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.2011年6月9日；70(5):1005-19.
doi:10.1016/j.neuron.2011.04.019。

蛋白激酶C的钙依赖性亚型介导Held花萼强直后增强

迪亚萨努·菲奥拉万特 1, 朱云香, 迈克尔·H·米奥加, 迈克尔·雷格斯, 韦德·G·雷格尔
附属公司

蛋白激酶C的钙依赖性异构体介导Held肾盏的糖尿病后增强

迪亚萨努·菲奥拉万特等。 神经元. .

摘要

高频刺激导致诱发的突触传递振幅的短暂增加，这被称为强直后电位（PTP）。在这里，我们研究了钙依赖性蛋白激酶C亚型PKCα和PKCβ在Held突触花萼PTP中的作用。在PKCα/β双基因敲除中，80%的PTP被消除，而基础突触特性不受影响。PKCα和PKCβ通过增加高频刺激诱发的易释放囊泡池的大小以及增加第一次刺激释放的囊泡池比例来产生PTP。PKCα和PKCβ不促进突触前钙电流。双基因敲除中残留的小PTP部分由微型兴奋性突触后电流振幅增加介导，部分由肌球蛋白轻链激酶机制介导。这些实验证明PKCα和PKCβ对PTP至关重要，并表明强直刺激产生的突触前长时间钙增加可能激活这些亚型产生PTP。

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数字

图1
图1。PKCα和PKCβ在梯形体内侧核的免疫组织化学定位
含有MNTB的脑片被标记为PKCα或PKCβ抗体（绿色），并与突触前标记物vGlut1抗体（红色）联合标记。相邻的图像对对应于通过绿色和红色通道成像的同一视野。显示了野生型（wt）、PKCα敲除（α−/−）、PKC-β敲除（β−/–）和双敲除（a-−/β−）动物切片的PKCα/vGlut1和PKCβ/vGlu1的代表性图像。
图2
图2。PKC的钙依赖性亚型是Held花萼强直后增强（PTP）所必需的
（A至D），典型实验中归一化EPSC振幅随时间变化的曲线。t=0 s时，100 Hz下400个刺激序列(倒三角形)用于诱导PTP。插图显示了第二次增强响应的痕迹(光线痕迹)叠加到平均基线响应(粗体迹线). 将PKCα敲除（B）、PKCβ敲除（C）或PKCα/β双敲除（D）中诱导的PTP与野生型同卵双胞胎对照（A）进行比较。这些基因操作显著影响PTP振幅（p<0.01）。（E） ，2的归一化振幅的累积直方图第野生型（黑色）、PKCα（绿色）、PKC-β（红色）和双敲除（紫色）组的增强反应。（F） ，对照组和PKC敲除组的平均EPSC振幅（±SEM），绘制为时间的函数。EPSCs在平均之前标准化为基线。
图3
图3。PKCα/β的缺失会削弱PTP诱导的易释放池大小和释放概率的增加，而不会影响基础释放特性
（A） ，100 Hz刺激序列诱发EPSC的典型示例。（B） ，在100 Hz、0.4 s序列中，将归一化EPSC振幅作为刺激数的函数绘制到野生型（黑色）或双敲除型（紫色）动物的切片中。（C） ，累计EPSC绘制为刺激数的函数。最后15个点的线性拟合（灰线）与y轴截距反向相加，用于获得∑EPSC0，并提供一系列刺激物（RRP）释放的易释放池大小的测量火车). （D） ，野生型（黑色）和双基因敲除（紫色）组的归一化累积EPSC图。（E到G），基本∑EPSC0（E） ，如果0（RRP的分数火车由第一刺激（F）和斜率（G）测量释放，用于野生型（黑色）和双基因敲除（紫色）组。（H至I），对PTP诱导序列的前40个刺激的累积EPSC（1标准列车；100赫兹，4秒；打开的符号)和a 2第列车（100 Hz，0.4 s）在10 s后交付(闭合符号)，用于野生型（黑色）（H）和双基因敲除（紫色）（I）组。（J） ，∑EPSC的比率图0,如果0野生型（黑色）和双基因敲除型（紫色）组的斜率。PKCα/β的缺失显著降低RRP的增加火车以及坡度，在较小程度上如果0.*p<0.01。
图4
图4。肌球蛋白轻链激酶对PTP的贡献有限
（A至B），标准化EPSC振幅与PTP诱导强直前后时间的关系图(倒三角形)野生型（黑色）和双基因敲除型（紫色）动物切片。用MLCK抑制剂ML9培养(填充符号)部分受影响的PTP。（C至D），与ML9一起孵育的野生型（C）和双敲除（D）动物切片中作为刺激数函数的累积EPSC图。灰色线是对最后15个点的线性拟合。（E至F），比率图（2第列车/1标准列车）用于∑EPSC0,如果0以及线性拟合的斜率。ML9孵化(实心钢筋)显著减少如果0在野生型（黑色）和双淘汰赛（紫色）中。*p<0.05。
图5
图5。野生型和PKCα−/−β−/–动物突触前残余钙信号和钙进入
（A） ，一个充满Alexa 594-右旋糖酐和钙绿-1右旋糖聚糖的花萼的双光子图像。比例尺：20μm。（B）,单一刺激诱发的荧光钙瞬变。（C） ，残余钙（Ca）图物件,顶部)和钙内流(底部)野生型（黑色）和双基因敲除型（紫色）动物切片。倒三角表示100 Hz，4 s破伤风，以诱发PTP。
图6
图6。强直化后自发传递的增加与PKCα和PKCβ无关
（A） ，之前自发传播的代表性记录（基础；左边)以及之后(正确的)来自野生型（黑色）、PKCα（绿色）、PKCβ（红色）和双敲除（紫色）动物的切片的tetanization。（B） ，破伤风后平均mEPSC频率的累积直方图，归一化为破伤风前。（C） ，作为野生型时间函数的归一化平均mEPSC频率图(○), PKCα(○), PKCβ(○) 和双重淘汰赛(○) 组。在t=0秒时，发生4秒100赫兹破伤风(倒三角形). 4组间无统计学差异。
图7
图7。强直刺激后mEPSC大小的增加与PKCα和PKCβ无关
（A至D），显示了野生型（A，黑色）、PKCα敲除（B，绿色）、PKC-β敲除（C，红色）和双敲除（D，紫色）组在刺激前（光照轨迹，刺激前25 s间隔）和4 s，100 Hz破伤风后（粗体轨迹，破伤风结束后2–12 s）记录的mEPSC振幅的代表性分布。为了便于比较分布，mEPSC分布表示为每个2-pA箱对检测到的事件总数的分数贡献。（E） ，破伤风后平均mEPSC振幅的累积直方图，归一化为破伤风前。（F） ，作为野生型时间函数的归一化平均mEPSC频率图(○), PKCα(○), PKCβ(○) 和双重淘汰赛(○) 组。
图8
图8。PKC钙依赖亚型对佛波酯介导的突触可塑性的贡献
在t=0 s时，涂抹佛波酯PDBu（1μM），监测对诱发EPSC振幅（A至F）和mEPSC频率（G至I）的影响。不同基因型对应的实验以不同的颜色显示：野生型（黑色）、PKCα（绿色）、PKC-β（红色）和双基因敲除（紫色）组。代表性实验显示了野生型（A）、PKCα敲除（B）、PKC-β敲除（C）和PKCα/β双敲除（D）对诱发EPSCs的影响。（E） PDBu中EPSC增强的累积直方图。（F） ，平均EPSC振幅（±SEM）作为时间函数绘制。（G） ，代表性实验显示mEPSCs之前(左边)和期间(正确的)PDBu的应用。（H） PDBu中mEPSC增强的累积直方图。（一） ，平均mEPSC频率（±SEM）作为时间函数绘制。
图9
图9。野生型和PKC基因敲除动物脑片突触传递特性综述
（A到E，顶部)，破伤风诱发（A至D，顶部)和PDBu诱导的（E，顶部)比较了野生型（黑色）、PKCα敲除（绿色）、PKCβ敲除（红色）和双敲除（紫色）突触传递特性的变化。不同基因型的突触增强程度与野生型动物一致。4s，100Hz刺激诱发PTP及mEPSC频率和振幅增强。（A到E，底部)，显示了不同类型的突触调制示例，并指出了它们对PKCα和PKCβ的依赖性。
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