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.2013年11月13:10:136。
doi:10.1186/1742-2094-10-136。

人类免疫缺陷病毒1型病毒蛋白R（Vpr）通过PI3K和MAPK信号通路诱导星形胶质细胞CCL5表达

Mohitkumar R Gangwani公司, 理查德·诺埃尔, 安基特·沙阿, 瓦妮莎·里维拉-磨坊, 库马尔 1
附属公司

人类免疫缺陷病毒1型病毒蛋白R（Vpr）通过PI3K和MAPK信号通路诱导星形胶质细胞CCL5表达

Mohitkumar R Gangwani公司等。 J神经炎症. .

摘要

背景：尽管目前有抗逆转录病毒疗法，但HIV-1感染者的神经认知障碍仍然普遍存在。越来越明显的是，星形胶质细胞通过产生促炎性细胞因子/趋化因子在HIV-1神经病变中发挥关键作用。HIV-1病毒蛋白R（Vpr）在神经元功能障碍中起重要作用；然而，其在神经炎症中的作用尚不明确。本研究的主要目的是确定Vpr在星形胶质细胞中诱导炎症前趋化因子CCL5的作用，并确定其潜在机制。

方法：SVGA星形胶质细胞要么模拟转染，要么用编码HIV-1 Vpr的质粒转染，然后在不同的时间间隔采集细胞。使用实时RT-PCR定量CCL5表达的mRNA水平，并分析细胞培养上清液中CCL5蛋白的浓度。对HIV-1Vpr转染的星形胶质细胞进行免疫细胞化学检查CCL5的表达。使用特定的化学抑制剂和siRNAs探索了各种信号机制，如p38 MAPK、PI3K/Akt、NF-κB和AP-1。

结果：与模拟转染星形胶质细胞相比，HIV-1 Vpr转染的星形胶质细胞在mRNA和蛋白水平上表现出时间依赖性的CCL5诱导。与未转染和模拟转染星形胶质细胞相比，转染HIV-1 Vpr的星形胶质细胞的免疫染色图像也显示出CCL5的大量积累。与HIV-1 Vpr转染后未经处理的对照组相比，用NF-κB（SC514）和PI3K/Akt（LY294002）抑制剂预处理可部分消除CCL5 mRNA和蛋白表达水平。针对NF-κB、p38δMAPK、Akt-2和Akt-3的p50和p65亚单位以及AP-1转录因子的特异性siRNA显著抑制HIV-1 Vpr转染星形胶质细胞中CCL5的产生。

结论：这些结果证明了HIV-1 Vpr以时间依赖的方式诱导星形胶质细胞CCL5的能力。此外，该效应由转录因子NF-κB和AP-1介导，涉及p38-MAPK和PI3K/Akt途径。

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数字

图1
图1
SVGA星形胶质细胞中HIV-1 Vpr对CCL5的时间依赖性诱导。SVGA细胞被模拟转染或用编码HIV-1 Vpr的质粒转染。在转染后1、3、6、12、24、48和72小时收集细胞，并使用实时RT-PCR测定CCL5表达水平。在转染后6、12、24、48和72小时收集上清液，并使用Bioplex分析测定CCL5的蛋白浓度。（A）相对于模拟转染对照组计算的mRNA表达水平；（B）CCL5的蛋白质浓度。这个钢筋代表平均值 ± 三个独立实验的SE，一式三份。使用Student’st吨-测试**第页 < 0.01, *第页 < 0.05.
图2
图2
HIV-1 Vpr介导的星形胶质细胞CCL5诱导的免疫细胞化学。SVGA星形胶质细胞在盖玻片上培养，并进行模拟转染（D-F）或用编码Vpr的质粒转染（G-I）未转染细胞作为对照（A-C）.细胞核染色(蓝色); CCL5号机组(绿色)和总建筑面积(红色)图像是使用徕卡TCS SP5 II在倒置显微镜平台上用40倍变焦油镜拍摄的。使用Image J软件获取合并图像，并使用Image J中的Multi Measure工具量化强度。（J）图像强度是相对于GFAP绘制的。这个钢筋代表平均值 ± 三个独立图像的SE。使用Student’st吨-测试**第页 < 0.01.
图3
图3
NF-κB参与HIV-1 Vpr介导的星形胶质细胞CCL5上调。SVGA星形胶质细胞用化学抑制剂预处理或用靶向NF-κB通路的siRNA转染，然后模拟转染或用编码Vpr的质粒转染。（A）和（B）NF-κB通路化学抑制剂SC514对CCL5 mRNA表达和蛋白浓度的影响。（C）和（D）抗NF-κB p50和p65亚单位的siRNA分别对CCL5 mRNA表达和蛋白质浓度的影响。这个钢筋代表平均值 ± 三个独立实验的SE，一式三份。使用Student’st吨-测试**第页 < 0.01, *第页 < 0.05.
图4
图4
p38-MAPK和AP-1在HIV-1 Vpr介导的星形胶质细胞CCL5诱导中的作用。在模拟转染或用编码HIV-1 Vpr的质粒转染前1 h，用JNK-MAPK（SP600125）和p38-MAPK（SB203580）通路的化学抑制剂预处理SVGA星形胶质细胞。（A）和（B）化学抑制剂对CCL5 mRNA表达和蛋白浓度的影响。SVGA细胞也被转染以p38亚型（α，β，γ，δ）和AP-1为靶点的siRNA，然后模拟转染或用编码Vpr的质粒转染。（C）和（F）siRNAs对CCL5 mRNA表达的影响；（D）和（G）对CCL5蛋白浓度的影响。（E）p38亚型siRNA对各自亚单位的特异性；（H）用针对p38-MAPK的p38δ亚单位的siRNA抑制AP-1（c-fos）。这个钢筋代表平均值 ± 三个独立实验的SE，一式三份。使用Student’st吨-测试**第页 < 0.01, *第页 < 0.05.
图5
图5
NF-κB的激活涉及HIV-1 Vpr介导的星形胶质细胞CCL5诱导中的PI3K/Akt信号。在模拟转染或用编码HIV-1Vpr的质粒转染前1小时，用PI3K/Akt途径的化学抑制剂（LY294002）预处理SVGA星形胶质细胞。（A）和（B）LY294002对CCL5 mRNA表达和蛋白浓度的影响。SVGA细胞也被转染以Akt亚型（Akt-1、Akt-2和Akt-3）为靶点的siRNA，然后模拟转染或用编码Vpr的质粒转染。（C）和（D）siRNAs分别对CCL5 mRNA表达和蛋白质浓度的影响。（E）Akt亚型siRNA对单个亚单位的特异性。（F）用LY294002抑制NF-κB（p50）核转位。这个钢筋代表平均值 ± 三个独立实验的SE，一式三份。使用Student的t吨-测试**第页 < 0.01, *第页 < 0.05
图6
图6
HIV-1 Vpr诱导星形胶质细胞CCL5的信号通路示意图。HIV-1 Vpr激活SVGA星形胶质细胞中的p38-MAPK-和PI3K/Akt-相关信号通路，从而分别激活转录因子AP-1和NF-κB。NF-κB和AP-1结合到CCL5的启动子区域并增加其在星形胶质细胞中的生成。蓝色代表化学抑制剂的使用，而绿色代表小干扰RNA的使用。特定信号的参与以深色显示，而浅色表示不参与。
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