跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2013年9月27日；288(39):28293-302.
doi:10.1074/jbc。M113.511352。 Epub 2013年8月20日。

MEKK2激酶与14-3-3蛋白的结合调节c-Jun N末端激酶的激活

阿迪·马蒂托 1, 蒂莫西·加博, R蒙哥马利·吉尔, 迈克尔·P·谢德
附属公司

MEKK2激酶与14-3-3蛋白的结合调节c-Jun N末端激酶的激活

阿迪·马蒂托等。 生物化学杂志. .

摘要

MEKK2（MAP/ERK激酶激酶-2）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，属于MAP激酶激酶（MAP（3）Ks）的MEKK/STE11家族。MEKK2将应激和有丝分裂信号整合到NF-κB、JNK1/2、p38和ERK5通路的激活中。我们发现，MEKK2通过与14-3-3（一组调节蛋白质二聚化和关联的适配器）的磷酸化依赖性关联进行调节。我们发现MEKK2在Thr-283被磷酸化，这导致Ser-519的活化环磷酸化降低，从而降低活性。从机制上讲，我们发现在没有14-3-3结合的情况下，MEKK2与无活性的MEKK2相关，这导致Ser-519的反式自磷酸化。与14-3-3的强制结合降低了Ser-519转自磷酸化。在MEKK2（-/-）背景中表达T283A MEKK_2，增强了应激激活的c-Jun N末端激酶活性，同时提高了IL-6的表达，但也降低了ERK激活，相应的增殖率降低。这些结果表明，Thr-283磷酸化是MEKK2活化的重要调控机制。

关键词：细胞增殖；基因表达；Jun N-末端激酶（JNK）；MAP激酶；MEKK2；信号转导。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
MEKK2与Thr-283的14-3-3相关联。 A类、FLAG标记的MEKK3、MEKK2或MEKK2+HA-14-3-3ϵ在293细胞中共表达24小时(IP（IP）)与琼脂糖偶联的抗FLAG，并通过SDS-PAGE进行分离。用抗FLAG和pan-14-3-3免疫印迹法检测MEKK2或MEKK3以及内源性共免疫沉淀14-3-3和HA-14-3-3ϵ。B类，FLAG标记的MEKK2或各种突变体在HEK293细胞中表达，并用抗FLAG缀合的琼脂糖进行免疫沉淀。MEKK2和共免疫沉淀内源性14-3-3被检测为A类用奥德赛红外成像仪检测荧光二级抗体；使用ImageJ软件确定每个波段的密度数字在下面下部面板表示14-3-3信号与FLAG-MEKK2信号的比率。T283A型苏氨酸283被丙氨酸取代；K282R公路，赖氨酸282被精氨酸取代；3.85亿克朗，激酶死亡，赖氨酸385被蛋氨酸取代；P（P），磷酸化。C类在HEK293细胞中表达HA-MEK2、T283A MEK02、K385M MEKK2或空载体24小时。用抗-HA结合琼脂糖免疫沉淀蛋白质，用SDS-PAGE分离蛋白质，并用抗磷酸-Thr-283、抗磷酸-Ser-519、抗-HA和抗14-3-3免疫印迹。奥德赛红外扫描仪的成像过程如下所示B、D类使用单克隆抗MEKK2抗体（BD Biosciences）从RAW264细胞或小鼠胚胎成纤维细胞产生的裂解物中免疫沉淀MEKK_2，经SDS-PAGE分离，并用抗MEK02、抗磷酸-Thr-283或抗14-3-3进行免疫印迹。结果代表了三组独立的实验。
图2。
图2。
Thr-283降低MEKK2活性在体外. A类在HEK293细胞中表达WT MEKK2、T283A MEKK1或K385M MEK2 24 h，并使用抗HA-糖进行免疫沉淀。免疫沉淀物受到在体外激酶反应如“实验程序”所述32通过个人分子成像仪（Bio-Rad Laboratories）观察P-incorated MEKK2，通过抗HA免疫印迹观察总蛋白。误差线表示三次测量的S.D。B类，类似于A类除MKK6肽用作底物并通过液体闪烁计数进行测量外。结果是来自三个独立实验的重复样本的平均值。误差线表示三次测量的S.D。
图3。
图3。
二聚化和反式-MEKK2在Thr-283的自磷酸化。 A类，HA表位标记的MEKK2蛋白在HEK293细胞中单独或与FLAG-K385M-MEK2一起表达。24小时后，HA-MEKK2被免疫沉淀(IP（IP）)用免疫印迹法测定共沉淀FLAG-MEKK2。B类野生型HA-MEK2或HA-MEKK2与FLAG-T283A-MEKK2或FLAG-K385M-MEK2共表达。免疫沉淀HA-标记蛋白，并通过免疫印迹和Odyssey红外扫描仪检测测定Thr-283磷酸化和结合14-3-3的程度。结果代表了三个独立的实验。P（P），磷酸化。
图4。
图4。
14-3-3结合降低Ser-519磷酸化。 A类HA-MEKK2在Thr-283（DE-MEK2）或阴性对照R18肽（KK-MEK2）的位置包含14-3-3结合R18肽，无论是在活性背景还是在激酶背景中。蛋白质被免疫沉淀(IP（IP）)通过免疫印迹法检测内源性14-3-3，并使用Odyssey红外扫描仪进行定量，面板下方显示14-3-3与总MEKK2的比率。B类带有各种突变的HA-MEKK2或MEKK2，包括DE和KK R18肽插入物，与激酶头FLAG-K385M-MEK2共同表达。24小时后，用抗FLAG-琼脂糖免疫沉淀FLAG-K385M-MEKK2，并用奥德赛红外扫描仪免疫印迹抗Ser-519抗体。这个数字面板下方表示磷酸化-Ser-519与总HA-MEKK2的比率。P（P），磷酸化。
图5。
图5。
JNK的MEKK2激活。 A类，FLAG-JNK1α在HEK293细胞中与空载体、野生型MEKK2或T283A-MEK02共表达24小时在体外以GST-c-Jun（1-186）为底物进行激酶分析。通过个人分子成像仪（Bio-Rad）检测标记蛋白。用抗MEKK2免疫印迹法检测裂解产物中MEKK_2的总表达。这个数字图像下方表示与单独矢量相比-倍增加。B类将FLAG-JNK1α与空载体或野生型MEKK2或T283A MEK02转染小鼠胚胎成纤维细胞。24小时后，细胞被血清饥饿4小时，然后用FGF2刺激指定时间。免疫沉淀JNK，测定其活性在体外使用GST-c-Jun（1–186）作为底物。这个误差线表示三次测量的S.D.，并代表两次实验。星号表明第页< 0.05.C类，类似于B类，除了在含血清培养基（无饥饿期）中培养的MEFs用樟柳霉素处理指定的时间。这个误差线表示三次测量的S.D.，并代表两次实验。数字标志表明第页< 0.05.D类用玻璃盖玻片上的WT MEKK2或T283A MEK02转染HEK293细胞。24h后，用3%多聚甲醛固定细胞，用0.25%Triton X-100溶解膜，用小鼠抗FLAG、兔抗磷酸化c-Jun和DAPI染色细胞。荧光图像在奥林巴斯倒置显微镜上以40倍放大率可视化，并使用Q-Capture软件捕获。E类，HELA细胞转染加仑4-Luc记者和Gal4-c-Jun或Gal4-c-Jun+WT MEKK2或T283A MEKK2。24小时后，用樟柳霉素处理细胞4小时，并测定相对于对照aβ-半乳糖苷酶活性的荧光素酶活性。误差线表示三次测量的S.D。
图6。
图6。
MEKK2对IL-6表达的调节。 A类、MEKK2−/−用含有空载体FLAG-WT MEKK2或FLAG-T283A MEKK2cDNA的逆转录病毒感染小鼠胚胎成纤维细胞。在嘌呤霉素中选择5天后，分离耐药池并进行免疫印迹以检测MEKK2的表达。B类，MEKK2的稳定耐嘌呤霉素池−/−将表达各种形式MEKK2的MEFs一式三份以30000个细胞/孔的速度接种在24孔培养皿中，然后用TNFα（1ng/ml）处理18小时。收获上清液，并使用Quantikine免疫测定试剂盒（R&D Systems）定量IL-6。误差线代表S.D。
图7。
图7。
MEKK2表达调节ERK磷酸化和增殖。 A类，MEKK2的稳定耐嘌呤霉素池−/−表达空载体或各种形式MEKK2的MEF在含有0.5%血清的培养基中以4000个细胞/孔的速度在96周的培养皿中培养三次。在试验的每一天，用PBS清洗微孔两次，并在100μl XTT溶液中培养2 h，然后测量450 nm处的吸光度。外径，光密度。B类，类似于A类除血清浓度提高至2%外。C类，MEKK2的稳定耐嘌呤霉素池−/−表达空载体或WT和T283A MEKK2的MEF被血清饥饿4小时，然后用FGF2刺激指定时间。激活环部位内的ERK磷酸化用磷酸特异性抗体进行免疫印迹（细胞信号技术）。D类在含有10%血清的培养基中分离出表达空载体、激酶死亡、WT和T283A MEKK2的MEF，并对ERK磷酸化进行免疫印迹。总磷-ERK的比率(pERK公司)并且使用奥德赛红外扫描仪通过直接荧光测定总ERK。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Blank J.L.、Gerwins P.、Elliott E.M.、Sather S.、Johnson G.L.（1996）丝裂原活化蛋白/ERK激酶激酶（MEKK）2和3的分子克隆：涉及丝裂原激活蛋白激酶和c-Jun激酶的顺序磷酸化途径的调控。生物学杂志。化学。271, 5361–5368-公共医学
    1. Deacon K.，Blank J.L.（1999）MEK激酶3直接激活MKK6和MKK7，它们是p38和c-Jun NH2末端激酶的特异性激活剂。生物学杂志。化学。274, 16604–16610-公共医学
    1. Chao T.H.，Hayashi M.，Tapping R.I.，Kato Y.，Lee J.D.（1999）MEKK3作为大有丝分裂原活化蛋白激酶1（BMK1）信号通路的一部分直接调节MEK5活性。生物学杂志。化学。274, 36035–36038-公共医学
    1. 赵强，李福生（1999）有丝分裂原活化蛋白激酶/ERK激酶激酶2和3通过IκB激酶-α和IκB-激酶-β激活核因子-κB。生物学杂志。化学。274, 8355–8358-公共医学
    1. Garrington T.P.、Ishizuka T.、Papst P.J.、Chayama K.、Webb S.、Yujiri T.、Sun W.、Sather S.、Russell D.M.、Gibson S.B.、Keller G.、Gelfand E.W.、Johnson G.L.（2000）MEKK2基因破坏导致细胞因子产生减少，以应对ES细胞源性肥大细胞的IgE和c-Kit配体刺激。EMBO期刊19，5387–5395-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型