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.2016年3月1日；113（9）：E1226-35。
doi:10.1073/pnas.1600813113。 Epub 2016年2月16日。

MEKK2介导促进骨形成的替代性β-连环蛋白途径

马修·布莱克·格林布拉特 1, 东延信 2, Hwanhee噢 2, 李基扬（Ki-Young Lee） 三, 薄斋 4, 史蒂文·普·吉吉 4, 苏塔达·洛丁 5, 罗兰·拜伦 6, 窦刘 7, 苏冰冰（Bing Su） 8, 劳里·H·格利姆彻 9, Jae-Hyuck垫片 1
附属公司

MEKK2介导促进骨形成的替代性β-连环蛋白途径

马修·布莱克·格林布拉特等。 美国国家科学院程序. .

摘要

成骨细胞中β-catenin活性的适当调节是骨稳态所必需的，因为β-catentin活性的增加和减少都会产生病理后果。在经典的β-连环蛋白激活途径中，WNT配体刺激通过糖原合成酶激酶3β抑制β-连环素的结构性磷酸化，防止β-连链蛋白泛素化和蛋白酶体降解。在这里，我们发现有丝分裂原激活的蛋白激酶激酶激酶2（MAP3K2或MEKK2）介导成骨细胞中β-连环蛋白激活的替代途径，这与典型的WNT途径不同。FGF2激活MEKK2磷酸化丝氨酸675处的β-连环蛋白，促进泛素特异性肽酶15（USP15）的募集。USP15反过来通过抑制β-catenin依赖于泛素的蛋白酶体降解来阻止其基础转换，从而增强WNT信号。对MEKK2-缺陷小鼠的分析以及MEKK2-和β-catenin-null等位基因之间的遗传相互作用研究证实，该途径是体内骨量的重要生理调节器。因此，FGF2/MEKK2途径介导了β-catenin活化的替代非经典途径，而该途径是成骨细胞骨形成的关键调节器。

关键词：MAPK；MEKK2；β-catenin；骨；成骨细胞。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突声明：L.H.G.是百时美施贵宝制药公司的董事会成员并持有其股权。

数字

图1。
图1。
MEKK2在体内和体外促进成骨细胞活性。(A类和B)MEKK2的免疫组织化学(A类)和磷酸-MEK2/3(B)在1周龄小鼠胫骨上分别放大40倍和100倍。(C类)4周龄股骨BV/TV和皮质厚度（C.Th）的量化Mekk2公司+/+和Mekk2公司−/−老鼠。所有误差条表示SEM。P（P）<0.05被双尾、未配对学生的t吨测试*P（P）<0.05和**P（P）<0.01；n个=每组5只小鼠。(D类)4周龄颅骨的三维重建Mekk2公司+/+和Mekk2公司−/−老鼠。(E类)8周龄胫骨的组织形态计量学分析Mekk2型+/+和Mekk2公司−/−老鼠；n个=每组5只小鼠。(上部)双标记小梁骨的显微照片。(下部)BFR和MAR的量化*P（P）< 0.05. (F类)8周龄婴儿血清P1NP和CTX水平Mekk2公司+/+和Mekk2公司−/−老鼠；n个=每组5只小鼠*P（P）< 0.05; N.S，不显著。(G公司)原位杂交奥肯1周龄的胫骨Mekk2型+/+和Mekk2公司−/−老鼠。（放大倍数：40×。）(H（H）和我)分离原代颅骨成骨细胞并将其置于分化条件下21天(H（H）)Von Kossa染色测定成骨细胞矿化活性。(我)培养7d后，用RT-PCR分析成骨细胞标记基因的表达**P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001.
图S1。
图S1。
骨骼表型的特征Mekk2公司−/−老鼠。(A类)8周龄胫骨的组织形态计量学分析Mekk2公司+/+和Mekk2公司−/−老鼠。N.Ob/B.Pm，每骨周长的成骨细胞数量。(B)对4周龄的股骨进行TRAP染色Mekk2公司+/+和Mekk2公司−/−老鼠。(C类)收集4周龄婴儿的血清Mekk2公司+/+和Mekk2型−/−小鼠，并使用ELISA测定OPG水平。N.S，不显著。
图2。
图2。
MEKK2增加β-catenin的稳定性。(A类)GST或GST-MEKK2与表达WNT10的ST2细胞的裂解物孵育，用抗GST抗体偶联琼脂糖免疫沉淀，并用抗β-连环蛋白抗体免疫印迹。(B)用载体或Flag–β-catenin和HA-MEKK2转染HEK293细胞，用抗Flag抗体偶联琼脂糖免疫沉淀裂解物，并对所示抗体进行免疫印迹。(C类)溶解COB，用抗β-连环蛋白或IgG对照物和蛋白G-结合Dynabeads进行免疫沉淀，并用抗MEKK2抗体进行免疫印迹。(D类)GST-β-catenin与纯化的HA-MEKK2（WT或KD突变体）孵育，用抗GST抗体偶联琼脂糖免疫沉淀，并用指示的抗体免疫印迹。输入表示纯化HA-MEKK2的装载控制。(E类)用不同数量的MEKK2以及TOPflash-luciferase和雷尼利亚在转染48小时后测量萤光素酶活性，并将其标准化为雷尼利亚.P（P）单因素方差分析显示<0.01。(F类)主COB与Mekk2公司+/+和Mekk2公司−/−用TOPflash荧光素酶和雷尼利亚并在成骨细胞分化条件下培养6天。荧光素酶活性标准化为雷尼利亚. ***P（P）<0.001。(G公司)用载体或HA-MEKK2（WT或KD突变体）以及Flag–β-catenin和EGFP转染HEK293细胞，并用所示抗体对裂解产物进行免疫印迹。EGFP作为转染对照。(H（H）)Mekk2公司+/+和Mekk2公司−/−COB在成骨细胞分化条件下培养7或14天，用所示抗体印迹裂解产物。(我)1周龄胫骨β-连环蛋白的免疫组织化学研究Mekk2公司+/+和Mekk2公司−/−老鼠。(J型)将载体或HA-MEKK2与Flag–β-catenin一起转染HEK293细胞，通过脉冲相标记法测定β-catentin的稳定性[35S] 蛋氨酸然后放射自显影。(K（K）)以下菌株股骨BV/TV和皮质厚度的量化：Mekk2+/+;Ctnnb公司飞行/飞行 (+/+),Mekk2公司+/−;Ctnnb公司飞行/飞行 (+/+),Mekk2公司+/+;Ctnnb公司佛罗里达州/+;Prx1型(+/−)、和Mekk2公司+/−;Ctnnb公司佛罗里达州/+;Prx1系列(+/−)老鼠。(n个=每组5只小鼠）。在皮层厚度和BV/TV比较中，P（P）通过双向方差分析，两者均<0.05Mekk2公司和Ctnnb公司以及这些组之间的交互**P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，Bonferroni修正学生t吨测验。
图S2。
图S2。
MEKK2对成骨细胞中JNK的激活和对BMP的反应是不可或缺的。(A类)主要COB从Mekk2公司+/+和Mekk2公司−/−幼鼠，在成骨细胞分化条件下培养7d，并用所示抗体进行免疫印迹。(B)或者，表示六月和第1帧通过RT-PCR分析进行分析。P（P）=N.S.，不显著。(C类和D类)原代COB在有或无100 ng/mL BMP2/7的成骨细胞分化条件下培养7天，通过ALP活性测定BMP诱导的成骨分化(C类)和ALP染色(D类). 在C类,P（P）=所有比较的N.SMekk2公司+/+和相应的Mekk2公司−/−样品。P（P）双向值t吨样品±BMP2/7的测试表明：***P（P）< 0.001.
图S3。
图S3。
MEKK2调节β-catenin的活性和稳定性。(A类)用不同数量的MEKK2（KD）或MEKK1（WT）以及TOPflash-luciferase和雷尼利亚.转染48小时后测量荧光素酶活性，并将其归一化为雷尼利亚. (B,上部)显示MEKK2截短突变体的图表。(下部)将MEKK2与TOPflash-luciferase和雷尼利亚.CT，C端子；FL，全长；NT，N端子。(C类)1周龄胫骨β-catenin的免疫组织化学研究Mekk2型+/+和Mekk2公司−/−老鼠。（放大倍数：40×。）(D类和E类)主要COB从Mekk2公司+/+和Mekk2公司−/−将幼崽和幼崽在成骨细胞分化条件下培养7d(D类)通过RT-PCR分析β-catenin的表达。(E类)用10μM MG132处理细胞8 h，并用抗β-连环蛋白抗体进行免疫印迹。(F类)将载体（vec）或HA-MEKK2与Flag–β-catenin一起转染HEK293细胞，并用脉冲相标记法测定β-catentin的稳定性[35S] 蛋氨酸随后进行放射自显影和ImageJ分析。(G公司)质谱数据证明丝氨酸675是β-连环蛋白中MEKK2-介导磷酸化的位点。
图3。
图3。
MEKK2通过S675的磷酸化稳定β-连环蛋白。(A类)GST或GST–β-catenin与纯化的HA-MEKK2（WT或KD突变体）孵育，通过体外激酶分析MEKK2激酶活性。(B)纯化的HA-MEK2与GST或GST-β-catenin[WT或S675A（SA）突变体]孵育，并通过体外激酶分析MEKK2激酶活性。(C类)将载体或β-连环蛋白（WT或S675A突变）连同TOPflash-luciferase和雷尼利亚在MEKK2缺席或在场的情况下。转染48小时后测量荧光素酶活性，并将其归一化为雷尼利亚.P（P）单因素方差分析结果<0.05。P（P）< 0.05;P（P）Bonferroni修正学生的值t吨测试：**P（P）< 0.01; ***P（P）<0.001。(D类)用Flag–β-Catenin WT或S675A突变体通过慢病毒介导的传递重组β-catening缺失的COB，并在成骨细胞分化条件下培养7天。用所示抗体对裂解液进行免疫印迹。(E类)将Flag–β-catenin WT或S675A突变体与HA-MEKK2一起转染HEK293细胞，并通过脉冲追逐标记测定β-catenin的稳定性[35S] 蛋氨酸然后放射自显影。(F类)将Flag–β-catenin WT或S675A突变体与不同量的HA-ubiquitin共同转染HEK293细胞，并在裂解前用10µM MG132处理8 h。泛素化β-连环蛋白经抗病毒抗体偶联琼脂糖免疫沉淀，并与抗HA抗体免疫印迹。(G公司)使用重组蛋白进行β-连环蛋白的体外泛素化测定。激活的His–β-catenin与重组SCF孵育SKP1系列复合物、泛素、ATP、E1和E2，无论是否存在重组MEKK2。用Ni-NTA琼脂糖免疫沉淀泛素化β-连环蛋白，进行SDS/PAGE，并用抗泛素抗体进行免疫印迹。免疫印迹证实了MEKK2对S675β-catenin的磷酸化。(H（H）)对WT永生化COB进行裂解，用抗β-连环蛋白或IgG对照物和蛋白G-结合Dynabeads进行免疫沉淀，并用指示的抗体进行免疫印迹。
图S4。
图S4。
MEKK2通过S675磷酸化调节β-连环蛋白的稳定性。(A类)用不同数量的β-catenin（WT或S675A突变）以及TOPflash-luciferase和雷尼利亚.转染48小时后测量荧光素酶活性，并将其归一化为雷尼利亚用抗β-连环蛋白抗体免疫印迹法分析β-连环素的表达。(B)用Flag–β-Catenin WT或S675A突变体通过慢病毒介导的传递重组β-catening缺失的COB，并在成骨细胞分化条件下培养7d。通过RT-PCR测定Flag-β-catentin的转录水平。P（P）Bonferroni修正双向学生的值t吨测试表明：**P（P）<0.01；N.S.，不显著。(C类)将Flag–β-catenin（WT或S675A突变体）与HA-MEKK2一起转染HEK293细胞，通过脉冲相位标记法测定β-catentin的稳定性[35S] 蛋氨酸随后在ImageJ中进行放射自显影和分析。
图S5。
图S5。
MEKK2在成骨细胞中独立于其他已知的β-连环蛋白激酶发挥作用。(A类)用编码MEKK2的构建物以及TOPflash-luciferase和雷尼利亚转染后12小时，用不同浓度的PKA抑制剂H-89培养细胞，测量荧光素酶活性并将其归一化为雷尼利亚. (B)主COB与Mekk2型+/+和Mekk2公司−/−在不同的时间点用10μM forskolin刺激幼鼠，用所示抗体对裂解产物进行免疫印迹。(C类)GST-β-catenin与重组GSK3β孵育(顶部)或CK1(中部)在存在或不存在MEKK2的情况下，利用磷酸化-β-catenin特异性抗体的免疫印迹分析GSK3β或CK1对β-catentin磷酸化的影响。(底部)在没有或存在GSK3β的情况下，将GST-β-catenin与重组MEKK2孵育，用抗磷酸化-β-catentin（S675）抗体免疫印迹分析MEKK2-诱导的β-catening磷酸化。(D类)主COB与Mekk2公司+/+和Mekk2公司−/−用所示抗体对幼鼠进行裂解和免疫印迹。
图S6。
图S6。
β-连环蛋白与USP15相互作用。用载体或β-catenin（WT或S675A突变株）和Flag-USP15转染HEK293细胞，用抗Flag抗体偶联琼脂糖进行免疫沉淀，并用指示的抗体进行免疫印迹。
图S7。
图S7。
MEKK2和USP15与Axin复合物的成分相互作用。用指示的构建物转染HEK293细胞，按指示进行免疫沉淀，然后用指示的抗体对随后的免疫复合物进行免疫印迹。
图4。
图4。
USP15促进β-catenin稳定性和成骨细胞分化。(A类)USP15或载体对照与TOPflash-luciferase和雷尼利亚β-catenin的缺失或存在。转染48小时后测量荧光素酶活性，并将其归一化为雷尼利亚.P（P）单因素方差分析结果<0.05。P（P）Bonferroni校正学生的值t吨测试：**P（P）< 0.01. (B)C3H10T1/2细胞感染表达对照或使用15shRNAs，并用Flag–β-catenin、TOPflash-luciferase和雷尼利亚存在或不存在MEKK2 WT或KD突变体。转染48小时后测量荧光素酶活性，并将其归一化为雷尼利亚.P（P）单因素方差分析结果<0.05。P（P）Bonferroni修正学生的值t吨测试：*P（P）< 0.05. (C类)将Flag–β-catenin与载体或USP15一起转染HEK293细胞，通过脉冲相标记法测定β-catentin的稳定性[35S] 蛋氨酸然后放射自显影。数字表示相应波段的密度测量值与时间=0时的值之比。(D类)HEK293细胞感染表达对照或使用15shRNA。用Flag–β-catenin和MEKK2转染产生的细胞，并用[35S] 蛋氨酸然后放射自显影。(E类)人骨髓间充质干细胞感染指示慢病毒，并在成骨细胞分化条件下培养6天，然后进行免疫印迹。(F类)使用重组蛋白进行β-连环蛋白的体外泛素化测定。激活的His–β-catenin与重组SCF孵育SKP1系列复合物、泛素、ATP、E1和E2，无论是否存在重组MEKK2或USP15。免疫印迹证实了MEKK2对S675β-catenin的磷酸化。(G公司)使用重组蛋白进行了泛素化β-连环蛋白与USP15的体外相互作用分析。在存在或不存在重组MEKK2的情况下，将Flag标记的泛素化β-连环蛋白与重组USP15孵育，用抗Flag抗体偶联的琼脂糖进行免疫沉淀，并用指示的抗体进行免疫印迹。MEKK2介导的β-连环蛋白S675磷酸化通过抗磷酸化β-连环素（S675）抗体免疫印迹证实。(H（H）和我)人类骨髓间充质干细胞感染了表达对照或使用15shRNAs，在成骨细胞分化条件下培养21天(H（H）)茜素红染色测定成骨细胞矿化活性。(我)培养10天后，用RT-PCR分析成骨细胞标记基因的表达。对于每个图形，P（P）单因素方差分析结果<0.05。P（P）Bonferroni修正学生的值t吨测试：*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***;P（P）< 0.001.
图S8。
图S8。
USP15调节β-catenin的泛素化。(A类)靶向人类的shRNA构建效率使用15通过RT-PCR和免疫印迹法测定。(B)HEK293细胞感染表达对照或使用15shRNAs，然后转染HA-ubiquitin（HA-Ub）和Flag–β-catenin。泛素化的β-连环蛋白用抗Flag抗体偶联的琼脂糖进行免疫沉淀，并用抗HA抗体进行免疫印迹。
图5。
图5。
FGF2激活MEKK2以稳定成骨细胞中的β-连环蛋白。(A类)主COB与Mekk2公司+/+和Mekk2公司−/−用FGF2刺激小鼠达到指定的时间，并用指定的抗体印迹裂解产物。(B)用FGF2（25 ng/mL）或IGF1（25 ng/mL）刺激初级WT COB 15分钟。用抗磷酸化-MEK2/3抗体和蛋白G-结合Dynabeads免疫沉淀细胞裂解物，并用指示的抗体进行免疫印迹。(C类)C3H10T1/2细胞转染TOPflash-luciferase和雷尼利亚转染细胞24小时后，用所示配体刺激细胞24小时。随后测量荧光素酶活性，并将其归一化为雷尼利亚.P（P）通过单因素方差分析<0.05。P（P）Bonferroni修正学生的值t吨测试：**P（P）< 0.01; ***P（P）<0.001。(D类,左侧)C3H10T1/2细胞转染TOPflash-luciferase和雷尼利亚在没有或存在DKK1的情况下，用WNT3a刺激24小时(赖特)C3H10T1/2细胞转染TOPflash-luciferase和雷尼利亚连同编码MEKK2的构建物或载体对照，然后用1μg/mL DKK1培养细胞。P（P）=不适用于载体对照组或MEKK2-转染组中DKK1与载体处理细胞的比较。(E类)成骨细胞中FGF2/MEKK2/β-catenin途径图。
图S9。
图S9。
FGF2作用于成骨细胞中MEKK2的上游。(A类)按指示刺激初级WT COB，并用抗磷酸-β-连环蛋白抗体进行免疫印迹。GAPDH用于装载控制。(B)如图所示，刺激初级WT COB。使用Phos-tag凝胶（Wako）分析细胞裂解产物，并用抗MEKK2抗体进行免疫印迹。箭头指示phospho-MEKK2。
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