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.2018年5月15日；9(1):1899.
doi:10.1038/s41467-018-04269-7。

亚历山大病的组织和细胞刚性和机械敏感性信号激活

王立群 1, 景霞 2, 乔纳森·李 三, 特蕾西·哈格曼 4, 杰弗里·琼斯 4, 欧内斯特·弗伦克尔 三, 大卫·A·威茨 2 5, 张素春 4 6, 阿尔比·梅辛 4 7, 梅尔·B·芬尼 8
附属公司

亚历山大病的组织和细胞刚性和机械敏感性信号激活

王立群等。 国家公社. .

摘要

神经胶质细胞越来越多地被认为是神经疾病发病机制的积极参与者，但控制神经胶质功能和继发性非细胞自主神经损伤的关键途径和机制仍不完全明确。在这里，我们使用亚历山大病模型，这是一种由GFAP获得功能突变引起的严重脑疾病，来证明GFAP的错误调节导致机械敏感性信号级联的激活，其特征是激活Hippo通路并随后增加a型层粘连蛋白的表达。重要的是，我们利用遗传学来验证失调的机械传导信号在促进行为异常和非细胞自主神经退行性变中的功能作用。此外，我们采用细胞生物学和生物物理方法表明，亚历山大病患者的脑组织硬度增加。我们的研究结果表明，机械传导信号的改变是亚历山大病（Alexander disease）以及其他以神经胶质增生为特征的脑疾病中导致神经元功能障碍和神经变性的关键病理级联反应。

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利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
基因筛查暗示了机械传递途径。一基因组规模遗传筛查结果的数据分析示意图果蝇亚历山大病模型。DIOPT:DRSC集成正交测井预测工具。b条使用优质斯坦纳森林算法（PCSF）的整体网络解决方案确定了与机械传输相关的路径（绿色、橙色、红色和蓝色填充节点）。人类同源物用三角形表示；然而，圆圈表示Steiner节点，或在苍蝇屏幕中未被识别为修饰物的蛋白质，但与数据和PCSF密切相关。边缘表示物理蛋白质-蛋白质相互作用，厚度是基于iRefIndex13中汇编的实验证据得出的相互作用的置信度。c（c）突显机械传递途径中蛋白质相互作用的子网络
图2
图2
亚历山大病A型层粘连蛋白表达增加。一双标记免疫荧光显示，与年龄匹配的对照组（Ctrl）相比，1岁亚历山大病患者（AxD，箭头）星形胶质细胞中的A型层粘连蛋白、层粘连A/C（LA/C）表达增加。GFAP标记星形胶质细胞。比例尺为5微米。b条蛋白质印迹证实，与年龄匹配的对照组相比，亚历山大病患者白质中层粘连蛋白a的表达显著增加。重制GAPDH的印迹，以说明等效蛋白质负荷。第页 = 0.0476，Mann–Whitney试验。c（c）双标记免疫荧光显示3个月大亚历山大病模型小鼠星形胶质细胞层粘连蛋白A/C（LA/C）表达增加(GFAP公司R236小时/+，箭头）与年龄匹配的野生型同卵双胞胎对照（野生型）进行比较。GFAP标记星形胶质细胞。比例尺为10微米。d日免疫荧光强度定量显示3个月大的亚历山大病模型小鼠的层粘连蛋白A/C表达显著增加(GFAP公司R236小时/+)与年龄匹配的野生型小鼠（WT）相比。N个 = 每个基因型3只动物。每只动物共有30个星形胶质细胞用于定量。第页 = 0.0126，Wilcoxon试验。e（电子）双标记免疫荧光显示LamC表达增加果蝇亚历山大病模型苍蝇（GFAP）胶质细胞中A型层粘连蛋白的同源物R79小时，箭头）与年龄匹配的控件苍蝇（Ctrl，箭头）相比。Repo标记胶质细胞。比例尺为5微米。（f）Western印迹显示，与年龄匹配的对照相比，亚历山大病模型苍蝇中LamC的表达增加。重复印迹肌动蛋白，以说明等效的蛋白质负载。N个 = 8,第页 = 0.0002，Mann–Whitney试验。克使用两个功能丧失等位基因降低LamC的表达LamC公司在亚历山大病模型中，苍蝇显著降低了TUNEL分析测得的细胞死亡。N个 = 每个基因型6个*第页<0.05时**第页<0.01，Kruskal–Wallis检验。小时使用功能丧失等位基因减少LamC的表达LamC公司在亚历山大病模型中，苍蝇显著减少了癫痫发作的苍蝇数量。N个 > 每个基因型100个。第页<0.001.χ2-测试。我使用功能丧失等位基因减少LamC的表达LamC公司在亚历山大病模型中，苍蝇拯救了非细胞自主神经细胞死亡。N个 = 每个基因型6个。第页 = 0.0152，Mann-Whitney试验。苍蝇20天大e（电子）——克,我出生1天小时
图3
图3
YAP在亚历山大病中被激活。一,c（c）双标记免疫荧光显示1岁亚历山大病患者（AxD，箭头所示一)和3个月大的亚历山大病模型小鼠(GFAP公司R236小时/+，箭头在c（c）)，但在年龄匹配的对照组中没有。GFAP标记星形胶质细胞。箭头(c（c）)表明野生型对照小鼠中YAP的细胞质表达较弱。b条,d日Western blot显示亚历山大病患者（AxD，b条)和亚历山大病模型小鼠(GFAP公司R236小时/+,d日)与年龄匹配的对照组相比。第页 = 0.0043 (b条)和0.0286(d日)Mann–Whitney测试。e（电子）双标记免疫荧光显示亚历山大病模型苍蝇（GFAP）胶质细胞核中激活的Yki表达R79小时，箭头），但不在年龄匹配的控件（箭头）中。在亚历山大病模型苍蝇和对照组（黄色箭头）的神经元细胞胞浆中，Yki的表达类似。Repo标记胶质细胞。（f）Western印迹显示，与年龄匹配的对照相比，亚历山大病模型苍蝇中Yki的表达显著增加。N个 = 9第页 = 0.0039，Wilcoxon检验。克β-半乳糖苷酶免疫染色显示前任-lacZ公司，Yki活性报告员，在亚历山大病模型苍蝇（GFAP）的胶质细胞中R79小时，箭头），但不在年龄匹配控件中。Repo标记胶质细胞。小时——j个β-半乳糖苷酶阳性细胞的定量(小时,i）和GFP阳性细胞(j个)显示携带Yki活动记者的亚历山大病模型苍蝇显著增加前任-lacZ公司(小时)，cycE公司-lacZ公司(我)和第个-GFP公司(j个)与年龄匹配的对照组相比。N个 ≥ 每个基因型6个。第页 = 0.0022 (小时), 0.0003 (我)和0.0002(j个)Mann–Whitney测试。k个,我过度表达野生型yki公司(k个)或减少高性能操作表达式(我)在神经胶质细胞中，两个对照中的LamC蛋白水平增加（Ctrl：回购-镀锌4/+)和亚历山大病模型苍蝇（GFAPR79小时:回购-镀锌4,无人机-GFAP公司R79小时/+). *第页<0.05时**第页<0.01，Wilcoxon试验(k个)和Kruskal–Wallis测试(我).米减少高性能操作通过TUNEL分析，使用转基因RNAi系在亚历山大病模型苍蝇中的表达显著增加了细胞死亡。N个 ≥ 每个基因型6个*第页<0.05时**第页<0.01，Kruskal–Wallis检验。苍蝇20天大e（电子）——米.比例尺为5微米英寸一,e（电子）,克和10微米英寸c（c）.为GAPDH重制印迹(b条,d日)或肌动蛋白(（f）,k个,我)说明等效蛋白质负荷
图4
图4
突变GFAP诱导的细胞机械传导改变。一3个月大亚历山大病模型小鼠星形胶质细胞中F-actin束形成增加(GFAP公司R236小时/+，箭头）。磷脂酶染色标记F-actin。GFAP标记星形胶质细胞。DAPI标记细胞核。比例尺为2微米。N个 = 4（野生型）和5(GFAP公司R236小时/+). 每只动物共有50个星形胶质细胞用于定量。第页 = 0.0159，曼-惠特尼检验。三维重建见补充数据2。b条突变GFAP转基因果蝇（GFAP）胶质细胞中丰富的肌动蛋白束R79小时，箭头）标记为LifeactRFP。Repo标记胶质细胞。比例尺为5微米。N个 ≥ 每个基因型6只动物。第页 = 0.0012，Mann-Whitney试验。c（c）Western blot显示，与年龄匹配的对照组相比，突变GFAP转基因果蝇中Shot的表达增加。N个 = 6第页 = 0.0313，Wilcoxon检验。d日基因还原射击亚历山大病模型苍蝇中的表达降低了含有F-actin的胶质细胞的百分比。LifeactRFP标签F-actin。Repo标记胶质细胞。比例尺为5微米。N个 ≥ 每个基因型6个*第页<0.05时**第页<0.01，Kruskal–Wallis检验。e（电子）免疫荧光显示，在亚历山大病模型苍蝇（GFAP）的胶质细胞中，整合素（箭头）沿着F-actin增加并聚集表达R79小时，箭头），但不在年龄匹配的控件中。Repo标记胶质细胞。比例尺为5微米。（f）Western印迹显示，与年龄匹配的对照相比，携带整合素连接激酶（Ilk）GFP蛋白陷阱报告基因的亚历山大病模型苍蝇中GFP的表达增加。N个 = 4第页 = 0.0286，Mann-Whitney试验。克——j个增加的转录水平拉纳（层粘连蛋白α亚单位），车道B1（层粘连蛋白β亚单位），车道B2（层粘连蛋白γ亚基）和文丘林(文斯)与年龄匹配的对照苍蝇相比，在突变GFAP转基因苍蝇中*第页<0.05时**第页<0.01，Mann-Whitney试验(克,我)和Wilcoxon试验(小时,j个).k个,我双标记免疫荧光和western blot显示3个月大的亚历山大病模型小鼠磷酸化黏着斑激酶（phospho-FAK）表达增加(GFAP公司R236小时/+)与年龄匹配的野生型窝友对照组相比。GFAP标记星形胶质细胞。顶部两行的比例尺为10微米，插图为2微米(k个).N个 = 4,第页 = 0.0221 (我). 苍蝇20天大b条——j个。斑点被重新定位为肌动蛋白(c（c）,（f）)或GAPDH(我)说明等效蛋白质负荷
图5
图5
亚历山大病实验模型中大脑僵硬增加。一示意图显示了750的弹性测量 使用旋转流变仪对μm厚的小鼠大脑切片进行检测。b条亚历山大病模型小鼠的脑组织硬度显著增加(GFAP公司R236小时/+)与年龄匹配的野生型窝友对照组相比。老鼠4个月大。N个 = 每个基因型4个。第页 = 0.0286，Mann-Whitney试验。c（c）示意图显示了体外3D-胶原蛋白基质培养果蝇大脑。已解剖果蝇大脑分别在单独培养基或3D-胶原基质中培养40个 25小时 分析前为°C。d日LamC表达随胶原基质浓度（硬度）增加而呈剂量依赖性增加。基因型：回购-镀锌4/+（按Ctrl键）。e（电子）Yki表达随胶原基质浓度（硬度）增加而呈剂量依赖性增加。基因型：回购-镀锌4/+（Ctrl）。（f）亚历山大病模型苍蝇脑中LamC的表达在4岁时显著高于对照苍蝇脑 mg/ml胶原蛋白基质。基因型：Ctrl:回购-镀锌4/+; GFAP公司R79小时:回购-镀锌4,无人机-GFAP公司R79小时/+*第页<0.01.克4岁时培养的亚历山大病模型苍蝇脑中Yki表达的增加显著高于对照苍蝇脑 mg/ml胶原蛋白基质。基因型：Ctrl:回购-镀锌4/+; GFAP公司R79小时:回购-镀锌4,无人机-GFAP公司R79小时/+. *第页<0.01. 所有面板中的苍蝇都是1-3天大的
图6
图6
亚历山大病星形胶质细胞重述体内关键的机械敏感性标记物。一双标记免疫荧光和定量分析表明，与校正的对照线（R88，顶面）相比，从多能干细胞分化的亚历山大病星形胶质细胞（C88，底面）中的层粘连蛋白A/C表达显著增加。GFAP标记星形胶质细胞。DAPI标记细胞核。比例尺为10微米。N个 = 58（R88）和94（C88）。第页<0.0001，Mann–Whitney试验。b条双标记免疫荧光和定量证实，与校正的对照线（R88，顶屏）相比，亚历山大病星形胶质细胞（C88，底屏）中YAP蛋白的核/细胞质（N/C）比率增加。GFAP标记星形胶质细胞。DAPI标记细胞核。比例尺为10微米。N个 = 130（R88）和121（C88）。第页<0.0001，Mann–Whitney试验。c（c）双标记免疫荧光显示，与校正的对照线（R88，顶面）相比，亚历山大病星形胶质细胞（C88，底面）中的应力纤维形成增加。磷脂标记F-actin。GFAP标记星形胶质细胞。黄色方框表示每个星形胶质细胞胞体中的感兴趣区域（ROI）。比例尺为10微米。N个 = 59（R88）和50（C88）。第页<0.0001，Mann–Whitney试验。d日亚历山大病机械转导稳态紊乱的工作模型。GFAP的高表达通过spectraplakin蛋白（蓝色）促进F-actin的形成。因此，F-actin通过Hippo途径促进YAP核转运和活化。活化的YAP诱导细胞核中的层粘连蛋白表达。此外，增加的F-actin聚合也激活了整合素介导的细胞膜“内-外”机械传导信号。总之，这些改变增加了脑组织硬度，进而引发神经退行性变
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