抑制作用(32——35)就其本身而言,在2-4小时内,增加食物摄入量并干扰和/或阻断中央注射ghrelin的促食欲增强作用。基于这些结果,再加上我们的体外研究表明小胶质细胞对AgRP/NPY神经元的激活具有抑制作用,我们有理由推测小胶质细胞原位张力性抑制AgRP/NP Y活性。因此,Minoc对小胶质细胞的抑制将导致AgRP/NPY活性的增加以及ARC的促食欲输出,这足以阻断ghrelin随后的促食性刺激。不幸的是,由于全细胞膜片钳技术记录神经元的时间有限,我们无法在体外测试Minoc本身是否在观察到食物摄入量变化的时间范围内影响ARC神经元的放电活动。虽然还需要进一步的研究来彻底阐明小胶质细胞对食物摄入影响的潜在机制和介导者,但我们的体外和体内联合方法确实支持小胶质细胞TLR4介导的途径在调节ARC神经元活动以及食物摄入中的主要作用。
最后,重要的是要考虑到,在这项工作中,我们评估了小胶质细胞激活对ARC神经元活动的急性影响。因此,在持续激活小胶质细胞后,如在局部炎症过程的既定阶段,所报告的反应是否持续,尚待确定。最近的一项研究表明,在高脂肪饮食诱导的ARC炎症过程中,小胶质细胞的激活在最初阶段起到了神经保护机制的作用,而在慢性阶段则会导致神经元损伤(11). 因此,小胶质细胞介导对ARC神经元活动的影响也可能取决于炎症过程的时间进程。
总之,我们的结果表明,急性TLR4介导的ARC小胶质细胞激活对AgRP/NPY神经元的放电活动具有抑制作用。此外,我们还发现,体内小胶质细胞的抑制会导致食物摄入量增加,从而干扰ghrelin的促食欲作用。因此,综上所述,我们的研究支持TLR4介导的小胶质细胞信号通路在控制ARC神经元活动和进食行为中发挥重要作用。
致谢
这项工作得到了国家心脏、肺和血液研究所国家健康研究所HL112225(给J.E.S.)赠款和亥姆霍兹联盟ICEMED(成像和治疗环境代谢疾病)的部分支持,通过亥姆霍茨协会的倡议和网络基金。
披露摘要:作者无需披露任何信息。
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