本文中提到：

介绍

总的来说，约80%的原发性肝癌是肝细胞癌(1). HCC的发病是隐蔽的，并且放射治疗、化疗和外科治疗不可靠改善患者预后，导致高死亡率(1,2). 恶性增殖和逃逸细胞凋亡是肝癌最重要的病理特征(1,三). 因此，研究分子细胞恶性增殖和凋亡的调控机制HCC是开发有效治疗方法所必需的干预措施。

sirtuin家族是III类组蛋白烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）脱乙酰酶(4). 以前的研究已经证明sirtuin家族成员通过以下途径调节基因表达脱乙酰化各种非组蛋白，有助于重要的生理活动，包括细胞分化，细胞凋亡、衰老和能量代谢，并发挥重要作用在各种肿瘤的形成和发展中(5——8).Sirtuin（SIRT）6定位于核异染色质中，并且展示腺苷二磷酸核糖转移酶和脱乙酰酶活动(9). 目前SIRT6对肝癌残留细胞增殖和凋亡的影响不清楚，SIRT6在促进或抑制中的作用肿瘤发展过程中存在争议(10); 然而，SIRT6展示了潜在的肿瘤治疗靶点(11,12). 因此，SIRT6在肝癌中的研究是紧急且有价值的。

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是一种细胞膜信号转导的重要递质到内核(13).细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）和c-JunN-末端激酶（JNK）是MAPK的两个亚家族；反常的这些激酶的激活与肝癌(13).ERK的磷酸化可以激活多种靶分子，包括c-Jun、c-Fos和G1/S-特异性细胞周期蛋白D1，促进肝癌的发展(14).此外，JNK信号通路可以促进下游通路蛋白c-Jun、P53和P21诱导肝癌的增殖和血管生成肝细胞周期和凋亡的调控癌细胞(14). 因此ERK1/2信号通路的激活可能是一种机制HCC发展的基础。

本研究旨在评估这种表达研究SIRT6在不同肝癌细胞系中的作用SIRT6在细胞增殖和凋亡中的作用，进一步确定ERK1/2信号通路的参与。本研究对SIRT6在肝癌中的作用提供了新的见解潜在的潜在机制。

材料和方法

细胞培养、质粒、分组和转染

HL-7702、MIHA、Hep3B、Huh-7、MHCC-97H、MHCC-77L、，获得MHCC-LM6、MHCC-LM3、YY-8103、SK-hep-1细胞株来自中国科学院类型文化收藏科学。HL-7702细胞系为正常肝细胞系，并且作为对照组。培养HL-7702和MIHA细胞RPMI-1640介质（赛默飞世尔科技公司）；Hep3B，Huh-7，MHCC-97H、MHCC-97 L、MHCC-LM6、MHCC-LM3、YY-8103、SK-hep-1电池这些系在DMEM（Thermo Fisher Scientific，Inc.）中培养。培养基中添加10%胎牛血清（HyClone；GEHealthcare Life Sciences），并在37°C和5%的温度下培养细胞一氧化碳2细胞每2-3天传代一次。SIRT6过表达质粒，阴性对照（NC）质粒（空pcDNA3.1载体），含有小干扰RNA的质粒针对SIRT6（siSIRT6）和含有NC-siRNA的质粒由上海基因制药有限公司合成寡核苷酸如下：siSIRT6，5′-tcatgaccggctcatgaa-3′；NC-siRNA，5′-TCACCATCGGTACGTGAA-3′。Huh-7细胞株分为3组：对照组（空白）；NC或siNC（转染NC质粒或NC-siRNA质粒的细胞）；和SIRT6过表达或siSIRT6组（用SIRT6过表达或siSIRT6质粒）。进一步探索SIRT6是否影响肝癌细胞的增殖和凋亡通过调节ERK1/2通路，用10µMU0126在37°C下24小时，以及U0126处理和转染同时发生。Huh-7细胞也被分离成对照组（空白）、NC（转染NC质粒的细胞）、SIRT6（用SIRT6过表达质粒转染的细胞），U0126（用10µM U0126处理的细胞），SIRT6+U0126（转染细胞使用SIRT6过表达质粒并用10µM U0126处理）使用ERK1/2测量细胞增殖的组抑制剂U0126。使用Lipofectamine™进行转染2000转染试剂（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，根据制造商的协议。以下转染48h后，细胞用于随后的实验。

细胞增殖试验

使用细胞计数分析细胞增殖药盒-8（Sigma-Aldrich；Merck KGaA）在0、24和48小时后转染。根据制造商协议。电池（3×10三细胞/孔）然后在37°C的96 well培养板中培养1小时使用微孔板阅读器在450 nm处测量密度（OD）（Multiskan™；赛默飞世尔科技公司）。

通过流测量细胞凋亡细胞术

转染48小时后，Huh-7细胞用PBS洗涤并用0.25%胰蛋白酶解离2分钟37°C。电池（1–5×105)以800×g离心5次min并收集。使用Annexin V-FITC凋亡染色/检测试剂盒（Abcam），195µl膜联蛋白V结合溶液，向细胞中添加6µl Annexin V和4µl碘化丙啶，并且然后用吸管轻轻混合。细胞在室内培养在黑暗中保持20分钟的温度，并立即使用流式细胞仪（BD FACSCanto II；BD Biosciences）和FACSDiva检测细胞凋亡的软件版本6.1.2（BD Biosciences）费率。流式细胞术显示晚期凋亡细胞位于右上象限，早期凋亡细胞都在右下象限。凋亡率为早期和晚期凋亡率。

平板克隆形成分析

收集转基因细胞并接种到一个100毫米的培养皿，浓度为200个细胞/培养皿将G418（700µg/ml；Abcam）添加到培养基和混合液检测阳性细胞克隆3周，直到可见细胞克隆出现。新鲜培养基每3次更换一次天。然后丢弃上清液，轻轻地将细胞用PBS清洗两次。将细胞与甲醇固定15分钟室温下，在室温。然后用自来水缓慢清洗细胞并干燥。对培养皿上的每个细胞克隆进行计数在光学显微镜下拍摄（放大倍数，×40）。

通过反向评估mRNA水平转录定量PCR

使用TRIzol提取总RNA®（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）和1微克RNA使用iScript™cDNA将每个样本转录成cDNA合成试剂盒（Bio-Read Laboratories，Inc.）。相反转录反应在42°C下进行15分钟，然后在85°C下通过逆转录酶灭活15秒。快速使用了Start Universal SYBR-Green Master工具包（Roche Diagnostics）执行qPCR。用于反应的引物见表I反应体系为以下各项：2X SYBR-Green Master Mix（12.5µl）；cDNA模板（2µl）；前向底漆（10µM；1µl）；反向底漆（10µM；1µl）；和ddH2O（8.5微升）。qPCR的进行如下：95°C持续10分钟，然后在95°C下40次循环15秒，在60°C下循环1分钟在CFX96 Touch™系统（cat。编号6093；生物实验室）。第2个-ΔΔCq方法(15)用于计算样品中相对mRNA表达；GAPDH被用作内部参考。

表一。 定量用底漆PCR。

表一。

定量用底漆PCR。

基因	底漆
SIRT6公司	传真：5′-GCAGTCTCCAGTGTGT-3′
	回复：5′-CACATGGTCCAGACTCCGT-3′
Bcl-2型	传真：5′-ttgaggagagtgaacattcggtg-3′
	回复：5′-AGGTTCTGCGGACTTAGGTC-3′
Bax公司	传真：5′-GCGTGCTCAAGCGCATC-3′
	回复：5′-CCAGTTAAGTTGCCGTCAGAA-3′
GAPDH公司	传真：5′-ATGGTGAAGGTCGGAA-3′
	回复：5′-tggaagatgatgggctt-3′

[一]SIRT6，西尔图6; F、 向前；R、 相反。

提取总蛋白和西方印迹法

收集细胞并用PBS和RIPA清洗缓冲液（北京太阳生物科技有限公司）根据制造商的协议添加以溶解细胞。然后在4°C和16000×g下离心细胞15分钟，以去除细胞碎片和上清液，总蛋白收集。总蛋白的浓度使用Pierce™BCA蛋白质检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Inc.）。将标准蛋白质稀释至1、0.5、0.25、0.125和0.0625 g/ml然后分别将2µl样品和标准蛋白质添加到96英尺的钢板。随后添加BCA试剂在37°C下培养30分钟。在562 nm处检测OD使用微孔板阅读器。绘制了标准曲线然后计算总蛋白的浓度。

每个样品的总蛋白（30µg）变性在95°C下放置10分钟，通过10%SDS-PAGE在100 V持续2 h。使用湿传递电泳槽（Bio-Rad Laboratories，Inc.）90 V持续2小时，然后在室内用5%的脱脂奶封闭1小时温度。然后在4°C下将膜培养过夜以下主要抗体：抗SIRT6（1:2000；类别号。ab191385；Abcam）；抗劈开蛋白酶-3（Asp175；1:2000；类别号。9664; Cell Signaling Technology，Inc.）；抗Bcl-2（1:2000；类别。编号ab32124；Abcam）；抗Bax（1:2000；分类号ab32503；Abcam）；抗GAPDH（1:2000；目录号ab181602；Abcam）；抗ERK1/2（1:2000；目录编号ab17942；Abcam）；和抗磷酸化（p） -ERK1（T202）+ERK2（T185；1:2000；目录号ab201015；Abcam）。用PBS-0.05%吐温20（PBST；北京索拉比奥科技有限公司）5分钟，以及辣根过氧化物酶缀合的第二抗体（1:2000；猫。编号：ab6721；添加了Abcam）。然后培养膜RT时持续1小时，并使用Pierce™ECL Plus对条带进行可视化western印迹底物（Thermo Fisher Scientific，Inc.）在PBST中进行三次冲洗。进行密度测定使用带有Image Lab软件版本的Bio-Read ChemiDoc系统6.0（Bio-Read Laboratories，Inc.）。

统计分析

使用GraphPad Prism 7.0软件分析数据（GraphPad软件公司）。所有数据均为平均值±标准偏差。单向方差分析，然后进行Tukey的事后检验用于组间比较。P<0.05被认为是表示统计显著性。

结果

SIRT6在肝癌细胞中过度表达线

探讨SIRT6在肝癌细胞中的表达线路、MIHA、HL7702、Hep3B、Huh-7、MHCC-97H、MHCC-77L、MHCC-LM6、，购买了MHCC-LM3、YY-8103和SK-hep-1细胞系通过RT-qPCR分析测定SIRT6的mRNA表达。作为在中显示图1，的SIRT6 mRNA在Hep3B、Huh-7、MHCC-97H、MHCC-77L、，MHCC-LM6、MHCC-LM3、YY-8103和SK-hep-1细胞的表达显著高于对照组与HL-7702细胞、正常人肝细胞相比上调设为对照组（P<0.01）。结果表明肝癌中SIRT6的表达升高。

图1。 肝癌细胞SIRT6的mRNA表达。SIRT6在不同肝癌细胞和正常细胞系中的表达为通过逆转录定量PCR分析确定。数据表示为平均值±标准偏差**P<0.01与HL-7702相比。SIRT6，sirtuin 6；肝癌，肝细胞癌。

SIRT6的过度表达增加了Huh-7细胞的增殖

研究上调表达的影响SIRT6对肝癌细胞增殖和凋亡的影响Huh-7细胞的增殖、克隆效率和凋亡在SIRT6过度表达后进行评估。的过度表达Huh-7细胞表达SIRT6 mRNA和蛋白（P<0.01；图2A和B)、和转染Huh-7细胞的增殖显著在24和48小时时，与对照组或NC组相比增加转染后（P<0.05）；图2C). 克隆效率提高SIRT6过表达组与对照组或NC组相比组间比较（P<0.01）；图2E);然而，SIRT6对细胞凋亡率没有显著影响过度表达(图2D). 这个结果表明SIRT6的过度表达可能促进肝癌增殖；然而，其对细胞凋亡的影响需要进一步调查。

图2。 增殖、凋亡和克隆SIRT6过度表达后Huh-7细胞的效率。（A）反向测定SIRT6的mRNA表达转录定量PCR分析。（B） 蛋白质水平通过western blotting测定SIRT6。（C） 细胞增殖转染12、24和48小时后，使用细胞计数试剂盒-8分析。（D） 转染细胞的凋亡流式细胞术测定。（E） 克隆形成分析和克隆效率相对于对照。数据显示为平均值±标准偏差*与对照组相比，P<0.05，**P<0.01。SIRT6，sirtuin 6；NC，阴性对照。

SIRT6的敲除降低了增殖，增加Huh-7细胞的凋亡率

为了进一步确定SIRT6在肝癌中的作用沉默SIRT6对细胞增殖和凋亡的影响对Huh-7细胞进行了研究。SIRT6表达在转染siSIRT6后Huh-7细胞中被抑制（P<0.01）；图3A和B).此外，siSIRT6组的细胞增殖与对照组和si-NC组相比显著降低在24和48小时时（P＜0.05；图。3C公司). 此外，转染siSIRT6的克隆效率与对照组和si-NC相比，细胞数量显著减少组间差异有显著性（P<0.01）；图。第三方). 细胞凋亡率在siSIRT6组与对照组比较（P<0.01；图3D). 总的来说，结果表明SIRT6的下调降低了肝癌细胞增殖和凋亡增加对过度表达后观察到的结果的影响SIRT6。

图3。 增殖、凋亡和克隆SIRT6敲除后Huh-7细胞的效率。（A） 信使核糖核酸通过反向确定的SIRT6表达式转录定量PCR分析。（B） 蛋白质水平通过western blotting测定SIRT6。（C） 细胞增殖转染12、24和48小时后，使用细胞计数试剂盒-8分析。（D） 转染细胞的凋亡流式细胞术测定。（E） 克隆形成测定和克隆效率相对于对照。数据显示为平均值±标准偏差*与对照组相比，P<0.05，**P<0.01。SIRT6、sirtuin 6；NC，阴性对照；siSIRT6，小干扰抗SIRT6的RNA。

内在凋亡途径SIRT6过度表达后的抑制和激活分别在Huh-7细胞中敲除

评估固有凋亡的活性Bcl-2和Bax的mRNA表达通过RT-qPCR分析，以及Bcl-2、Bax和用western印迹法测定裂解caspase-3的含量。是的揭示了SIRT6过度表达中Bcl-2的表达和对照组或NC组相比，该组显著上调Bax和裂解caspase-3的表达为显著下调（P<0.05；图4A、C和E). 相反的结果是在siSIRT6介导的SIRT6敲低后观察到（P<0.01；图4B、D和F). 结果表明SIRT6的过度表达下调了内源性肝癌细胞凋亡途径，而沉默SIRT6诱导相反的效果。

图4。 Bcl-2、Bax、，过表达或肝细胞癌细胞中SIRT6的沉默。（A） 信使核糖核酸SIRT6后Huh-7细胞中Bcl-2和Bax的表达过度表达。（B） Bcl-2和Bax在Huh-7细胞中的mRNA表达SIRT6静音后。（C） 裂解酶-3的蛋白质水平，SIRT6过度表达后Huh-7细胞中的Bcl-2、Bax。（D）Huh-7细胞中裂解caspase-3、Bcl-2、Bax的蛋白质水平SIRT6静音后。（E） （C）的量化。（F）（D）的量化。（G） ERK1/2和p-ERK1/2的蛋白质水平SIRT6过度表达后的Huh-7细胞。（H） 蛋白质水平SIRT6沉默后Huh-7细胞中的ERK1/2和p-ERK1/2。（一）（G）的量化。（J） （H）的量化。数据包括表示为平均值±标准偏差*P<0.05，**P＜0.01。SIRT6，sirtuin 6；NC，阴性对照；siSIRT6，小型干扰RNA对抗SIRT6；p-，磷酸化。

ERK1/2信号的激活该途径可能参与SIRT6介导的Huh-7细胞的增殖

调查影响的机制SIRT6对增殖和凋亡、ERK1/2表达的影响和p-ERK1/2在过表达或敲低后测定SIRT6的。此外，ERK1/2信号通路在通过测量ERK1/2抑制剂U0126对SIRT6-过度表达增殖的影响Huh-7细胞。结果表明，ERK1/2的磷酸化SIRT6过度表达组显著增加（P<0.01）；图4G和I)、和与对照组和NC组相比，siSIRT6组降低组间比较（P<0.01）；图4H和J).此外，还发现Huh-7细胞的增殖SIRT6+U0126组与与SIRT6组相比（P<0.05），且显著降低U0126组与对照组比较（P<0.05；图5). 总的来说，结果提示ERK1/2信号通路被激活SIRT6的过度表达和SIRT6基因敲除的下调，ERK1/2信号通路可能参与SIRT6介导的肝癌细胞增殖调控。

图5。 SIRT6-过度表达的增殖ERK抑制后的肝细胞癌细胞发送信号。转染SIRT6的Huh-7细胞的增殖过表达质粒和/或用ERK抑制剂U0126处理使用细胞计数试剂盒-8测定。数据包括以平均值±标准偏差表示*与对照组相比P<0.05；^与SIRT6+U0126相比，P<0.05。SIRT6，sirtuin 6。

讨论

在本研究中，SIRT6的表达是在各种HCC和正常肝细胞系中测定改变SIRT6表达对增殖和观察Huh-7细胞的凋亡情况。此外ERK1/2信号通路参与SIRT6调节研究了Huh-7细胞的增殖，提供了新的深入了解治疗肝癌。

本研究结果表明SIRT6在各种肝癌细胞系中过度表达。跑等(16)另据报道，SIRT6在Huh-7、HepG2、PLC/PRF/5、SMMC-7721、Hep3B和SK-Hep-1细胞系。总的来说，这些研究表明SIRT6在许多肝癌细胞系中的过度表达，表明研究SIRT6在肝癌中的价值。

本研究表明Huh-7细胞SIRT6后增殖和克隆效率提高过表达，并且在SIRT6沉默了。SIRT6过度表达的细胞凋亡率组与对照组无显著差异组；然而，在siSIRT6后显著增加转染。因此，结果表明SIRT6与增殖呈正相关，并且与肝癌细胞凋亡呈负相关。冯et（等）铝(17)报告SIRT6促进肝癌细胞的致瘤性。歌曲等(18)透露了以下内容CRISPR/Cas-9敲除SIRT6后，肝癌细胞数量减少生存能力和侵略性。这些报告与本研究的观察结果；然而，王等(19)证明了SIRT6减毒HepG2和HCCLM3细胞的过度表达增殖。同样，张和秦(20)报道SIRT6被击倒促进HepG2细胞的生长，而SIRT6抑制HepG2细胞生长。建议这可能是由于SIRT6在不同的HCC细胞中发挥不同的功能HepG2是一种肝母细胞瘤细胞系(21); 然而，这需要进一步调查(22,23).

内在凋亡途径受Bcl-2蛋白家族，涉及线粒体外膜通过Bax渗透（MOMP）(24). MOMP导致发布最终促进细胞凋亡的膜间间隙蛋白凋亡小体形成，导致caspase-9参与，以及caspase-3和−7激活导致细胞凋亡(24,25). 因此Bcl-2、Bax和cleaved-caspase-3是激活的指示物内在凋亡途径(26,27).肿瘤细胞通过多种机制抑制凋亡，包括促进Bcl-2表达或下调促凋亡细胞Bax等蛋白质(28,29). 隋等(30)报告Rab31的过度表达Huh-7细胞通过增加Bcl-2/Bax比率促进生长。本研究表明，Bcl-2的表达是上调，而Bax和裂解的胱天蛋白酶-3的水平SIRT6过度表达后下调，与SIRT6沉默后观察到的影响。结果提示内在凋亡途径的激活可能是与SIRT6的表达呈负相关(31).

ERK是一种值得注意的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶MAPK家族(32). 异常ERK的激活导致一系列靶点的上调基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和血管内皮生长因子，促进增殖和侵袭各种肿瘤细胞(33,34).结果表明ERK1/2信号通路被激活SIRT6过度表达并被下调SIRT6。使用ERK1/2信号通路后抑制剂U0126，SIRT6过度表达诱导Huh-7增加细胞增殖减弱。黄等(35)显示帕西林促进Bcl-2通过paxillin介导的ERK激活激活与小鼠肿瘤形成疗效相关的研究结直肠癌。白等(12)也报道了过度表达SIRT6促进非小细胞肺的迁移和侵袭癌细胞通过ERK1/2/MMP-9途径。这些报告表明SIRT6的过度表达可以激活ERK1/2通路因此抑制固有的凋亡途径，促进HCC的发展。相反，Wang等(19)观察到SIRT6降低HepG2和HCCLM3细胞中p-ERK的表达。张和秦(20)透露了SIRT6的过度表达抑制ERK1/2，并且抑制U0126途径减弱了SIRT6过度表达。因此，需要进一步调查确定SIRT6和ERK1/2信号的确切作用HCC中的通路。

SIRT6是一种NAD（+）依赖性脱乙酰酶。A上一个研究确定SIRT6蛋白为潜在药物靶点(36). 研究已取得进展SIRT6结构及其抑制剂具有改善的生物功能抑制作用的分子STIR6已被发现(37——39).目前的研究结果表明，SIRT6是肝癌的治疗；然而，这项研究也具有某些缺点。进一步选择Huh-7细胞实验中，它们表现出最高的SIRT6表达8株肝癌细胞系；然而，这些增殖和凋亡如果多个HCC细胞系使用了。应在未来的研究中进行动物实验验证当前发现体内此外，ERK参与许多信号通路的转导，包括MAPK、PI3K/AKT和STAT途径。它被证明了SIRT6通过调节ERK促进肿瘤的发展磷酸化；下游机制应在随后的研究。

总之，SIRT6调节了增殖和通过ERK1/2通路调节肝癌细胞凋亡，影响内在凋亡途径的激活。这个目前的研究表明，SIRT6可能是肝癌基因治疗；然而，SIRT6在肝癌中的作用需要进一步验证。

致谢

不适用。

基金

没有收到资金。

数据和材料的可用性

研究期间生成的分析数据集可从相应作者处获得请求。

作者的贡献

CZ、YY和KT为研究的概念和设计。QH和KT参与了数据采集、数据分析和解释。CZ和YY起草并对原稿进行了批判性修改。所有作者都给出了最终结果批准将要发布的版本，并同意负责工作的各个方面，确保与工作的准确性或完整性相关调查并解决。

道德批准和同意参与

不适用。

患者同意发布

不适用。

竞争性利益

作者声明他们没有竞争对手利益。

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