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.2015年4月15日；142（8）：1407-17。
doi:10.1242/dev.117911。

胰高血糖素对α细胞转分化和β细胞新生至关重要

叶丽华 1, 摩根·A·罗伯逊 1, 丹尼尔·海塞尔森 2, 迪迪埃·Y·R·斯坦尼尔 2, 瑞安·M·安德森 三
附属公司

胰高血糖素对α细胞转分化和β细胞新生至关重要

叶丽华等。 发展. .

摘要

通过转分化实现细胞系的相互转化是一种适应性的组织再生模式，也是一种诱人的治疗靶点。然而，其临床应用取决于细胞命运获取和维持的上下文调节器的发现。在糖尿病小鼠模型中，在靶向β细胞耗竭后，分泌胰高血糖素的α细胞转分化为分泌胰岛素的β细胞，从而再生胰岛的形态和功能。然而，这种再生模式的分子触发因素尚不清楚。在这里，通过对转基因斑马鱼β细胞消融模型进行血统追踪分析，我们证明了胰岛再生过程中α细胞的保守可塑性。此外，我们发现损伤后胰高血糖素表达上调。通过基因敲除和拯救方法，我们还发现来自胰高血糖素基因的肽对于α-β细胞命运转换是必要的。重要的是，虽然β细胞新生是由葡萄糖刺激的，但α-β细胞转化不是，这表明转分化不是由胰高血糖素/GLP-1控制肝葡萄糖生成介导的。总的来说，这项研究支持以下假设：α细胞是潜在新β细胞的内源性贮存库。它进一步揭示了胰高血糖素通过控制细胞命运稳定性的反馈机制在维持内分泌细胞内环境稳定方面发挥着重要作用。

关键词：α细胞；Arx；阿拉善；β细胞；GLP-1；Gcga；胰高血糖素；胰岛素；胰腺；胰腺祖细胞；再生；转分化；斑马鱼。

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数字

图1。
图1。
斑马鱼α细胞转分化产生的β细胞新生。（A-E）共聚焦投影显示完整（A，B）和消融（C-E）的主要胰岛中的α（红色）和β（绿色）细胞Tg（单位：CFP-NTR）0、1和16的幼虫 消融后第天（dpa）。比例尺：10µm。（F） 量化胰岛素+完整（灰线）和再生（红线）胰岛中的细胞从0到20 dpf公司(n个除对照组20外，所有组均≥3 dpf、，n个=1). 显示再生胰岛与对照胰岛中β细胞的比率。（G） 非消融幼虫（灰色）和β细胞从3-4年消融的幼虫的血糖测量 dpf（红色）(n个=3). 5-dpf对照组和1-dpa组β细胞谱系标记胰岛的（H，I）共焦投影Tg（ins:Cre）；Tg（hs:CSH）；Tg（ins:Flag-NTR）幼虫。β细胞在3 消融前dpf，GFP（绿色）和胰岛素（红色）染色。（J，K）消融（J）和再生（K）胰岛的共焦面Tg（ins:Flag-NTR）；Tg（gcga:GFP）；Tg（ins:dsRed）幼虫。K中的红色箭头表示gcga：绿色荧光蛋白+ 输入：dsRed+再生胰岛中的β细胞。（L-N）共焦面Tg（gcga:Cre）；Tg（hs:CSH）；Tg（ins:Flag-NTR）消融前胰岛用H2B-GFP标记，并染色GFP（绿色）、胰岛素（红色）和胰高血糖素（蓝色）。α细胞用白色箭头表示，β细胞用红色箭头表示。（五十） 6 dpf非消融胰岛，0时（M）4 dpf消融胰胰岛 dpa和（N）6-dpf胰岛在2 dpa。H2B-GFP型+再生的β细胞用黄色箭头表示。（O） H2B-GFP的定量+和H2B-GFP−2-dpa胰岛中的β细胞(n个=10). ***P（P）≤0.001（学生的t吨-测试）。
图2。
图2。
δ细胞，但不再生β细胞的谱系标记为sst2：Cre（克雷）.（A-A‴）5-dpf的合并和单通道图像Tg（sst2:Cre）；Tg（hs:CSH）；Tg（ins:Flag-NTR）3岁时热休克的胰岛 dpf和GFP（绿色）、胰岛素（红色）和生长抑素（白色）染色。生长抑素+δ细胞用H2B-GFP标记。（B-C‴）5-dpf非烧蚀（B）或1的合并和单通道图像 dpa（C）Tg（sst2:Cre）；Tg（hs:CSH）；Tg（ins:Flag-NTR）3岁时受到热休克的胰岛 dpf和GFP（绿色）、胰岛素（红色）和DNA（蓝色）染色。（D） 总生长抑素的定量+、生长抑素+/H2B-GFP型+，胰岛素+和胰岛素+/H2B-GFP型+非消融5-dpf中的细胞Tg（sst2:Cre）；Tg（hs:CSH）；Tg（ins:Flag-NTR）小岛。45%的生长抑素+细胞和1.5%的胰岛素+单元格标记为sst2：Cre（克雷）(n个=15）。（E） 胰岛素定量+和胰岛素+/H2B-GFP型+5-dpf再生胰岛细胞。1%的胰岛素+单元格标记为sst2：Cre（克雷）(n个=9).
图3。
图3。
斑马鱼主胰岛中的标记染色细胞（LRC）检测可以标记α-到-β细胞的转分化。（A，B）LRC分析示意图。（A） 给Zygote注射H2B-RFP公司mRNA。H2B-RFP蛋白的荧光信号通过有丝分裂被稀释。（B） LRC分析标记了来自背芽的静止的早期分化胰腺内分泌细胞。li，肝脏；肠球。（C，D）H2B-RFP标记的5-dpf胰岛的共焦面。（C）TgBAC（神经系统1:EGFP）(n个=4). （D） 野生型胰岛经胰岛素（绿色）、胰高血糖素（蓝色）和生长抑素（白色）染色(n个=5）。（E） H2B-RFP的量化+和H2B-RFP−表达胰岛素、胰高血糖素和生长抑素的细胞(n个全部≥3）。（F） H2B-RFP标记的5-dpf/1-dpa再生胰岛Tg（单位：CFP-NTR）幼虫被CFP（胰岛素，绿色）和胰高血糖素（白色）染色。红色箭头表示H2B-RFP+再生β细胞，白色箭头表示H2B-RFP−胰岛中再生β细胞，黄色箭头表示H2B-RFP−胰外导管区（epd）的β细胞。（G） 1-dpa H2B-RFP的量化+和H2B-RFP−β细胞(n个=7). （H，I）共焦平面显示4-dpf非消融（H）和消融（I）胰岛中Pdx1（红色）和胰高血糖素（绿色）的表达。Pdx1型+α细胞用箭头表示。（J） 4-dpf非消融组织中表达Pdx1的α细胞的定量(n个=5）和烧蚀(n个=6）胰岛。（K） 增殖定量（EdU+)5-dpf非消融胰岛和1-dpa胰岛中的α细胞(n个检查≥7个胰岛）。（L，M）在对照MO注射组（L）和阿克萨（arxa）MO注射（M）5-dpf幼虫。胰高血糖素+中缺少单元格阿克萨（arxa）变形的胰岛。（N） 共焦投影阿克萨（arxa）MO注入5-dpf/1-dpaTg（单位：CFP-NTR）用H2B-RFP标记的胰岛缺乏大多数β细胞再生。箭头表示再生的β细胞。（O） 对照MO注射后1-dpaβ细胞的定量（灰色，n个=16）和阿克萨（arxa）MO注入（红色，n个=19）胰岛*P（P）≤0.05, **P（P）≤0.01, ***P（P）≤0.001; ns，不显著（学生t吨-试验单位：J、K；双向方差分析，然后进行Bonferroni后测（E，O）。
图4。
图4。
胰高血糖素是胰岛发育所必需的。（A） 从4-dpf幼虫分离出的内胚层器官。p、 胰腺；li，肝脏；肠球。（B） 的qPCR胰岛素(英寸)和胰高血糖素(全球气候变化框架)控制和消融幼虫。英寸表达减弱gcga公司再生过程中表达瞬时增加(n个=3个独立实验）。（中-英）gcga公司MO阻断胰高血糖素蛋白的表达并增加α与β细胞的比率。（C-D〃）5-dpf控制MO注入的共焦投影（C）和gcga公司MO注入（D）Tg（gcga:GFP）；Tg（ins:dsRed）幼虫被胰高血糖素染色（红色）。（E） 量化gcga：绿色荧光蛋白+α细胞和英寸+对照MO注射的β细胞(n个=15）和gcga公司注入MO(n个=10）胰岛。（F） H2B-RFP的量化+和H2B-RFP−3和5岁时的β细胞 dpf控制MO注入(n个≥3）和gcga公司MO注入(n个=5）胰岛。Ventral预算衍生H2B-RFP−β细胞在gcga公司变体*P（P）≤0.05, **P（P）≤0.01, ***P（P）≤0.001; ns，无显著性（双向方差分析，Bonferroni后测）。
图5。
图5。
β细胞祖细胞池的差异调节胰高血糖素基因产物。标记的1-dpa H2B-RFP的（A-F）共焦投影Tg（单位：CFP-NTR）控制胰岛（A-C）和gcga公司卫生官员-注射用载体（A，D）、重组胰高血糖素（B，E）或Ex-4（C，F）处理的胰岛（D-F）。对胰岛进行CFP（胰岛素，绿色）和胰高血糖素（白色）免疫染色。使用胰高血糖素或Ex-4注射液可以恢复β细胞再生，但使用Ex-9-39注射液则无法恢复。（G） H2B-RFP的量化+和H2B-RFP−对照再生中的β细胞数(n个=7）和gcga公司MO注射的再生胰岛经载体治疗(n个=9），胰高血糖素(n个=13），例4(n个=12）或Ex-9-39(n个=17）。1-dpa的（H，I）共焦面Tg（gcga:Cre）；Tg（hs:CSH）；Tg（ins:Flag-NTR）控制和gcga公司MO注射的再生胰岛被胰高血糖素（白色）和胰岛素（红色）染色。α细胞在3处标记（白色箭头） MTZ处理前用H2B-GFP测定dpf。黄色箭头表示H2B-GFP+β细胞和蓝色箭头/箭头表示H2B-GFP−β细胞。（J） H2B-GFP的定量+和H2B-GFP−再生控制中的β细胞(n个=10）和gcga公司注入MO(n个=13）胰岛。（K） H2B-RFP的量化+和H2B-RFP−载体或胰高血糖素处理再生胰岛中的β细胞(n个=14). *P（P）≤0.05, **P（P）≤0.01, ***P（P）≤0.001; ns，不显著（双向方差分析，然后在G中进行Bonferroni后测；学生t吨-以J、K为单位进行测试）。
图6。
图6。
胰高血糖素和葡萄糖对β细胞祖细胞池的差异调节。（A，B）共焦投影Tg（单位：CFP-NTR）胰岛用甘露糖（渗透压控制，A）或葡萄糖（B）治疗1天，CFP（胰岛素，绿色）和胰高血糖素（红色）染色。（C） 量化胰岛素+细胞显示葡萄糖处理增加了β细胞质量(n个=18). （D，E）5-dpf/1-dpa的共焦投影H2B-RFP公司mRNA注射的胰岛在再生过程中用甘露糖（D）或葡萄糖（E）处理，并对CFP（绿色）和胰高血糖素（白色）进行染色。（F） H2B-RFP的量化+和H2B-RFP−对照组β细胞(n个=7）和葡萄糖处理(n个=7）胰岛显示H2B-RFP的具体增加−人口。（G-J）5-dpf/1-dpa的共焦投影Tg（单位：CFP-NTR）胰岛注射H2B-RFP公司mRNA单独（G）或联合注射gcga公司MO（H-J）。样品用载体（G，H）、葡萄糖（I）或胰高血糖素（J）处理。（K） H2B-RFP的量化+和H2B-RFP−对照组胰岛细胞(n个=27），gcga公司生产任务单(n个=15),全球气候变化框架MO+葡萄糖(n个=17),gcga公司MO+胰高血糖素(n个=22）治疗。只有胰高血糖素拯救了H2B-RFP+β细胞再生。（五十） 模型整合了胰高血糖素在β细胞形成中的不同作用。β细胞丢失触发α细胞增殖和激活胰高血糖素胰高血糖素和GLP-1的增加从两个来源促进再生：（a）胰高血糖激素/GLP-1在α细胞中自主作用，允许其转分化为β细胞；和（b）胰高血糖素/GLP-1通过中间产物（如肝源葡萄糖）非自主作用，从导管相关祖细胞中驱动β细胞形成*P（P）≤0.05, **P（P）≤0.01; ns，不显著（学生t吨-C、F试验；单向方差分析，然后进行Tukey的事后检验（K）。
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