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.2013年5月21日；110（21）：E1923-32。
doi:10.1073/pnas.1303916110。 Epub 2013年5月6日。

层粘连蛋白B1的法尼基化对神经元迁移过程中核染色质的保留很重要

何振荣 1, Chika Nobumori公司, 克里斯·古尔伯恩, 土一平, 约翰·M·李, 安吉利卡·塔塔, 吴彦祖（Daniel Wu）, Yuko Yoshinaga先生, 彼得·德容, 凯瑟琳·科菲尼尔, 洛伦·芳格（Loren G Fong）, 史蒂芬·G·杨
附属公司

层粘连蛋白B1的法尼基化对神经元迁移过程中核染色质的保留很重要

希金荣（Hea-Jin Jung）等。 美国国家科学院程序. .

摘要

蛋白法尼基化在层粘连蛋白A生物发生中的作用以及早衰的发病机制已经进行了相当详细的研究，但法尼基对B型层粘连、层粘连B1和层粘连B2的重要性却很少受到关注。层蛋白B1和B2从发育的早期阶段就在几乎每种细胞类型中表达，它们与细胞核内的多种功能有关。为了评估蛋白法尼基化对B型层粘连蛋白的重要性，我们创建了表达层粘连B1和层粘连B2的非酯基化版本的敲除小鼠。表达非淀粉化层粘连蛋白B2的小鼠发育正常，无疾病。相反，表达非淀粉化层粘连蛋白B1的小鼠出生后不久即死亡，伴有严重的神经发育缺陷和显著的神经元核异常。迁移神经元的核膜被从染色质中拉出，使染色质“裸露”（不受核膜的影响）。因此，层粘连B1（而非层粘连B2）的法尼基化对大脑发育和在神经元迁移期间将染色质保留在核层界限内至关重要。

关键词：CaaX基序；转基因小鼠模型；核分裂；翻译后修饰。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
表达非肉碱化版本的层粘连B1和层粘连B2的敲除小鼠。(A类)旨在创建最小1反恐精英等位基因，其中半胱氨酸（Cys585)的CaaX公司主题最小1被丝氨酸（Ser585). 将一个新的限制性内切酶位点SacI引入相邻序列中，以促进基因分型。外显子被描绘成黑盒子；3′UTR为白色；液氧P站点由黑色箭头表示。5′（黑色）和3′（灰色）长程PCR反应的引物位置用箭头表示。(B类)旨在创建Lmnb2（磅2）反恐精英等位基因，其中半胱氨酸（Cys593)的CaaX公司主题Lmnb2型被丝氨酸（Ser593). 在相邻序列中引入了SalI位点。(C类)5′长程PCR最小1反恐精英等位基因产生8.2kb片段（第2和第3道）。通过SacI消化确认了PCR产物的身份；SacI片段（考虑到新引入的SacI位点）的长度为2.4、2.2、2.0、1.1和0.6 kb（第4和第5道）。未从野生型DNA中扩增出PCR产物（车道6）。(D类)3′长程PCR最小1反恐精英等位基因产生4.5kb片段（第2和第3道）。未从野生型DNA中扩增出PCR产物（车道4）。(E类)使用Lmnb2（磅2）反恐精英等位基因，5′长程PCR产生8.7-kb片段。PCR产物的身份通过SalI消化验证（对于新引入的SalI位点，预期产物为5.8 kb和2.9 kb）（通道4和5）。未获得野生型DNA的PCR产物（第6道）。(F类)3′长程PCRLmnb2（磅2）反恐精英等位基因产生5.2-kb片段（第2、4、5、7和8道）。未获得野生型DNA的PCR产物（3、6和9道）。
图2。
图2。
的表型最小1碳钢/碳钢和Lmnb2（磅2）碳钢/碳钢MEF公司。(A类和B类)代谢标记研究显示，在最小1碳钢/碳钢和Lmnb2（磅2）碳钢/碳钢分别为MEF。野生型(最小1+/+和Lmnb2（磅2）+/+),最小1碳钢/碳钢、和Lmnb2（磅2）碳钢/碳钢将MEFs与法尼醇类似物AG孵育，并通过用AG特异性单克隆抗体进行蛋白质印迹来检测用AG标记的蛋白质（31）。层粘连蛋白B1最小1碳钢/碳钢MEFs和层粘连蛋白B2Lmnb2（磅2）碳钢/碳钢AG未对MEF进行标记(C类和D类)非甲酰化版本的层粘连蛋白B1和层粘连蛋白质B2的电泳迁移率发生改变。蛋白质提取物最小1+/+,最小1碳钢/碳钢,Lmnb2（磅2）+/+、和Lmnb2（磅2）碳钢/碳钢MEF在7%（wt/vol）醋酸三钠SDS/PAGE凝胶上进行大小分级，并用抗层粘连蛋白B1、层粘连蛋白质B2或层粘连蛋白酶C的抗体进行蛋白质印迹最小1碳钢/碳钢MEF和非甲酰胺B2Lmnb2（磅2）碳钢/碳钢在野生型细胞中，MEF的迁移速度比法尼基-层粘连蛋白B1和法尼基–层粘连肽B2慢。(E类)免疫荧光显微镜最小1碳钢/碳钢和Lmnb2（磅2）碳钢/碳钢抗LAP2β（层粘连相关多肽2；绿色）和层粘连B1（红色）或层粘连B2（红色）抗体的MEF。沿z（z）轴被捕获并合并（Zen 2010软件；蔡司）。在许多国家最小1碳钢/碳钢MEF、LAP2β和层粘连蛋白B1呈蜂窝状分布。（比例尺，20µm）(F类)通过原子核的光学截面最小1碳钢/碳钢MEF沿线z（z）轴(左侧，顶部区域；居中，中部地区；对，底部区域）。尽管核呈蜂窝状，但层粘连蛋白B1仍集中在核边缘(居中). （比例尺，10µm）(G公司)原发性脑脊髓炎蜂窝细胞核表型的频率。对于每个细胞系，两名独立观察者以盲法对>100个细胞进行评分。从左到右，WT(最小1+/+),n个＝3个细胞系；B1CS型(最小1碳钢/碳钢),n个=5；重量(Lmnb2（磅2）+/+),n个= 3; B2CS公司(Lmnb2（磅2）碳钢/碳钢),n个= 3; 重量(最小1+/+),n个= 3; HET公司(最小1+/负极),n个= 4; 和B1KO(最小1−/−),n个= 2. 蜂窝状核表型在最小1碳钢/碳钢比中的单元格最小1+/负极单元格(P（P）< 0.0001). 数值代表平均值±标准偏差。
图3。
图3。
最小1碳钢/碳钢胚胎的大脑较小，大脑皮层神经元分层有缺陷。(A类–C类)野生型照片，最小1碳钢/碳钢,Lmnb2（磅2）碳钢/碳钢,最小1+/负极、和最小1−/−E19-出生后第1天的小鼠（P）1。（比例尺，5 mm。）(D类–F类)从E19–P1顶部观察小鼠大脑。（比例尺，1 mm。）(G公司–我)E19–P1冠状面和矢状面脑切片的H&E染色。（比例尺，1 mm。）(J)野生型大脑皮层和中脑的大小，最小1碳钢/碳钢（B1CS），以及Lmnb2（磅2）碳钢/碳钢（B2CS）胚胎（从大脑顶部测量，见E类).最小1+/+,n个= 6;最小1碳钢/碳钢,n个= 5;Lmnb2（磅2）+/+,n个= 4;Lmnb2（磅2）碳钢/碳钢,n个= 5. 中脑在最小1碳钢/碳钢小鼠比野生型小鼠，P（P）< 0.0001; 大脑皮层在最小1碳钢/碳钢小鼠比野生型小鼠，P（P）= 0.0072. 数值代表平均值±SD(K（K）)E19–P1野生型（WT，最小1+/+),最小1碳钢/碳钢（B1CS），Lmnb2（磅2）碳钢/碳钢（B2CS），最小1+/负极、和最小1−/−带有Cux1（红色）和Ctip2（绿色）抗体的胚胎。大脑皮层神经元的分层最小1−/−如前所述，胚胎异常（24）。最小1碳钢/碳钢小鼠也表现出皮层分层缺陷，但比最小1−/−老鼠。在中未检测到异常最小1+/负极老鼠。（比例尺，100µm）
图4。
图4。
脑内哑铃状核的免疫荧光显微镜图像最小1秒/秒神经元（核膜与染色质分开的地方）。从E13.5中分离出皮层NPC最小1+/+和最小1秒/秒胚胎，在含血清培养基中培养，生成神经球。然后将神经球培养在分化培养基中，以促进神经元分化和迁移。(A类)用抗LAP2β抗体（绿色）和层粘连蛋白B1抗体（红色）染色的细胞的低倍放大图像。DNA用DAPI（蓝色）染色。图中显示了神经元在神经球边缘附近迁移的图像（位于图像底部）。The nuclei of最小1+/+神经元多为圆形，LAP2β和层粘连蛋白B1主要位于核边缘。相反，许多移民最小1碳钢/碳钢神经元有被LAP2β包围的哑铃状核（轮廓为白色）。[在高清晰度图像中，LAP2β在细胞核两端的定位清晰（图5A类).] 在这些细胞中，在哑铃的一端发现了非肉碱化的层粘连蛋白B1，但大部分染色质位于哑铃的另一端，缺少层粘连肽B1（裸染色质）。（比例尺，20µm）(B类)迁移的高倍图像最小1碳钢/碳钢用抗中心蛋白（绿色）和层粘连蛋白B1（红色）抗体染色的神经元。用DAPI（白色）观察DNA。在哑铃状最小1碳钢/碳钢根据中心蛋白染色判断，核层粘连蛋白B1总是靠近细胞前缘；在后缘（箭头）发现裸染色质。连接哑铃形细胞核两端的DNA细链的长度是可变的，但有时长度超过70µm。（比例尺，10µm）
图5。
图5。
神经元从神经球向外迁移的免疫荧光显微镜图像，说明核膜蛋白的不对称分布。(A类和B类)神经元染色为中心蛋白（绿色）、LAP2β（红色）和层粘连蛋白B1（洋红色）；(C类和D类)中心蛋白（绿色）和层粘连蛋白B2（红色）；(E类)SUN1（绿色）和Nup98（红色）；和(F类)Nup153（绿色）和Nup98（红色）。DNA用DAPI染色（白色除外上部的面积E类和F类，其中它是蓝色的）。在最小1秒/秒神经元、层粘连蛋白B2、SUN1和Nup98主要位于哑铃状核的前端(A类,C类、和E类; 箭头），但另一端含有无核层染色质（箭头）。在哑铃形细胞核的尾端观察到少量的SUN1和Nup98残留物(E类). 在Lmnb2（磅2）碳钢/碳钢神经元，核膜蛋白通常位于核边缘(B类,D类,F类). （比例尺，10µm）
图6。
图6。
哑铃形核最小1−/−神经元。(A类–C类)免疫荧光显微镜图像最小1+/+和最小1−/−神经元从神经球迁移，显示层粘连蛋白B2和核孔蛋白Nup98和Nup153在最小1−/−神经元。(A类)最小1+/+和最小1−/−用抗中心蛋白（绿色）、LAP2β（红色）和层粘连蛋白B1（品红）抗体染色的神经元；(B类)中心蛋白（绿色）和层粘连蛋白B2（红色）；(C类)Nup98（红色）和Nup153（绿色）。用DAPI观察DNA（白色除外上部的面积C类，其中它是蓝色的）。(D类)WT和突变神经元中哑铃状核的频率。从左到右，最小1+/+（野生型），n个= 4;最小1碳钢/碳钢（B1CS），n个= 5;Lmnb2（磅2）+/+（重量），n个= 1;Lmnb2（磅2）碳钢/碳钢（B2CS），n个= 1;最小1+/+（重量），n个= 4;最小1+/负极（HET），n个= 3;最小1−/−（B1KO），n个= 3. 对于每个细胞系，两个独立的观察者以盲法对180个以上的细胞进行计数。数值代表平均值±标准偏差。
图7。
图7。
E19–P1中脑（上丘）的免疫荧光显微镜检查最小1+/+和最小1碳钢/碳钢胚胎。(A类)低清晰度图像最小1秒/秒中脑显示染色质裸露的细胞核分布广泛。黄色区域如所示B类（比例尺，20µm）(B类和C类)的高倍图像最小1碳钢/碳钢和最小1+/+中脑。切片用LAP2β（绿色）和层粘连蛋白B1（红色）抗体染色；用DAPI（白色）观察DNA。许多神经元位于最小1碳钢/碳钢小鼠被拉长，层粘连蛋白B1（箭头）分布不对称，染色质缺乏层粘连素B1（箭头式）。裸染色质周围的LAP2β常呈不规则分布，有时呈蜂窝状分布。（比例尺，10µm）(D类)中脑切片染色层粘连蛋白B2（品红色）。拉明B2也不对称地分布在细胞核的一端（箭头所示）。箭头表示染色质裸露。（比例尺，10µm）
图8。
图8。
E17.5大脑皮层细胞核的电子显微照片最小1+/+,最小1碳钢/碳钢,Lmnb2（磅2）CS公司/+、和Lmnb2（磅2）碳钢/碳钢胚胎。(A类和B类)低放大电子显微照片。许多皮层细胞最小1碳钢/碳钢胚胎，但不是野生型或Lmnb2（磅2）秒/秒胚胎出现核泡（箭头）。（比例尺：4µm inA类; 3µm英寸B类.) (C类)大脑皮层核泡的高清晰度图像最小1秒/秒胚胎。气泡中只有少量染色质（箭头所示）。（比例尺，1µm）(D类)大脑皮层的EM断层扫描最小1碳钢/碳钢胚胎。(左侧和居中)细胞核共135个截面的两个截面，跨度200 nm。(对)内部（红色）和外部（绿色）核膜的3D建模，通过追踪断层图每五个部分（共14个部分）的核膜生成。在许多切片中，由于切片平面的原因，内外核膜重叠。核泡中的内外核膜通常紧密相连，但偶尔分离。（比例尺，1µm）
图9。
图9。
一个解释迁移神经元中哑铃状核和裸染色质的模型最小1碳钢/碳钢老鼠。(左侧)野生型小鼠神经元的核纹层（绿色）(最小1+/+)紧密编织，并通过B型层粘连蛋白（红色）上的法尼基脂质锚定固定在内核膜上。在神经元迁移过程中，细胞核被微管相关的动力蛋白马达（黄色）拉向细胞前缘的中心体（橙色）。将细胞核向前拉取决于微管网络（灰色链）与核膜的LINC复合体（SUN1/2，紫色；Nesprin-1/2，粉红色）之间的连接，以及LINC复合物与核膜之间的连接。(对)在最小1碳钢/碳钢神经元，由于层压板B1上没有法尼基脂质锚定，核膜不再紧密地粘附在内核膜上（在核膜和内核膜之间形成一个潜在的空间）。此外，B型层压板呈现蜂窝状分布（即“核层压板网”未紧密编织）。在神经元迁移过程中，核膜向前拉，就像野生型小鼠一样，但染色质（蓝色）从核膜的边界（通过蜂窝状孔）逃逸到核膜和内核膜之间的空间。这个过程产生了哑铃状的细胞核，其中核膜位于哑铃的一端（最靠近细胞的前缘）；染色质的大部分位于哑铃的另一端（被核膜包围）。
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参考文献

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