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.2016年7月1:601:22-31。
doi:10.1016/j.abb.2016.01.019。 Epub 2016年2月15日。

PKA介导的磷酸化对大鼠离体心脏和心肌肌原纤维功能的分子特异性影响

劳林·M·汉夫特 1, 蒂莫西·D·康奈尔 1, 科林·A·麦当劳 1, 迈克尔·罗维托 1, 克雷格·A·埃姆特 2, 凯里·麦克唐纳 三
附属公司

PKA介导的磷酸化对大鼠离体心脏和心肌肌原纤维功能的分子特异性影响

劳林·M·汉夫特等。 Arch Biochem生物物理. .

摘要

β-肾上腺素能系统增加心肌细胞收缩力是提高心输出量以满足血液动力学需求的重要机制，而这一过程在衰竭的心脏中受到抑制。虽然收缩力的增强涉及到肌浆钙瞬变的增强，但肌丝也适应于促进钙信号的转导。因此，发现心室收缩力与PKA介导的两种肌原纤维蛋白磷酸化密切相关，这两种蛋白分别是心肌肌球蛋白结合蛋白C（cMyBP-C）和心肌肌钙蛋白I（cTnI），表明这两种蛋白质是心肌肌节血流动力学的重要传感器。与此相一致，我们之前发现PKA（β-肾上腺素能系统的下游信号分子）对肌丝蛋白的磷酸化增加了肌力，减缓了肌力发展速度，加速负荷缩短，并增加了大鼠心肌细胞制备物的功率输出。在这里，我们试图定义PKA介导的磷酸化调节这些收缩特性的分子特异性机制。关于cTnI，细丝与未磷酸化cTnI的结合降低了等长肌力的产生，这些变化通过PKA介导的心肌细胞磷酸化被逆转。此外，未磷酸化cTnI的加入加快了力量发展的速度，这表明合作性细丝激活减少，非循环跨桥进入循环跨桥池的招募减少，这一过程往往会降低心肌细胞的力量和力量。关于MyBP-C，慢开关骨骼肌纤维的PKA处理导致MyBP-C-磷酸化（但不是慢骨骼TnI（ssTnI）），产生更快的负载缩短速度和约30%的功率输出增加。这些结果为β-肾上腺素能系统调节肌原纤维收缩性的分子特异性以及PKA诱导的cMyBP-C和cTnI磷酸化的减弱如何导致心室泵衰竭提供了新的见解。

关键词：心肌细胞；心肌肌钙蛋白I；肌球蛋白结合蛋白；肌角长度；心室功能曲线；心室功率输出。

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数字

图1
图1。离体大鼠左心室（LV）功率输出与正常化PKA介导的cMyBP-C和cTnI磷酸化的关系
(A类)预负荷越大，低压功率越大。左心室与预负荷的关系（即心室功能曲线）在接受普萘洛尔治疗7天的大鼠心脏中最浅（n=9），在对照组（未治疗）大鼠的心脏中居中（n=14），在接受肾上腺素（0.1 mM）治疗的离体心脏中最陡（n=8）。(B类). 银染SDS-PAGE和放射自显影。从心脏中分离出心肌肌原纤维，并用（0.1 U/μl）PKA（最后一道除外）处理45分钟。通过对胶片上暴露条带的密度分析来评估PKA介导的背磷酸化，并将其标准化为来自银染凝胶的蛋白质负荷。(C&D公司)LV功率与每个预负荷时标准化cMyBP-C和cTnI磷酸化之间的关系。(E&F公司)LV功率变化（ΔLV功率）与标准化cMyBP-C和cTnI磷酸化之间的关系。
图2
图2。cTn交换对Ca的影响2+不同鼠皮心肌细胞制剂中激活的等长肌力
(A类). 通常情况下，与未磷酸化重组（R）cTn（实线红线）或用PKA（深绿色圆圈）预处理的cTn复合物交换2-4小时后，RcTn掺入约50%，最大Ca减少不到20%2+-激活力。然而，在与非磷酸化cTn复合物交换的大鼠渗透性心肌细胞制剂的一个子集中，最大钙含量显著下降（>20%）2+-激活力（红色虚线），部分可以通过PKA恢复。（插图显示了RcTn复合物交换前后大鼠皮肤心肌细胞的肌钙蛋白T（TnT）蛋白印迹，其中RcTnT含有myc标记，导致SDS-gel的迁移稍慢。）(B类). 在隔夜的RcTn交换后，PKA治疗导致张力-pCa关系发生意外的左移（即在Ca的每个水平上都有更大的相对力2+激活）。（在5种不同皮肤的心肌细胞制剂上重复此实验）。绘制了控制张力与pCa的关系图（蓝线），以说明当PKA增加Ca时2+在进行过夜cTn复合物交换的心肌细胞制剂中，力的敏感性，PKA后张力与pCa的关系对Ca的敏感性显著降低2+与对照组心肌细胞制备相比。插图显示了一张自体放射自显影图，显示PKA诱导的对照皮肤心肌细胞和经过整夜RcTn复合物交换的心肌细胞中的磷酸盐掺入。与对照组相比，RcTn交换显著降低了基线cTnI磷酸化（通过增加反磷酸化证明）。
图3
图3。非磷酸化RcTn交换对力发展速率常数（k）的影响tr公司)皮肤大鼠心肌细胞和慢开关骨骼肌纤维
(A和B)首先用PKA处理去皮心肌细胞制剂，测量肌节长度范围内（绿色圆圈）的肌力发展速度。然后，去皮心肌细胞制剂与未磷酸化的RcTn进行交换，这增加了k个信托收据所有肌节长度(A类)和相对力水平(B类). A中的插图显示了含有未磷酸化cTnI和PKA诱导的磷酸化cTnI的心肌细胞制剂中的力再发展痕迹。（本实验在4种心肌细胞制剂上进行）。(C&D公司)在皮肤缓慢抽搐的骨骼肌纤维中，肌节的长度(C类)和相对力(D类)依赖k个信托收据在与未磷酸化的RcTn（填满红色方块）交换最初12小时后，然后用PKA处理纤维（这减少了k个信托收据)（绿色圆圈），然后再进行12小时的RcTn交换（返回k个信托收据（打开红色方块）。插图显示了缓慢切换的骨骼肌纤维的图像，以及松弛再拉伸动作后的力再发展轨迹。（本实验在4条慢开关骨骼肌纤维上进行）。
图4
图4。MyBP-C磷酸化对大鼠皮肤慢开关骨骼肌纤维功率输出的影响
(A类). PKA治疗后，所有相对负荷下的负荷缩短和功率输出均增加，表明PKA介导的MyBP-C中的磷酸盐掺入调节横纹肌功率输出。插图显示了负载夹持期间肌细胞长度（顶部）和力（底部）的轨迹。条形图显示了PKA前后4种慢开关骨骼肌纤维制剂的平均（±SEM）功率输出（*p<0.05）。(B类). 慢抽搐骨骼肌纤维的银染SDS-PAGE和放射自显影图表明，PKA磷酸化了MyBP-C，而不是ssTnI。
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