介绍
酒精性肝炎（AH）是一种急性炎症可导致高发病率和高死亡率的综合征(1). AH是一种严重的肝损伤与急性肝细胞功能障碍和慢性肝细胞功能障碍相关最终导致死亡的肝衰竭(2). 现有证据表明AH酒精之间复杂相互作用的结果代谢、炎症与先天免疫(三). 慢性或活性酒精患者虐待有可能患上AH，有30-40%某些严重病例一个月后的死亡率(4). 然而，皮质类固醇或己酮可可碱是目前唯一的药物治疗选择导致约50%的存活率(5).酒精性肝病（ALD）是世界范围内常见的肝病急性AH的特点是巨噬细胞炎症细胞因子对细菌的反应不成比例脂多糖(6). 酒对肠道也有影响，有助于肠道通透性增加与细菌变化微生物区系(7). 人类肠道中含有大量促进新陈代谢的微生物消化和肠道微生物群的变化与肝脏疾病相关(8). 此外，以前的证据表明内毒素血症与ALD密切相关循环内毒素来源于肠道菌群和肠道屏障功能障碍可导致肠道通透性增加(9).
目前，有报道称microRNAs（miRs）在ALD中发挥重要作用(10). 某些miR（如miR-223、miR-155miR-125）表现出异常的miRNA谱受酒精影响，并与阿尔德(11). miR-182用于在AH的疾病严重程度和肝损伤中起关键作用AH的潜在治疗靶点和生物标志物(12). 之前的一项研究表明miR-122富含肝细胞，与急性酒精诱导的肝损伤和miR-155调节炎症ALD和靶向Toll样受体（TLR）信号转导与促炎和抗炎细胞因子(13). 如前所述，TLR信号通路在许多疾病中起作用，包括神经炎性疾病、酗酒和慢性炎症(14). miR-141是确定参与上皮-间充质的过程过渡(15)，这是肝细胞癌（HCC）的减少和miR-141可抑制肝癌细胞的生长和转移(16). 此外，黄先生et（等）铝(17)已确定miR-141-3p在调节肝癌细胞的侵袭潜能。此外，miR-141似乎在活动性腹泻患者的肠道炎症中起作用C-X-C基序趋化因子5下调导致溃疡性结肠炎（CXCL5）表达(18).然而，关于miR-141在AH中的作用的研究很少。因此，本研究希望调查miR-141在肠损伤和肠内毒素血症中的作用AH及其与部分TLR4介导信号的相互作用通路。本研究旨在验证以下假设：miR-141可以通过以下途径抑制TLR通路的激活靶向TLR4，从而减轻AH的肠道损伤并抑制IETM的发生。
材料和方法
道德声明
所有涉及的动物实验均符合临床伦理委员会批准的原则徐州医科大学附属淮安医院（中国淮安）。为了尽量减少使用的动物数量以及它们各自的数量痛苦。
研究对象
共45只C57BL/6雄性小鼠（6周龄；重量18-22克）由实验动物中心提供北京大学健康科学中心（中国北京）和随机分为正常组（10只小鼠）和AH组（35只老鼠）。正常组小鼠喂食Lieber-DecarliAH组小鼠喂食无酒精液体利伯-癸醇。这两种液体含有相等的卡路里含量。小鼠被保存在一个特定的无病原环境中动物实验室，湿度40-70%，24±2°C，昼夜人工照明周期（白天：上午08:00至下午08:00）。这个验证AH模型的标准如下(19)：小鼠表现出蓬乱和头发暗淡，活动减少，反应迟缓，体重减轻增益。酒精喂养6周后，对5只小鼠实施了安乐死分别在正常组和AH组。这个通过以下方法观察肝组织的病理改变苏木精和伊红（H&E）染色以确定成功构建了模型。剩下的老鼠是随机选择并禁食12小时腹腔注射2%戊巴比妥钠（50 mg/kg）然后收集1ml的心血，在真空管中混合（Becton、Dickinson和Company），600×g离心5分钟温度为4°C，保存温度为-20°C。肠道组织收集于离肛门3厘米，其中一部分保存在液氮中另一部分固定在10%中性福尔马林中24小时室温下，然后用梯度醇脱水（100、95、80和70%，各浸泡2分钟），在60°C放置12小时，并埋入2小时以供进一步使用。
动物分组
根据mmu-miR-141序列网址：www.miRbase.org网站和RNA序列设计原理，miR-141无关序列（5′-UAGAAAUGGAGUAGCAAUGAU-3′），miR-141模拟序列（5′-UAGAAAUGGUCUACAAU-3′）和miR-141抑制剂序列（5′-AUUGUGACUAGACACAUCUUA-3′）的设计和合成上海基因化学有限公司扩增的靶片段和线性表达质粒pcDNA3.1（−）（Invitrogen；ThermoFisher Scientific，Inc.）酶消化后巴姆HI和后面的III（Invitrogen；赛默飞世尔Scientific，Inc.）在16°C下通过T4 DNA连接酶反应过夜。接下来，将产物与DH5α活性细胞（CB101；天根生化科技有限公司）在冰上放置30分钟42°C保持90秒，然后再次在冰上保持5分钟。接下来，混合物是补充800µl溶原肉汤（LB）液体培养基不含抗生素，在37°C下培养45分钟，重新悬浮在200中µl不含抗生素的LB液体培养基，然后放置在MAC培养板上（分类号HB8458；希望生物技术含抗生素（氨苄西林）在37°C下维持12-16小时。第二天，选择阳性克隆并测序。这个未能转化的细胞无法在MAC上生长培养板；未经重组质粒转化的细胞MAC培养板上出现红色，重组细胞质粒转化在MAC培养板上呈白色。这个白色菌落是所选阳性克隆。
C57BL/6小鼠进一步分为7组：正常组（未经任何处理的正常小鼠）、空白组（AH未经治疗的小鼠），阴性对照组（NC组，AH小鼠注射空白质粒），miR-141模拟组（注射AH小鼠miR-141抑制剂组（注射AH小鼠使用miR-141抑制剂）、TLR4mAb组（注射TLR的AH小鼠通路抑制剂TLR4mAb）、miR-141抑制剂+TLR4mAb组（AH与5只小鼠共同注射miR-141抑制剂和TLR4mAb的小鼠）在每组中。用2%戊巴比妥钠麻醉小鼠，四肢仰卧在手术台上进行固定并注射通过尾静脉用质粒（50nM）。总共4周治疗后，所有小鼠禁食12小时采集血液，在真空管中混合（Becton、Dickinson和公司），在4°C下604×g离心5分钟，并在−20°C。在离肛门3厘米处收集肠组织，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，用4%福尔马林固定室温24h，石蜡包埋切片(3-5µm） 供进一步使用。
双荧光素酶报告基因测定
预测miR-141的可能靶基因在microRNA.org网站和靶点序列获得了。TLR4的3′非翻译区（UTR）为扩增并克隆到pmirGLO（E1330；Promega Corp.）荧光素酶命名为pTLR4野生型（Wt）。miR141的结合位点使用在线数据库（microRNA.org）和变异了。TLR4的3′UTR突变形式也被克隆到pmirGLO载体构建pTLR4-mutant（Mut）。pRL-TK矢量表达雷尼利亚荧光素酶（分类号E2241；PromegaCorp.）被视为内部参考。使用脂多糖胺®2000转染试剂（Invitrogen；赛默飞世尔科技公司），miR-141模拟或miR-141NC分别与pTLR4-Wt或pTLR4-转染到293T细胞（CRL-1415；美国型培养物收藏）。以下转染36 h后，荧光检测器（Glomax20/20；Promega Corp.）检测荧光素酶活性。比率萤火虫荧光素酶雷尼利亚萤光素酶被用来计算荧光素酶的相对活性。
H&E染色
共5个石蜡包埋肠组织从每组中选出，并切成5块-µm系列部分。在60°C下孵育1小时后，切片用二甲苯I和二甲苯II脱蜡5分钟。然后将切片梯度酒精脱水（酒精浓度为70、80、95100%，每次2分钟）并用蒸馏水清洗2次每次5分钟。水合后，切片被染色常规H&E（北京索拉比奥科技有限公司）室温下3分钟，用自来水冲洗5分钟，用70%和80%乙醇脱水（各5分钟），用二甲苯I清除和II（各5分钟），并用中性香脂密封。最后透射偏光显微镜（XP-330；上海炳宇光学仪器有限公司）用于观察病理改变截面，然后根据达到Geboes的得分标准等(20) (表我). 每组共选择10个截面取平均值。
 | 表一病理判断标准肠道损伤。 |
表一
病理判断标准肠道损伤。
| 组织学外观 | 不 | 灯光 | 中等 | 严重 |
|---|
| 粘膜损伤 | 0 | 1 | 2 | 三 |
| 地穴破坏 | 0 | 1 | 2 | 三 |
| 粘膜出血 | 0 | 1 | 2 | 三 |
| 间质的损伤 | 0 | 1 | 2 | 三 |
| 炎症细胞渗透，渗透 | 0 | 1 | 2 | 三 |
血清内毒素、D乳酸的活性酸、二胺氧化酶（DAO）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）
血清内毒素、D乳酸和从每组5只小鼠的血清中测定DAO。这个用改性底物偶氮染料测定内毒素含量方法使用上海生化研究所购买的试剂盒。使用721进行比色检测分光光度计（上海精密科学仪器公司）。改良酶检测D乳酸分光光度法。D乳酸标准溶液（69806）乳酸脱氢酶（D-LDH；61309）购自Sigma-Aldrich；默克公司。DAO由邻二茴香胺测定试剂法。盐酸卡达韦林（目录号D9143），邻二氨基吡啶（目录号540765），DAO标准溶液（目录号。77332）和辣根过氧化物酶（目录号MAK037）来自Sigma-Aldrich；默克公司。血清中ALT的测定使用使用ALT试剂盒（目录号SEA207Mu；上海超燕生物科技有限公司）。手术是根据试剂盒协议进行实验重复3次。
免疫组织化学
共5只嵌蜡小鼠肠道随机选择各组组织和切片（3-4µm） 都准备好了。这些部分占3%H（H）2O（运行）2，用二甲苯I和II脱蜡（10分钟每个），用梯度酒精脱水（酒精浓度为70，80、95和100%各2分钟），并用蒸馏水2清洗次，每次5分钟（置于摇壶中）。部分被浸没含3%H2O（运行）210分钟后，由蒸馏水。在高压下修复抗原后90秒后，将各部分冷却至室温并清洗用PBS。用5%牛血清白蛋白封闭切片（类别号A1933；Sigma-Aldrich；Merck KGaA）在37°C下保持30分钟，以及与单克隆抗体兔在4℃孵育过夜抗鼠TLR4（目录号ab13556；Abcam）或CD14（类别。编号：ab78333；Abcam；1:100). 然后清洗各部分与生物素化山羊抗兔免疫球蛋白G孵育，辣根过氧化物酶（HRP）二级抗体（分类号SE134）；1:1000，北京索拉比奥科技有限公司）37°C下30分钟。之后，用苏木精（目录号C0105；Beyotime生物技术研究所）在室温下对细胞核进行30秒的反染色，由二氨基联苯胺（DAB；产品目录号P0202；Beyotime开发生物技术研究所）在室温下放置3-10分钟，盐酸乙醇脱水，中性香脂密封在光学显微镜下进行观察和图像采集。A类随机选取大功率透镜下共5个视场。这个免疫组织化学的判断标准如下(21)：棕黄色信号主要位于细胞质或细胞膜被认为是表示阳性染色细胞。具有TLR4和CD的阳性表达14在总数中计算细胞总数。实验重复3次。
酶联免疫吸附试验
每组取5只小鼠血清。这个肿瘤坏死因子-α（TNF-α；目录号69-25328）、白细胞介素-6（IL-6；分类号69-40133）和IL-1β（分类号69-30375）ELISA试剂盒购自武汉莫沙克生物科技有限公司血清样品（100µl） 加入到反应井中在37°C下培养90分钟。然后用100µl新鲜制备的生物素化抗体，37°C，60min。清洗后，用100µ我新鲜制备的酶结合反应物在37°C下放置30分钟，避免暴露在阳光下。基板（100µl） 然后添加到样品，并在37°C下培养15分钟，避免暴露于光线。之后，立即将停止溶液添加到终止反应。在3分钟内，OD值在450 nm波长，使用微孔板阅读器（Multiskan GO；Thermo Fisher科学公司）。实验重复3次。
逆转录-定量聚合酶链反应（RT-qPCR）
保存在液氮中的肠道组织从每组的5只小鼠中随机选择，研磨和1ml添加了三唑试剂（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，根据说明提取总RNA（总RNA也按照这种方法从细胞中提取）。用紫外线检测RNA的纯度和浓度分光光度法（分类号UV1901；上海奥赛百斯特科技仪器有限公司）。RNA被反转录成cDNA（50纳克/µl） PrimeScript™RT试剂盒（目录号RR047A；北京思远科技有限公司）。反应条件为如下：37°C下逆转录反应3次，每次15分钟，85°C下的逆转录酶失活反应5秒，然后在-80°C下低温保存以备日后使用。的引物RT-qPCR（LightCycler FastStart DNA Master PLUS SYBR Green I试剂盒；Roche Diagnostics）是使用Premier 5.0软件设计的（Premier Biosoft International），北京青科合成新野生物科技有限公司(22) (表二). 反应在ABI 7900HT RT-qPCR仪器（ABI 7900，上海普迪生物科技股份有限公司）。6号机组用作miR-141的内部参照物，GAPDH为被认为是其他基因的内部参照物。反应条件如下：在95°C下预变性30秒，40在95°C下变性5秒，在58°C下退火30秒秒，然后在72°C下延长15秒2-ΔΔCq方法(23)用于计算miR-141的相对mRNA表达，TLR4、CD14，NF-κBp65，髓系分化原发性响应88（MyD88），TIR-域适配器诱导干扰素-β（TRIF）与增殖细胞核抗原（PCNA）在肠道组织中。共设置了三口重复井对于每个样本。实验重复3次。
| 表二反向底漆顺序转录定量聚合酶链反应。 |
表二
反向底漆顺序转录定量聚合酶链反应。
| 基因 | 顺序 |
|---|
| miR-141型 | 向前地：5′-CCGGGTAACACTGTGTAAAG-3′ |
| 反向：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′ |
| 6号机组 | 向前地：5′-GCTTCGCAGCACATATAAAAT-3′ |
| 反向：5′-CGCTTCACGAATTTGTGTGTCAT-3′ |
| TLR4级 | 向前地：5′-GCAATGTTCTCTGGCAGGTA-3′ |
| 反向：5′-CAAGGGATAAGAACACGCTGAGA-3′ |
|
光盘14 | 向前地：5′-TTGCCAGGTTCAAGATC-3′ |
| 反向：5′-TGTGGACACGGAGAGA-3′ |
| NF-κBp65 | 向前地：5′-TGCGAAATGGAGCGACAGG-3′ |
| 反向：5′-AGGCCAAATGAG-3′ |
| 我的D88 | 向前地：5′-GGCATTTCACTGCTTGT-3′ |
| 反向：5′-tgacatcccatgaacctc-3′ |
| TRIF公司 | 向前地：5′-TCAGAGAGTCCATCATCGG-3′ |
| 反向：5′-TACACGCCCACTCTCTGAG-3′ |
| PCNA公司 | 向前地：5′-AGGCTGGAAGATAATGCTGATA-3′ |
| 反向：5′-CTCATTCATCTCTATGGTCACAG-3′ |
| GAPDH公司 | 向前地：5′-GCAAGTTCAACGGCACAG-3′ |
| 反向：5′-CGCAGAGACTCACGAC-3′ |
蛋白质印迹分析
液氮保存肠道组织每组从5只小鼠中随机选取。这些组织是研磨，用PBS洗涤3次，用100溶解µl纸巾RIPA裂解缓冲液（2µ克/µl；猫。编号：20101ES60；Yeasen Biotechnology Co.，Ltd.）在冰上放置5分钟，然后在9668×g，在4°C下持续20分钟。总蛋白浓度为使用比新新酸试剂盒检测（P0012-1；Beyotime研究所生物技术）。对数生长期的细胞为收集，在604×g下在4°C下离心20分钟上清液丢弃并用100溶解µl裂解物（含有20mM Tris、150mM NaCl和1%Triton）和1µ我磷酸酶抑制剂（1111111；Roche Diagnostics）30分钟冰，然后在9668×g下在4°C下离心10分钟。A总计第页，共50页µg蛋白溶解在2X SDS加载缓冲液中，在100°C下煮沸5分钟，用10%SDS-PAGE凝胶分离转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。PVDF室温下5%脱脂奶粉中的膜被堵塞1小时，用PBS清洗2分钟。培养膜用兔抗鼠一级抗体（TLR4；1:500稀释；猫。编号ab13556；光盘14, 1:100; 猫。编号：ab18322；NF-κBp65；1:2,000; 猫。编号：ab86299；MyD88；1:1,000; 猫。不。ab2064；TRIF；1:500; 猫。编号ab13810；增殖细胞核抗原；1:1,000; 猫。不。ab92552；GAPDH，1:1000；猫。编号ab8245），在4°C下过夜。之后用Tris-Buffered Saline和0.05%吐温-20清洗3次（TBST），将膜与HRP标记的次级抗体羊抗兔（1:5000；猫号ab97051；Abcam）1h.然后，用TBST冲洗膜3次，每次5分钟并使用ECL荧光检测试剂盒（目录号。C10001；皮尔斯；赛默飞世尔科技公司），X射线照射图像被捕获。凝胶成像分析系统（GelDocXR+，Bio-Read Laboratories Co.，Ltd.）用于分析OD色带。蛋白质的相对含量表示为样品的平均外径与相应样品的平均外径之比根据统计分析图，内部参考已计算。实验重复3次。
细胞治疗
每组小鼠肠道组织为用含有抗生素的PBS（1%青霉素）洗涤数次和链霉素）。肠壁是切成块<1 mm三，转移至50 ml离心管，在DMEM中清洗（Invitrogen；Thermo FisherScientific，Inc.）无血清，用吸管反复混合并在4°C下以67×g离心3分钟。上述步骤是重复，直到上清液变清。组织块是含5%胎牛血清（FBS）的DMEM悬浮液；Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）并在培养皿或培养瓶培养几天。接下来，细胞使用PBS清洗，分离0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）1-2分钟，处理再次与0.05%胰蛋白酶-EDTA混合2-3分钟，与0.05%FBS-DMEM和培养。
MTT分析
细胞悬液接种在96周密度为1×10的板4每个孔的细胞数（200µl在每个井中）。培养板放置在含有5%CO的培养箱237°C时，使用培养基每隔一天更换一次。当细胞粘附在壁上时，细胞在每个孔中培养10个µl 5 mg/ml MTT溶液（Sigma-Aldrich；Merck KGaA）4小时，然后150µ我将二甲基亚砜添加到每个孔中的细胞中搅拌10分钟，使其完全溶解。每个OD值通过自动酶在490nm波长下测定井读数仪（Bio-Read Laboratories，Inc.）。实验是重复3次。
渗透性测定
无血清DMEM用于再悬浮和调节电池密度达到3×105细胞/mlTranswell补充了200µl细胞悬液。将含有20%FBS的DMEM培养基（600 ml）添加到基底外侧室。当肠道屏障模型上皮细胞在体外形成100 mM木犀草素加入各组细胞中，在37°C下培养5%合作2用Hank的天平清洗细胞1小时盐溶液（HBSS）3次，与HBSS孵育30分钟作为孵化器，HBSS随后被丢弃。然后是用40 mg/ml荧光素钠孵育心尖室37°C持续1h。收集基底侧室上的液体并通过多功能检测荧光强度荧光分析仪。荧光素钠透射率=荧光素钠在基底侧的荧光量腔/荧光素钠在心尖部的荧光量腔室。
统计分析
所有数据均采用SPSS 21.0（IBM Corp.）进行处理统计软件。所有数据均经过测试，符合方差的正态分布和同质性。测量数据表示为平均值±标准偏差。t检验为用于两组之间的比较和单向分析方差用于多组之间的比较Tukey进行了事后测试。P<0.05被认为是表示统计上的显著差异。
结果
成功建立小鼠模型第页，共页
最初，进行H&E染色以观察小鼠肝组织。结果表明，与与正常组相比，AH组小鼠的肝组织表现出免疫细胞浸润和脂肪堆积是AH的典型特征。结果表明，小鼠模型与AH成功建立(补充图S1).
miR-141改善AH诱导的肠组织的病理改变
同时进行H&E染色观察miR-141是否会影响AH诱导的肠组织(图1). 这个正常组小鼠肠道组织结构为清晰，无异常。空白处，NC和miR-141抑制剂+TLR4mAb组，在肠壁和周围组织以及充血和周围粘膜水肿，肠道增厚，溃疡灶发现肠壁增厚，严重结肠、浆细胞、淋巴细胞出现粘膜水肿粘膜和血浆中出现中性粒细胞浸润层，有明显的坏死层和肉芽组织在溃疡表面发现。肠道组织损伤是miR-141模拟物组和TLR4mAb组有所改善，而miR-141抑制剂组加重。如所示表III，与正常组，所有其他组均表现出显著的肠组织损伤的病理评分增加（全部P<0.05）。与空白组和NC组相比，miR-141模拟组和TLR4mAb组的病理评分降低而miR-141抑制剂组表现出显著的病理评分增加（均P<0.05）。没有在病理评分方面存在显著差异miR-141抑制剂+TLR4mAb组（P>0.05）。因此，它是提示miR-141或抑制TLR途径可以改善AH引起肠组织的病理变化。
| 表IIImiR-141改善酒精中毒肝炎引起的肠道组织病理变化，反映在肠道损伤的病理评分较低。 |
表III
miR-141改善酒精中毒肝炎引起的肠道组织病理变化，反映在肠道损伤的病理评分较低。
| 组 | n个 | 病理学分数 |
|---|
| 正常 | 5 | 0 |
| 空白 | 5 | 11.00±1.14一 |
| 数控 | 5 | 11.80±1.10一 |
| miR-141模拟 | 5 |
4.60±0.55a-c公司 |
| miR-141型抑制剂 | 5 |
14.20±0.84a-c公司 |
| TLR4单克隆抗体 | 5 |
4.80±0.45a-c公司 |
| miR-141抑制剂+TLR4单克隆抗体 | 5 | 11.00±0.71一 |
miR-141降低TLR4的表达肠组织中的CD14
为了评估TLR4和光盘14免疫组化。如图所示在里面图2、TLR4和光盘14主要定位于细胞质。相比正常组TLR4和CD的表达14在所有其他组（全部P<0.05）。与空白组和NC组相比，miR-141模拟和TLR4mAb组表现出显著下调TLR4和CD的阳性表达14而miR-141抑制剂组呈显著上调的阳性TLR4和CD的表达14（均P<0.05）。曾经有过TLR4阳性表达无显著差异和CD14miR-141抑制剂+TLR4mAb组之间空白组和NC组（P>0.05）。总之，miR-141或TLR途径抑制剂可降低TLR4的表达光盘14在肠道组织中。
miR-141抑制血清中AH小鼠内毒素、D乳酸、DAO和ALT
随后，测定内毒素、D乳酸的含量测定AH小鼠血清中的酸、DAO和ALT。作为在中显示表四，已比较与正常组相比，所有其他组均表现出显著性差异血清内毒素、D乳酸、DAO和ALT水平升高（均P<0.05），表明成功建立了AH老鼠。与空白组和NC组相比，miR-141模拟组和TLR4mAb组的含量显著降低血清内毒素、D乳酸、DAO和ALT，而miR-141抑制剂组的这些水平显著升高物质（所有P<0.05），这表明过度表达miR-141或抑制TLR通路可改善肠道AH引起的损伤和IETM。没有显著差异miR-141抑制剂中所有上述指标的水平+TLR4mAb组与空白组或NC组比较（P>0.05），这是由抑制miR-141和TLR途径引起的。这个上述结果表明miR-141的过度表达通过以下途径减轻AH诱导的肠道损伤和IETM以TLR4通路为靶点。
| 表四miR-141抑制酒精中毒患者血清内毒素、D乳酸、DAO和ALT肝炎小鼠。 |
表四
miR-141抑制酒精中毒患者血清内毒素、D乳酸、DAO和ALT肝炎小鼠。
| 组 | n个 | 血清内毒素（千欧/升） | D乳酸(µ克/毫升） | DAO（千单位/升） | 高度（单位/升） |
|---|
| 正常 | 5 | 0.30±0.02 | 0.76±0.08 | 1.90±0.20 | 42.40±4.20 |
| 空白 | 5 | 0.71±0.06一 | 2.07±0.17一 | 4.50±0.40一 |
354.40±32.40一 |
| 数控 | 5 | 0.72±0.06一 | 2.12±0.16一 | 4.60±0.40一 |
351.40±31.10一 |
| miR-141模拟 | 5 | 0.47±0.04一,b条 | 1.41±0.10一-c（c） | 3.20±0.30一-c（c） |
213.70±21.30一-c（c） |
| miR-141型抑制剂 | 5 | 0.90±0.08一,b条 | 2.79±0.18一-c（c） | 6.50±0.60一-c（c） |
466.50±45.60一-c（c） |
| TLR4单克隆抗体 | 5 | 0.49±0.04一,b条 | 1.43±0.12一-c（c） | 3.30±0.20一-c（c） |
211.70±20.20一-c（c） |
| miR-141抑制剂+TLR4单克隆抗体 | 5 | 0.73±0.06一 | 2.10±0.19一 | 4.60±0.50一 |
359.40±29.70一,c（c） |
miR-141降低TNF-α、IL-6和IL-1AH小鼠肠道组织中的含量
进行ELISA以测量肠组织中的炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1AH小鼠(表五). 相比与正常组相比，所有其他组均表现出细胞内TNF-α、IL-6和IL-1β含量显著上调肠组织（均P<0.05）。与空白和NC组TNF-α、IL-6和IL-1β含量显著高于对照组miR-141模拟物组和TLR4mAb组的表达量减少，而miR-141抑制剂组显著增加（全部P<0.05）。在miR-141抑制剂中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量+TLR4mAb组与NC组或空白组比较（P>0.05）。上述结果表明miR-141的上调或抑制TLR可降低TNF-α、IL-6和IL-1的含量AH小鼠的肠组织。
| 表五miR-141降低TNF-α的含量，酒精性肝炎肠道组织中IL-6和IL-1的表达小鼠，通过ELISA测定。 |
表五
miR-141降低TNF-α的含量，酒精性肝炎肠道组织中IL-6和IL-1的表达小鼠，通过ELISA测定。
| 组 | n个 | 肿瘤坏死因子-α（pg/ml） | IL-6（微微克/毫升） | IL-1β（pg/kg） |
|---|
| 正常 | 5 | 10.8±0.92 | 47.8±3.24 | 27.5±2.4 |
| 空白 | 5 | 26.3±2.1一 | 189.5±11.26一 | 128.6±13.3一 |
| 数控 | 5 | 27.5±1.97一 |
191.16±10.64一 | 129.2±11.2一 |
| miR-141模拟 | 5 | 19.4±1.42一,b条 | 135.28±9.23一-c（c） | 84.5±8.4一-c（c） |
| miR-141型抑制剂 | 5 | 35.2±2.81一,b条 |
253.92±18.87一-c（c） | 162.7±15.8一-c（c） |
| TLR4单克隆抗体 | 5 | 19.7±1.35一,b条 | 138.31±8.79一-c（c） | 87.4±7.9一-c（c） |
| miR-141抑制剂+TLR4单克隆抗体 | 5 | 26.9±2.04一 |
190.66±12.70一 | 131.7±11.3一 |
miR-141下调TLR4、CD14、NF-κBp65、MyD88和TRIF，但上调肠组织中PCNA mRNA水平
RT-qPCR检测miR-141水平TLR4、CD的mRNA水平14、NF-κBp65、MyD88、TRIF和各组小鼠肠组织中PCNA含量。如所示在里面图3，与正常组miR-141和PCNA水平显著高于正常组下调和TLR4、CD水平14，NF-κBp65，MyD88和TRIF在其他组中显著上调（均P<0.05）。与空白组和NC组相比miR-141模拟物组和TLR4mAb组表现出显著性差异miR-141和PCNA表达上调，但显著TLR4、CD表达下调14、NF-κBp65、MyD88和TRIF（均P<0.05），而miR-141抑制剂组TLR4的表达显著增加，光盘14、NF-κBp65、MyD88和TRIF，但表达降低miR-141和PCNA（均P<0.05）。miR-141抑制剂+TLR4mAb组miR-141表达降低，但其他基因的mRNA水平没有明显差异与空白组或NC组比较（P>0.05）。所有获得的数据表明miR-141可以下调TLR4、CD14、NF-κBp65、MyD88和TRIF并上调肠组织中的PCNA。
miR-141抑制TLR4、CD14、NF-κBp65、MyD88和TRIF但增加肠组织中PCNA的蛋白质水平
进行蛋白质印迹分析以确定TLR4、CD的蛋白质水平14、NF-κBp65、MyD88、TRIF和各组小鼠肠道组织中的PCNA。如所示在里面图4，与正常组PCNA蛋白水平下降TLR4、CD的蛋白质水平14、NF-κBp65、MyD88和TRIF其他各组均增加（均P<0.05）。在与空白组和NC组相比，miR-141模拟物和TLR4mAb组呈现TLR4蛋白水平下调，光盘14然而，NF-κBp65、MyD88和TRIF显著PCNA蛋白表达上调（均P<0.05）。miR-141抑制剂组表达增加TLR4、CD14、NF-κBp65、MyD88和TRIF同时降低PCNA表达（均P<0.05）。miR-141抑制剂+TLR4mAb各组的蛋白质水平无明显差异TLR4、CD14、NF-κBp65、MyD88、TRIF和PCNA与空白组或NC组（P>0.05）。这些结果表明miR-141可抑制TLR4、CD的表达14,NF-κBp65、MyD88和TRIF，但在蛋白处促进PCNA的表达肠组织中的水平。
TLR4是miR-141的靶基因
此外，miR-141是否可以直接调节通过靶点预测程序和荧光素酶检测TLR4化验。miR-141根据生物学特性预测靶向TLR4预测网站MicroRNA.org。此外，荧光素酶报告检测结果表明，与NC组相比TLR4野生型3′UTR的荧光素酶活性显著miR-141抑制（P<0.05），而突变型3′UTR抑制未受影响(图5). 这些结果表明，miR-141能特异性结合3′UTR并下调TLR4的表达。
miR-141促进肠道活力上皮细胞
采用MTT分析来研究其效果miR-141对肠上皮细胞活性的影响。作为在中显示图6，英寸与正常组相比，所有其他组均表现出肠上皮细胞活性显著降低（均P<0.05）。与空白组和NC组相比miR-141模拟物组和TLR4mAb组表现出显著性差异miR-141增强肠上皮细胞的活性抑制剂组的生存能力显著降低肠上皮细胞（均P<0.05）。无重大影响肠上皮细胞活力的差异在miR-141抑制剂+TLR4mAb组中发现的与空白组或NC组（P<0.05）。因此得出结论：miR-141可促进肠上皮细胞的存活。
miR-141抑制肠上皮细胞
为了研究miR-141是否会影响肠上皮细胞通透性测定执行。如所示图。7，肠上皮细胞通透性增加与正常组相比的所有其他组（全部P<0.05）。与空白组和NC组相比，单元格miR-141模拟物的渗透性显著降低TLR4mAb组中miR-141显著增加抑制剂组（均P<0.05）。电池无明显变化在miR-141抑制剂+TLR4mAb中确定了渗透性组与空白组或正常组比较（P>0.05）。这个上述结果表明miR-141可以抑制肠上皮细胞的通透性。
讨论
AH表现出肝细胞损伤的特征，纤维化和炎症有效的治疗(24,25). 皮质类固醇广泛用作对AH进行了治疗，但效果差异很大AH患者主要死于感染，通过浸润中性粒细胞会对肝脏造成损伤(26). 此前，一项研究证明miRs有助于肝脏的发病疾病和可作为诊断和预后标志物以及肝病的治疗靶点(27). 因此，本研究研究miR-141在肠损伤和肠易激惹综合征中的作用AH并确定miR-141逆转肠道损伤和IETM通过靶向TLR4并抑制TLR信号通路。
酒精代谢激活先天免疫细胞包括肝脏中的单核细胞和巨噬细胞，从而促进ALD的进展和发病机制。据报道miR-27a与酒精通过细胞外信号调节诱导单核细胞激酶信号通路(28). A类先前的研究表明miR-146b改善了肠道NF-κB信号通路激活对结肠炎的损伤通路(29). miR-122，带有肝细胞中的各种功能也被报道与急性酒精性肝损伤，并在调节胆固醇代谢(13). 先前的研究表明miR-141对炎症细胞贩运的影响靶向CXCL12β的结肠炎症(30). miR-141也被报道为参与改善角叉菜胶诱导的前列腺炎通过调节Kelch-like ECH-associated蛋白1/核因子红细胞2相关因子2信号转导通路(31).
目前的研究表明miR-141通过抑制TLR改善AH肠损伤信号通路。已经发现miR-155的诱导参与炎症中tenascin-C的调节轴通过TLR信号通路(32). TLR4，一种模式识别受体在肝病发病机制中起着关键作用和CD14/TLR4受体复合物与脂多糖诱导炎症细胞因子的释放（LPS）(33). 它也是证明干扰素调节因子3导致肝脏炎症与肝细胞损伤的介导缺血再灌注损伤诱导的TLR4(34). 以前的研究表明C-C基序趋化因子20（CCL20）是一种重要的介导因子AH和TLR1的肝脏炎症和损伤肠上皮细胞导致CCL20的上调(35,36). 此外，TLR3-介导免疫生物素可以减少肠道组织损伤乳酸杆菌通过调节上皮内淋巴细胞响应(37). 另一项研究证明TLR在坏死中起保护作用通过产生抗炎细胞因子和改善肠道粘膜损伤肠内稳态(38).
此外，本研究表明miR-141抑制TNF-α、IL-6和IL-1β的表达TLR4、CD的14、NF-κBp65、MyD88和TRIF、TNF-α、IL-6和IL-1β是胶质细胞分泌的促炎细胞因子中枢神经系统中的细胞(39). IL-1β与炎症反应和促炎症形式的细胞死亡(40). 另一项研究也表明miR-141-3p模拟组表现出减少IL-1β、TNF-α、IL-6和miR-141-3p的水平能够通过下调高迁移率组box1基因，与目前一致结果(41). MyD88速度很快当M1骨髓白血病细胞分化为巨噬细胞，受IL-6刺激(42). TLR4与LPS结合诱导通过MyD88-dependent和/或MyD88-independent的信号级联激活丝裂原活化蛋白的途径激酶1和核因子（NF）-kB，从而促进产生促炎细胞因子(43).
此外，本研究表明miR-141通过靶向TLR4基因。已确定内毒素可诱导释放促炎细胞因子，因为它们可以激活TLR4/NF-κB信号通路(44). 当上皮间充质细胞过渡（ETM）发生，据报道促炎细胞因子分泌到肠腔，促进肠道功能运动障碍与肠功能衰竭(45). 一项研究表明miR-146a在内毒素诱导的交叉耐受中发挥重要作用单核细胞在体外(46). 另一项研究也证明miR-98显著减少了内毒素耐受性与调节密切相关内毒素耐受中IL-10的产生(47). 此外，据报道LPS刺激的小鼠巨噬细胞中的LRG47抑制通过下调TLR4和通过抑制MyD88/NF-κB/p38诱导的TNF/IL-6预防ETM合成(48).
总之，miR-141的过度表达有助于通过靶向TLR信号通路的抑制TLR4基因，从而挽救AH的肠损伤和IETM将为肠道损伤的治疗提供新的基础以及AH的IETM。
补充数据
致谢
不适用。
基金
本研究由淮安自然科学基金资助科学基金（批准号HAB201722）和南京医学大学自然科学基金（批准号：2016NJMU137）。
数据和材料的可用性
当前使用和分析的数据集可从通讯作者处获得关于合理请求。
作者的贡献
WQ和YL设计了这项研究。WQ、XL和YP整理数据，设计和开发数据库数据分析并产生了手稿的初稿。加权平均值YL参与了手稿的起草。所有作者参与修订稿并已阅读和批准最终提交的手稿。
道德批准和同意参与
本研究涉及的所有动物实验符合临床批准的原则徐州市附属淮安医院伦理委员会医科大学。为了尽量减少使用的动物数量以及它们各自的数量受苦的。
患者同意发布
不适用。
相互竞争的利益
作者声明他们没有竞争对手利益。
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