The Modification of Tet1 in Male Germline Stem Cells and Interact with PCNA, HDAC1 to promote their Self-renewal and Proliferation

doi:10.1038/srep37414

.2016年11月18:6:37414。

doi:10.1038/srep37414。

雄性生殖干细胞Tet1的修饰及其与PCNA、HDAC1相互作用促进其自我更新和增殖

郑黎明¹, 翟远欣¹, 李娜（Na Li）¹, 马方林¹, 朱海景¹, 杜晓敏¹, 李广鹏², 金莲花¹

附属公司

¹西北农林科技大学陕西干细胞工程技术中心兽医学院，陕西杨凌，712100。
²内蒙古大学哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室，呼和浩特，010021，中国。

PMID： 27857213
预防性维修识别码：项目编号5114665
内政部： 10.1038/srep37414

雄性生殖干细胞Tet1的修饰及其与PCNA、HDAC1相互作用促进其自我更新和增殖

郑黎明等。科学代表. 2016.

.2016年11月18:6:37414。

doi:10.1038/srep37414。

作者

郑黎明¹, 翟远欣¹, 李娜（Na Li）¹, 马方林¹, 朱海景¹, 杜晓敏¹, 李广鹏², 金莲花¹

附属公司

¹西北农林科技大学陕西干细胞工程技术中心兽医学院，陕西杨凌，712100。
²内蒙古大学哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室，呼和浩特，010021，中国。

PMID： 27857213
预防性维修识别码：项目编号5114665
内政部： 10.1038/srep37414

摘要

表观遗传修饰在精子发生中起着关键作用，尤其是DNA甲基化动态对维持正常精子发生至关重要。Ten-eleven易位1（Tet1）不仅是一种关键的去甲基化酶，在特定的基因区域发挥作用，而且作为蛋白质复合体与伙伴进行交叉对话以调节表观遗传过程。奶山羊是我国重要的家畜，但不稳定的体外培养体系阻碍了奶山羊新品种的优化。对雄性生殖系干细胞（mGSCs）进行表观遗传修饰的研究，有助于优化成体干细胞体外培养体系，提高精子质量，有利于家畜的繁育。在我们的研究中，我们不仅分析了小鼠Tet1（mTet1）修饰的mGSC的形态、基因表达、DNA甲基化和组蛋白甲基化动态，还分析了体内移植的干细胞能力，并探讨了Tet1在奶山羊mGSC中的作用机制。结果表明，mTet1修饰的mGSC比野生型mGSC具有更好的自我更新和增殖能力，mTet1还可以上调JMJD3，降低H3K27me3，这也表明mGSC可以抑制MEK-ERK通路。此外，Co-IP分析表明，TET1通过形成蛋白质复合物与PCNA和HDAC1相互作用，全面调节奶山羊mGSC和精子发生。

PubMed免责声明

数字

**图1。mGSC-pCDH和mGSC-p CDH-mTet1细胞的阳性细胞克隆筛选和基因表达。**
(A类)用pCDH-mTet1转染mGSCs并筛选阳性克隆细胞（不同GFP水平的mGSC-pCDH-m Tet1-A-E）。酒吧 = 200 μm。(B类)FACS分析mGSC-pCDH-mTet1细胞的纯度。(C类)mTet1过度表达慢病毒的小鼠生精小管持续2天。酒吧 = 200 μm。(D类)用QRT-PCR分析mGSC-pCDH和mGSC-p CDH-mTet1细胞的基因表达（mTet1、gTet1、gTet3、Sin3A）**第页 < 0.01，*p < 0.05. (E类)通过QRT-PCR分析mGSC-pCDH和mGSC-pCDH-mTet1细胞的基因表达（Oct4、PLZF、Gfra1、PCNA、CCND1、Scp3和HoxB1）**第页 < 0.01，*p < 0.05.

**图2。mGSC-pCDH和mGSC-p CDH-mTet1细胞的分化能力*在体外*.**
(A类)mGSC-pCDH和mGSC-p CDH-mTet1细胞中EB的形成。酒吧 = 100 μm。(B类)mGSC-pCDH和mGSC-p CDH-mTet1细胞中三个胚层自发分化标记物（Glut2，Pdx1）的免疫荧光染色。酒吧 = 200 微米。

**图3。mGSC-pCDH和mGSC-p CDH-mTet1细胞的自我更新能力体内.**
(A类)将mGSC-pCDH和mGSC-p CDH-mTet1细胞移植到busulfan处理的小鼠生精小管中。(B类)白消安用mGSC-pCDH和mGSC-p CDH-mTet1细胞处理小鼠生精小管30天。(C类)用mGSC-pCDH和mGSC-p CDH-mTet1细胞对busulfan处理的小鼠生精小管进行30天的HE染色，Bar = 200 左边两张图片为μm，Bar = 50 μm用于右两张图片。(D类)用mGSC-pCDH和mGSC-p CDH-mTet1细胞免疫荧光染色白消安处理的小鼠生精小管中的PGP9.5、VASA、CCND1和Ki67。酒吧 = 200 微米。

**图4。Tet1修饰为去甲基酶及其对组蛋白甲基化的影响。**
mGSC-pCDH和mGSC-p CDH-mTet1细胞中Oct4启动子的甲基化水平。(B类)pIRES2-AcGFP-Sin3A转染mGSCs的Western blot分析。(C类)mGSC-pCDH和mGSC-p CDH-mTet1细胞中H3K27me3的免疫荧光染色。酒吧 = 200 μm。(D类)mGSC-pCDH和mGSC-p CDH-mTet1细胞中H3K27me3的组蛋白甲基化酶EZH2和组蛋白去甲基化酶JMJD3的Western blot分析。(E类)mGSC-pCDH和mGSC-p CDH-mTet1细胞中ERK和p-ERK的Western blot分析。

**图5。Tet1修饰作为蛋白质复合物与PCNA和Hdac1的相互作用。**
(A类)FACS分析mGSC-pCDH和mGSC-p CDH-mTet1细胞的S期动力学。(B类)mGSC-pCDH和mGSC-p CDH-mTet1细胞中S6和pS6的Western blot分析。(C类)pIRES2-AcGFP-PCNA转染mGSCs中PCNA的Western blot分析。(D类)用PCNA和Hdac1对Myc（Tet1）进行Co-IP分析。(E类)mGSC-pCDH和mGSC-p CDH-mTet1细胞中Hdac1的Western blot分析。(F类)pIRES2-AcGFP-Hdac1转染mGSCs中Hdac1-Western blot分析。

**图6。mGSCs中Hdac1的调节机制。**
(A类)用VPA和N2B27培养mGSC的形态学研究。酒吧 = 50 μm。(B类)VPA处理的mGSC中Hdac1和Tet1的免疫荧光染色。酒吧 = 200 μm。(C类)QRT-PCR分析VPA处理的mGSC的基因表达。n个 = 3，*p < 0.05. (D类)用VPA和N2B27培养的mGSC中Hdac1的Western blot分析。(E类)VPA培养的mGSCs Oct4的Western blot分析。

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