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.2018年1月15日；29(2):209-219.
doi:10.1091/mbc。E17-05-0271。 Epub 2017年11月15日。

Gfap公司和Osmr公司BRG1和STAT3对星形胶质细胞染色体间基因簇的调控

伊藤贤治 1 2, 野口阿祖 1, 上崎裕一 1, Testuya塔加 3, 荒川博子 1, Takumi Takizawa公司 4
附属公司

Gfap公司和Osmr公司BRG1和STAT3对星形胶质细胞染色体间基因簇的调控

伊藤贤治等。 分子生物学细胞. .

摘要

细胞核内基因位点之间的长范围染色质相互作用对许多生物过程都很重要，包括转录调控。此前，我们证明了几个基因与星形胶质细胞特异性基因簇合，产生胶质原纤维酸性蛋白(Gfap公司)星形胶质细胞分化过程中；然而，基因聚集的分子机制仍不清楚。在这里，我们发现哮喘相关基因1（BRG1），一种依赖ATP的染色质重塑因子，和转录因子STAT3是Gfap公司和抑癌素M受体(Osmr公司)通过招募STAT3识别序列进行聚类和增强表达，并且基因聚类发生在转录上调之前。BRG1敲低和JAK-STAT信号抑制损害了聚类，导致两个基因的转录下调。BRG1和STAT3被招募到同一个团队Gfap公司碎片；JAK-STAT信号抑制损害BRG1募集。我们的结果表明，BRG1和STAT3协同调节基因聚集和上调Gfap公司和Osmr公司转录。

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数字

图1：
图1：
确认Gfap公司和Osmr公司脑切片中的基因聚类。（A） 双标记DNA FISH的投影图像Gfap公司（绿色）和Osmr公司（红色）胚胎期（E）14个Nestin阳性NPC，E17和出生后（P）1天GFAP阳性星形胶质细胞。细胞核用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（蓝色）复染。比例尺=5μm。箭头表示聚集位点。（B） E14 Nestin阳性NPC和E17及P1 GFAP阳性星形胶质细胞的核直径。细胞核直径代表DAPI染色的每个细胞核的最大直径。进行了钢材试验*第页< 0.05 (n个= 108). （C） 使用DNA FISH确定的聚类频率Gfap公司和Osmr公司E14巢蛋白阳性NPC以及E17和P1 GFAP阳性星形胶质细胞。误差线：三个生物复制品的平均值±SEM(n个= 53–54). *第页< 0.05, **第页通过方差分析和Fisher’s LSD事后检验，<0.01。（D） 探针间距离的累积频率Gfap公司和Osmr公司E14巢蛋白阳性NPC以及GFAP阳性E17和P1星形胶质细胞。进行了Kolmogorov–Smirnov（K–S）试验(n个= 320).
图2：
图2：
Gfap公司和Osmr公司基因簇在两个基因转录激活之前。（A，B）定量RT-PCR对Gfap公司和Osmr公司每个基因的表达水平仅在NPC中测定，并用LIF刺激指定时间（LIF-stim）。结果标准化为Gapdh公司表达。每个图表示至少三个实验的平均（±SEM）相对量（与NPC相比）。（C） 的聚集频率Gfap公司和Osmr公司仅在NPC中使用DNA FISH测定，并用LIF刺激指定时间（LIF-stim）。每个图表示至少三个实验中具有聚集等位基因的细胞数量的平均（±SEM）百分比。进行了Dunnett试验*第页< 0.05, **第页< 0.01 (n个= 53–54). （D） 单用LIF刺激96小时的NPC核直径（LIF-stim）。细胞核直径代表DAPI染色的每个细胞核的最大直径。进行了钢材试验(n个= 138). （E） 探针间距离的频率Gfap公司和Osmr公司在NPC中；用LIF刺激细胞达到指定时间（LIF-stim）。对每个探针间距离进行Dunnett测试*第页< 0.05, **第页< 0.01.
图3：
图3：
Gfap公司和奥斯马尔基因聚类与Gfap公司LIF刺激细胞中的转录。（A） LIF刺激细胞中三重标记RNA/DNA FISH的投影图像Gfap公司DNA（绿色），Osmr公司DNA（红色），以及Gfap公司RNA（白色）。细胞核用DAPI（蓝色）复染。比例尺=5µm。箭头表示聚集的等位基因。（B） 的聚集频率Gfap公司使用RNA/DNA FISH测定LIF刺激细胞的活性（转录）和非活性（非转录）等位基因。数据表示三个生物复制的平均值±SEM(n个=72–74（活性等位基因），332–336（非活性等位蛋白）。学生的t吨进行统计学分析*第页< 0.05. （C） 单个活性（转录）细胞的表型分析Gfap公司.具有活动或非活动的小区的频率Gfap公司聚集在一起的等位基因Osmr公司已确定。数据表示为三个生物复制的平均值±SEM(n个= 54–55). 学生的t吨进行了测试。
图4：
图4：
BRG1和STAT3被招募到STAT3结合位点（SBS）Gfap公司和Osmr公司与基因聚类同时发生的位点。（A）BRG1在GFAP阳性细胞中的表达。用抗GFAP抗体（绿色）和抗BRG1抗体（红色）分别对单独和用LIF刺激不同时间段（LIF-stim）的NPC进行染色。细胞核用DAPI（蓝色）复染。比例尺=20µm。箭头表示BRG1/GFAP双阳性细胞。（B） 总细胞中BRG1阳性细胞的数量。（C） GFAP阳性细胞和GFAP/BRG1双阳性细胞的数量。（B，C）数据表示为三个生物复制的平均值±SEM(n个= 72–211). 进行了Dunnett试验**第页< 0.01. （D） BRG1在SBS的ChIP-qPCRGfap公司和Osmr公司和磅3f4（阳性对照）和CD4细胞（阴性对照）单独在NPC中的基因座，并用LIF刺激不同的时间段（LIF刺激）。每个图表表示至少三个实验的平均值（±SEM）。（E） SBS处STAT3的ChIP-qPCRGfap公司和Osmr公司基因座和社会保障3（阳性对照）和Gapdh公司（阴性对照）用LIF刺激不同时间段的NPC（LIF刺激）。每个图表表示至少三个实验的平均值（±SEM）。
图5：
图5：
BRG1敲除下调因子Gfap公司和Osmr公司转录和损伤基因聚集。（A）细胞培养和病毒感染程序的方案。从E14.5小鼠端脑分离的NPC在第4天进行培养和复制。随后，用表达EGFP的逆转录病毒（shControl）或EGFP与shBRG1一起感染细胞，然后用LIF（50 ng/ml）培养星形胶质细胞分化。（B） 定量RT-PCRGfap公司shControl或shBRG1处理的NPC中的mRNA单独或用LIF刺激不同时间段（LIF-stim）。结果标准化为Gapdh公司表达并描述为相对于0小时水平的折叠诱导。每个图表示至少三个实验中NPC相对数量的平均值（±SEM）。（C） GFP阳性（绿色）LIF刺激细胞中双标记DNA FISH的投影图像Gfap公司（黄色）和Osmr公司（红色）。细胞核用DAPI（蓝色）复染。比例尺=5µm。箭头表示聚集的等位基因。（D） 确定的群集频率Gfap公司和Osmr公司在表达shControl或shBRG1的LIF刺激细胞中。数据以三个生物复制品的平均值±SEM表示(n个= 73–127). 学生的t吨进行了测试**第页< 0.01.
图6：
图6：
JAK-STAT信号传导的抑制削弱了Gfap公司和Osmr公司并下调其转录。（A） 实验程序方案。从E14.5小鼠端脑分离的NPC在第4天进行培养和再植。用表达EGFP（pMY）或与DN-STAT3联合表达的逆转录病毒感染细胞，然后用LIF（50 ng/ml）培养4 d以诱导星形胶质细胞分化。（B） 双标记DNA FISH的投影图像Gfap公司（黄色）和奥斯马尔（红色）在感染重组逆转录病毒的LIF-刺激细胞中，该逆转录病毒可单独表达EGFP（pMY）或与DN-STAT3一起表达。病毒感染的细胞用抗GFP抗体染色（绿色）。细胞核用DAPI（蓝色）复染。比例尺=5μm。箭头表示聚集的等位基因。（C） 使用DNA FISH确定的聚类频率Gfap公司和Osmr公司在LIF刺激的细胞中，感染了仅表达EGFP（pMY）或与DN-STAT3一起表达的逆转录病毒。数据以三个生物复制品的平均值±SEM表示(n个=53–54）。学生的t吨进行了测试*第页< 0.05. （D） 定量RT-PCRGfap公司和Osmr公司来自gp130+/+、+/-和−/-小鼠的NPC中的mRNA，单独使用LIF刺激不同时间段（LIF-stim）。结果标准化为Gapdh公司表达。每个图表表示与来自至少三个实验的gp130+/+小鼠的NPC数量相关的平均值（±SEM）。
图7：
图7：
基因聚类Gfap公司和Osmr公司在gp130−/−小鼠中受损。（A） 双标记DNA FISH的投影图像Gfap公司（绿色）和Osmr公司（红色）来源于gp130+/-和−/−小鼠的E14巢蛋白阳性NPC和E16和P1 S100β阳性星形胶质细胞。细胞核用DAPI（蓝色）复染。比例尺=5μm。箭头表示聚集的等位基因。（B） 使用DNA FISH确定的聚类频率Gfap公司和奥斯马尔在E14 Nestin阳性NPC、E16 Nestin-、Tuj1-和S100β-阳性细胞以及来源于gp130+/-和−/−小鼠的P1-Tuj1-和S100β-阴性细胞中。数据以三个生物复制品的平均值±SEM表示(n个= 53–54). 学生的t吨进行了测试*第页< 0.05. （C，D）Gfap公司和Osmr公司在gp130+/−（C）和−/−（D）小鼠的细胞中。进行了Kolmogorov–Smirnov（K–S）试验。
图8：
图8：
BRG1招募到STAT3结合位点（SBS）需要JAK-STAT信号Gfap公司和Osmr公司位点.（A） SBS处STAT3和BRG1的ChIP-和reChIP-qPCRGfap公司在NPC和用LIF刺激不同时间段的细胞中（LIF-stim）。每张图表示至少三个实验的平均值（±SEM）。（B） 基于SBS的BRG1的ChIP-qPCRGfap、Osmr、和Gapdh公司（阴性对照）用LIF刺激细胞48小时（LIF-stim 48小时）。每个图表表示至少三个实验的平均值（±SEM）。（C） 将BRG1描述为Gfap公司和Osmr公司.BRG1和STAT3被招募到Gfap公司和Osmr公司LIF刺激后48小时内与BRG1和STAT3相关Gfap公司和Osmr公司基因聚类。基因聚类后（LIF刺激后72-96小时），两个基因的转录增强。
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