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.2011;6（12）：e28532。
doi:10.1371/journal.pone.0028532。 Epub 2011年12月9日。

保守的BK通道蛋白相互作用揭示了与细胞死亡和存活相关的信号

伯恩德·索科洛夫斯基 1, 桑德拉果园, 玛格丽特·哈维, 塞图·斯里达尔, 酒井佳久
附属机构

保守的BK通道蛋白相互作用揭示了与细胞死亡和存活相关的信号

伯恩德·索科洛夫斯基等。 公共科学图书馆一号. 2011.

勘误表in

  • 公共科学图书馆一号。2012;7(1). doi:10.1371/annotation/15e95626-9f5c-4882-ba78-826b80c48028

摘要

大电导Ca（2+）激活的K（+）（BK）通道及其β亚基是非哺乳动物感觉或毛细胞调节的基础，而哺乳动物的功能则不太清楚。为了深入了解物种差异并揭示可能的BK功能，我们对鸡耳蜗中的BK和BK-相关蛋白（BKAPS）进行了系统分析，并将这些结果与其他物种进行了比较。我们使用共免疫沉淀、2-D凝胶和LC-MS/MS从细胞质和膜/细胞骨架组分中鉴定了110个可能的伙伴。伙伴包括14-3-3γ、含缬氨酸蛋白（VCP）、stathmin（STMN）、皮质素（CTTN）和抑制素（PHB），其中16例经双向共免疫沉淀证实。生物信息学揭示了二进制伙伴、由此产生的相互作用组、亚细胞定位和细胞过程。相互作用组包含193个蛋白质，涉及内质网、线粒体和细胞核等亚细胞隔室中190个二元相互作用。与小鼠的比较显示，共有的中枢蛋白包括N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）和ATP合成酶。对六个物种的正交分析显示，鸡、小鼠和人的细胞凋亡、Ca（2+）结合和贩运等保守相互作用。在异源表达系统中使用重组BK和RNAi进行的功能研究表明，对细胞死亡/存活重要的蛋白质，如膜联蛋白A5、γ-肌动蛋白、层粘连蛋白、超氧化物歧化酶和VCP，导致BK表达降低。这一发现导致了对与细胞活性相关的特定激酶及其效应器的研究。对10个物种的BK C末端的序列分析显示了14-3-3、RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（Akt）、糖原合成酶激酶-3β（GSK3β）和磷脂酰肌醇依赖性激酶-1（PDK1）的推定结合位点。敲除14-3-3和Akt导致BK表达增加，而沉默GSK3β和PDK1则产生相反的效果。这种比较系统方法表明，除了可能包括启动与细胞死亡/存活相关的信号的新功能外，不同物种的BK功能也保持不变。

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数字

图1
图1。BK相互作用通过双向凝胶电泳和coIP相互作用解决。
(A、 B类)鸡膜/细胞骨架和细胞质组分显示出免疫沉淀凝胶中60和50个不同编号的斑点，这些凝胶经过LC-MS/MS分析。由卵圆形分隔的区域代表两种组分共有的蛋白质。(C类)，16个具有代表性的BKAP相互作用coIPs（通道2；+，−）和BK IP（通道3；+，-）的示例显示鸡耳蜗中BK的免疫活性肽物种为～90或120kDa。用肽预吸附抗BK抗体的阴性对照不产生BKAP相互coIP（泳道5；+，+）或BK-IP（泳道6；+，+）的免疫反应带。55kDa条带对应于重免疫球蛋白（IgG），这是由于交叉反应或使用相同克隆性的抗体所致。珠状对照品由溶血物与无抗体的蛋白G珠混合而成（第4和第7道；−，−）。车道“M”是分子量标记。
图2
图2。BK与耳蜗相互作用。
(A类)使用Cytoscape对初级和次级BKAP进行可视化显示，发现了19个网络，涉及193个蛋白质和190个相互作用。在这些蛋白质中，119个是与136条边相连的节点，形成一个单一的全球网络。在这个网络中，有8个主要枢纽，由一个节点组成，连接到6个或更多节点，这些节点可能与更大的网络相连，也可能不与之相连。这些主要枢纽中的中心节点包括蛋白激酶C、ATP合酶β、γ-肌动蛋白、蛋白质SET、，Na/K转运ATP酶、过渡性ER ATP酶（VCP）、钙调素和NMDA受体。(B类)其余的BKAP由71个节点和53条边组成，形成18个较小、不同的模块，节点数不超过19个。有两个由具有6个或更多蛋白质的中心节点组成的枢纽。中心节点由ser/thr磷酸酶PP1α和核苷二磷酸激酶B组成(C类)包含老鼠和小鸡共有的BKAP的交互组由一个全球网络组成，其中45个节点与47条边相连。该网络中有两个主要枢纽，由一个节点组成，连接到6个以上的节点，这些节点可能与更大的网络相连，也可能不相连。这些枢纽中的中心节点包括NMDA受体和ATP合成酶。其余的BKAP由14个节点和9条边组成，形成5个较小的模块，节点不超过5个。不同颜色的节点表示来自膜/细胞骨架或细胞质部分或IntAct数据库的贡献。不同颜色的边缘表示来自BK coIP分析或IntAct的相互作用。彩色字段表示位于不同亚细胞位置的网络部分。与耳聋相关的BKAP/NIHL由星号表示。
图3
图3。BKAP与离子通道、亚细胞定位和细胞过程的关系。
(A类)PubMed的人工挖掘揭示了从鸡耳蜗膜和细胞质部分分离的BKAP的离子通道伙伴。两个主要合作伙伴是Ca2+和K+然而，约24%是新的相关性，9–10%以前被报道为BKAP。只有不到10%的人是Na等渠道的合作伙伴+、TRP、Cl−和VDAC。(B类)对UniProtKB的搜索发现，BKAP定位于不同的亚细胞隔室。虽然大多数存在于膜、细胞质和线粒体中，但10%以上的细胞定位于内质网、高尔基体和细胞骨架。(C类)基因本体论、GOSlim和PubMed的挖掘表明，15%以上的细胞过程包括信号传递、代谢、发育/分化、贩运/支架和磷酸化。
图4
图4。六个物种iKOG的系统学保守模式。
树状图显示了常见的问号(A类)仅限小鸡(B类)仅限鼠标，或(C类)小鸡和老鼠。图中的每一行对应六种真核生物中的一种，每一列对应iKOG对。iKOG对的（+，+）、（−，−）或（+，−或−，+）成员对每个真核生物都是保守的。一些剖面被分离成保守的功能簇，如运输、Ca2+结合与伴侣蛋白、信号转导等。
图5
图5。特征在体外使用siRNA的BK和BKAP。
(A、 B类)用HA-BK和siRNAs转染CHO细胞表明，与scRNA对照组相比，内源性14-3-3γ和AnxA5的敲除增加了BK的表达。(C–F类)与scRNA对照相比，沉默γ-肌动蛋白、VCP、SOD1和LMNA可降低BK的表达。在给定的一组车道内，密度测定值被归一化为最高密度测定值（归一化至100%），包括sc-和siRNA-处理细胞的三倍。使用未配对的双尾数据确定统计显著性t吨-测试以获得**，第页<0.001. 误差条代表S.D。
图6
图6。生命/死亡信号的假定结合位点改变了BK的表达。
(A、 B类)10种不同脊椎动物的BK C末端对Akt1、14-3-3γ、GSK3β和PDK1具有假定的结合位点。(C类)Akt1、PDK和GSK3β与BK相互作用，如使用总耳蜗裂解物的coIP相互作用所证实的。照片上方的标签表示用于coIP的抗体，而照片下方的标签表示免疫沉淀的蛋白质。Akt1共免疫沉淀一种亚型BK（130 kDa），而GSK3β和PDK1共免疫沉淀多种亚型（90–130 kDa.）。在相互实验中，BK共免疫沉淀Akt1（56kDa）、GSK3β（47kDa）和PDK1（63kDa）。IgG带用（*）表示。(D–F型)用HA-BK和scRNA转染CHO细胞，或用HA-BK和siRNA转染Akt1、PDK和GSK3β。HA-BK随着Akt的敲除而增加，随着GSK3β和PDK1的敲减而减少。将密度测量值归一化，并在D–F中确定统计显著性，如图5所示，以获得*，第页<0.01, **,第页<0.001. 误差条代表S.D。
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