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.2018年8月2日；23（2）：239-251.e6。
doi:10.1016/j.stem.2018.07.009。

亚历山大病hiPSC模型中星形胶质细胞GFAP突变损害少突胶质细胞前体增殖和髓鞘形成

李丽 1, 鄂田 2, 陈贤伟（Xianwei Chen） 2, 曹建飞 2, 杰里米·克莱恩 2, 秋浩区 2, 孙桂华 三, 孙国强 2, 兖州黄 2, Charles D典狱长 4, 彭晔 2, 冯丽照 2, 李新强 2, 齐翠 2, 阿卜杜拉·苏丹 2, 杜瓦拉斯泛神经炎 5, 瓦伦蒂娜·福萨蒂 5, 内维尔·E·桑贾纳 6, 亚瑟·D·里格斯 三, 石彦宏 7
附属公司

亚历山大病hiPSC模型中星形胶质细胞GFAP突变损害少突胶质细胞前体增殖和髓鞘形成

李丽等。 细胞干细胞. .

摘要

亚历山大病（AxD）是一种主要影响星形细胞的脑白质营养不良，由星形细胞丝基因GFAP突变引起。虽然星形胶质细胞被认为在控制髓鞘形成中具有重要作用，但AxD动物模型并没有重述关键的髓鞘形成表型，因此尚不清楚AxD星形胶质细胞如何导致白质营养不良。在这里，我们显示AxD患者iPSC-derived星形胶质细胞再现了AxD病理学的关键特征，如GFAP聚集。此外，AxD星形胶质细胞在共培养中抑制人iPSC-derived少突胶质细胞祖细胞（OPCs）的增殖，并降低其髓鞘形成潜能。基于CRISPR/Cas9的GFAP突变校正逆转了这些表型。对AxD星形胶质细胞和死后大脑的转录组分析表明，CHI3L1是AxD星状细胞介导的OPC活性抑制的关键介质。因此，这种基于iPSC的AxD模型不仅重述了动物模型中未观察到的患者表型，而且揭示了疾病病理学的潜在机制，并为评估治疗干预提供了一个平台。

关键词：亚历山大病；CHI3L1；星形胶质细胞；疾病建模；iPSC；脑白质营养不良；髓鞘形成；神经系统疾病；少突胶质祖细胞；少突胶质细胞。

PubMed免责声明

利益冲突声明

权益声明

作者声明，除了N.E.S.被列为基因组工程专利申请的发明人之外，没有任何利益冲突。

数字

图1。
图1.AxD患者iPSC-derived星形胶质细胞显示GFAP聚集。
（A） 研究中使用的人类iPSC系，包括3个对照系，I90、C1和C3，3个AxD系，AxD825、AxD997和AxD999，以及一个具有GFAP公司通过CRISPR/Cas9编辑纠正突变。（B）GFAP公司测序显示AxD iPSC系的突变。（C） CRISPR/Cas9靶向示意图GFAP公司AxD999 iPSCs中的突变（M73K），以及确认AxD999-CR iPSCs的WT基因型的序列。（D-F）S100β的百分比+（D） 和GFAP+（E） 细胞和iPSC-derived星形胶质细胞中GFAP和S100β染色（F）的代表性图像。误差条是面板D和E的平均值SD，n=3个实验重复。（G）免疫染色显示AxD iPSC衍生星形胶质细胞中GFAP聚集体的代表性图像（用白色箭头指示）。对照组和AxD999-CR星形胶质细胞中没有GFAP聚集体。（H） AxD997和AxD999星形胶质细胞中类似Rosenthal纤维的纤维束的电子显微镜图像，但不包括C3和AxD 999-CR星形胶质细胞。n=4个实验重复。（一） AxD997和AxD999星形胶质细胞中GFAP和αB-晶体（CRYAB）双重染色的代表性图像。在C3和AxD999-CR星形胶质细胞中未检测到αB-晶体信号。比例尺：面板F、G和I为50μm；面板H为0.5μm。另请参见图S1-S3、表S1-S3，S5和S7。
图2。
图2 AxD星形胶质细胞减少OPC增殖。
（A） OPC-滋养细胞共培养系统示意图。将O4分类的I90 iPSC衍生OPC接种到GFAP-GFP分类的对照或AxD星形胶质细胞上进行共培养。（B和E）O4活染色的代表性图像（B）和O4的倍数变化+OPC与对照或AxD星形胶质细胞共培养5天后的细胞数（E）。（C和F）OLIG2染色的代表性图像（C）和OLIG2的折叠变化+共培养5天后的细胞数（F）。（D和G）BrdU和OLIG2双重染色的代表性图像（D）和BrdU的百分比+OLIG2公司+共培养24小时后的细胞（E）。（H和I）O4活染色（H）和O4折叠变化的代表性图像+OPC与AxD999-CR或AxD999星形胶质细胞共培养5天后的细胞数（I）。（J和K）BrdU和OLIG2双重染色的代表性图像（J）和BrdU百分比+OLIG2公司+OPC与AxD999-CR或AxD999星形胶质细胞共培养24小时后的细胞（K）。箭头指向BrdU+OLIG2公司+细胞。比例尺：面板B、D和H为100μm，面板C和J为50μm。误差线为平均值的SE，n=3次实验重复，面板E-G的单向方差分析为*p<0.05，面板I和K的学生t检验为**p<0.01。另见图S4。
图3。
图3：AxD星形胶质细胞在3D纳米纤维培养系统中导致髓鞘缺陷。
（A和C）三维纳米纤维培养系统中MBP免疫染色的代表性图像，包括GFAP-GFP分类对照与AxD（A），或AxD999-CR与AxD999（C）星形胶质细胞（绿色）和从I90 hiPSC衍生OPC成熟的少突胶质细胞。比例尺：50μm。（B和D）对照组与AxD（B）或AxD999-CR与AxD999（D）共培养中MBP免疫染色和与纳米纤维对齐的代表性图像。比例尺：100μm。高倍图像显示在面板B下方，以突出MBP段与纳米纤维的对齐。比例尺：20μm。（E-G）MBP中的折叠变化+电池编号（#）（E），MBP+面积（F）和MBP+OPC与星形胶质细胞基于纳米纤维的共培养中的片段长度（G）。误差线为面板E-G的平均值SE，n=3次实验重复，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。另见图S3。
图4。
图4转录组分析揭示了AxD和健康对照星形胶质细胞之间的差异。
（A） GFAP纯化星形胶质细胞RNA分离示意图。星形胶质细胞用GFAP抗体和GFAP染色+细胞经流式细胞仪分选，然后进行RNA分离。（B） 与C3和I90对照星形胶质细胞相比，AxD997和AxD999星形胶质细胞中上调（红色）或下调（蓝色）基因的GO术语。X轴是浓缩分数，计算为–log（P值）。缩写GO术语的全称为：细胞增殖的负调控（cell proliferation）；膜的固有成分（细胞膜）；神经系统发育；（C） 与对照星形胶质细胞相比，AxD星形胶质细胞中3类代表性基因组的热图显示上调（红色）或下调（蓝色），包括编码细胞因子和分泌分子的基因、细胞膜蛋白和参与细胞内信号传递的蛋白。对照和AxD星形胶质细胞中CHI3L1（D）、ITGB4（E）、ITGB3（F）和TF（G）mRNA水平的（D-G）qRT-PCR验证。与C1（D，E）或C3（F，G）相比，误差线是平均值的SD，n=3次实验重复，学生t检验的**p<0.01和***p<0.001。
图5。
图5.AxD患者大脑中CHI3L1基因表达变化的确认。
（A） AxD患者（AxD）和非AxD对照组死后脑组织RNA-seq分析的热图显示。AxD大脑中上调的基因以红色显示，而下调的基因以蓝色显示。（B） 与对照样品相比，显示AxD星形胶质细胞和脑组织持续变化的基因文氏图。（C） 与相应的对照组相比，AxD星形胶质细胞和脑组织中上调（红色）和下调（蓝色）基因的GO术语。X轴是浓缩分数。缩写GO术语的全称为：中枢神经系统中的轴突鞘（axon鞘）；中枢神经系统髓鞘化；多细胞生物过程；钾离子转运（钾转运）。（D） 与对照脑组织相比，AxD脑组织中髓鞘生成相关基因下调（蓝色）的热图显示。（E） 与对照脑组织相比，AxD脑组织中编码细胞因子和分泌分子上调（红色）或下调（蓝色）的代表性基因的热图显示。（F和G）qRT-PCR验证对照组和AxD脑组织中PDGFRA（F）和MBP（G）mRNA水平。（H） 对照组和AxD脑组织中CHI3L1 mRNA水平的qRT-PCR验证。误差条是平均值的SD，n=3个实验重复，通过Student t检验，面板F、G和H的*p<0.05。（I）对照组和AxD脑组织中MBP和CHI3L1的Western blot。GAPDH被纳入负荷控制。另请参见图S6、S7A和表S4。
图6。
图6 CHI3L1介导AxD星形胶质细胞对OPC增殖和髓鞘形成的抑制作用。
（A） AxD999-CR星形胶质细胞-OPC共培养物的OLIG2和BrdU染色的代表性图像，该共培养物经对照培养基、AxD999星形胶质细胞条件培养48小时的培养基（AxD99-CM）或AxD99 CM加CHI3L1中和抗体（Ab）处理。（B） BrdU的百分比+OLIG2公司+AxD999-CR星形胶质细胞-OPC中的细胞用对照培养基处理，AxD999星形胶质细胞条件培养24或48小时，或AxD99星形胶质细胞的条件培养48小时，再加上CHI3L1中和抗体（Ab）。（C和D）OLIG2和BrdU染色的代表性图像以及BrdU的百分比+OLIG2公司+OPC中的细胞与经对照shRNA（shC）或CHI3L1靶向shRNAs（shRNA-1和shRNA-2）处理的AxD星形胶质细胞共同培养。（E和F）MBP染色和MBP折叠变化的代表性图像+电池编号或MBP+用靶向shRNAs（shRNA-1和shRNA-2）的shC或CHI3L1处理OPCs和AxD星形胶质细胞的3D纳米纤维培养物中的区域。误差条是通过单因素方差分析得出的平均值的SD，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。另请参见图S7。
图7。
图7 CRTH2的中和抗体可挽救AxD999星形胶质细胞CM诱导的OPC增殖减少。
（A） AxD999-CR星形胶质细胞-OPC共培养物经对照培养基（-CM对照）、AxD999星形胶质细胞条件培养48小时的培养基（AxD99-CM）以及对照IgG或TMEM219或CRTH2的中和抗体（Ab）处理后的OLIG2和BrdU染色的代表性图像。绵羊IgG（C1-IgG）作为绵羊抗TMEM219的阴性对照，兔IgG（C2-IgG）作为兔抗CRTH2的阴性对照。（B） BrdU的百分比+OLIG2公司+OPC中的细胞与AxD999-CR星形胶质细胞共同培养，并用对照培养基、AxD999 CM和对照IgG或TMEM219或CRTH2的中和抗体处理。误差条是平均值的SD，n=3次实验重复，**p<0.01，通过单向方差分析。ns：无显著性。另请参见图S7。
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