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.2009年1月12日;184(1):45-55.
doi:10.1083/jcb.200804155。

拉明B1通过Oct-1控制氧化应激反应

附属公司

拉明B1通过Oct-1控制氧化应激反应

阿什拉夫·马哈斯等。 J细胞生物学. .

摘要

层粘连蛋白与染色质和转录因子的相互作用调节转录。Oct-1先前已被证明部分与B型层粘连蛋白共定位,并且对氧化应激反应基因的转录调控至关重要。通过顺序提取、免疫共沉淀(IP)、光漂白中的荧光损失和荧光共振能量转移,我们确认了核外周的Oct-1-lamin-B1关联,并表明这种关联在Lmnb1(Delta/Delta)细胞中丢失。我们发现,Lmnb1(Delta/Delta)细胞中的几个Oct-1-依赖基因(包括参与氧化应激反应的子集)失调。电泳迁移率变化分析和染色质IP显示,Oct-1与失调基因的假定八聚体结合序列结合,并且在缺乏功能性层粘连B1的细胞中这种活性增加。与Oct1(-/-)细胞一样,Lmnb1(Delta/Delta)细胞的活性氧水平升高,更容易受到氧化应激的影响。层粘连蛋白B1在核外周的Oct-1序列可能是核膜调节基因表达并促进细胞对应激、发育和衰老的反应的机制。

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数字

图1。
图1。
Oct-1与层粘连蛋白B1紧密相关。(A) 来自WT和最小1Δ/Δ细胞进行连续提取并通过Western blotting进行分析。数字表示一个代表性实验中每个分数中Oct-1信号的百分比。(B) Oct-1与WT裂解物中的层粘连蛋白B1共免疫沉淀,但不是10月1日−/−最小1Δ/Δ细胞。左侧面板显示输入样本的免疫印迹,右侧面板显示免疫沉淀物的免疫印记。免疫沉淀物与抗羊重链的对照染色证实了每个样品中的等效沉淀效率。(C) 10月1日–EGFP在活WT中显示出核外周联系,但在最小1Δ/Δ细胞。(D) WT中的FLIP和最小1Δ/Δ表达Oct-1–EGFP的细胞。(左)使用光漂白区域外的核周边ROI测量光漂白后的荧光损失(显示平均值±SD;n个=10)。这些结果表明,Oct-1–EGFP与包含全长层粘连B1的外周核板紧密相关。(右)核质ROI的定量FLIP表明,WT或WT中表达的核质Oct-1–EGFP的稳定性没有显著差异最小1Δ/Δ细胞。(E) Oct-1与层粘连蛋白B1紧密相关,但与层粘着蛋白A/C无关。FRET按照材料和方法进行。红色方框(图像)和线条(图)表示使用543-nm激光进行受体光漂白所选的ROI,而绿色方框和线条表示在光漂白区域内选择的ROI以进行FRET分析。图中的阴影区域显示了漂白的时间。请注意,漂白层粘连蛋白B1(顶部)后,供体(绿色)荧光增强,而不是层粘连蛋白质A/C(底部),这表明与Oct-1相关的核层粘连成分确实是层粘连酶B1而不是层粘蛋白A/C。显示了一幅代表性图像(层粘连素B1的FRET效率为5%),但在三个独立的实验中,20个核团的FRET效率平均值(层粘连B1和层粘连A/C分别为4.63±1.4%SD和0±0.75%SD)在使用Student’s试验(P<0.01)。
图2。
图2。
10月1日,从核层释放最小1Δ/Δ细胞更容易与目标DNA序列结合。EMSA使用FAM标记的Oct-1共识结合寡核苷酸进行。在WT和最小1Δ/Δ但不在10月1日−/−核提取物。使用最小1Δ/Δ提取也增加了(位移带的相对强度最小1Δ/Δ与此代表性实验中的WT=1.94相比),表明从核薄片释放的Oct-1可以占据更多的靶点。
图3。
图3。
原木散点图2基因的折叠变化10月1日−/−最小1Δ/Δ细胞。阴影区域显示的是未改变或适度失调的基因,以0.5为界。在Oct-1缺陷细胞中只有54个基因显著失调,而在最小1Δ/Δ细胞(黄色),而1030个基因在最小1Δ/Δ细胞而不是Oct-1缺陷细胞(橙色)。阴影区外的基因是指在两种缺陷细胞类型中显著失调的基因(即,其调节依赖于Oct-1和层粘连B1)。还有1937个基因在两种细胞类型(中央蓝色区域)中都没有失调。
图4。
图4。
Oct-1可以与Oct-1和层粘连蛋白B1缺陷细胞中失调基因调控区内的靶序列结合。(A) 核提取物中的Oct-1最小1Δ/Δ细胞在启动子区使用一致的Oct-1结合寡核苷酸(Cons)和预测的Oct-1-结合序列显示带移位路1像素3结合的特异性通过包含过量的非标记一致性寡核苷酸(+通道)来证实,这降低了移位带的强度。(B) 在以下情况下,位移带更强烈最小1Δ/Δ从核膜释放Oct-1的提取物。相对强度值(最小1Δ/Δ/WT)为2.44路1和1.68像素3使用管理1百万像素13(图S3,可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200804155/DC1).
图5。
图5。
Oct-1与靶序列结合的富集最小1Δ/Δ细胞。ChIP之后最小1Δ/Δ和WT细胞使用抗Oct-1抗体,通过定量实时PCR检测目标基因,如材料和方法中所述。格纳尔1.(A和B)注意Actb公司该序列没有Oct-1结合序列,因此,未检测到结合富集。还显示了使用ChIP分析的Oct-1结合位点的MAPPER得分和E值以及MAPPER Oct-1-结合模型。(C) 老鼠格纳尔启动子区域有几个潜在的Oct-1结合位点。使用两组产生两个PCR产物的引物来检测10月1日在格纳尔发起人。格纳尔2被富集,而格纳尔1没有,表明Oct-1优先与格纳尔2.所示数据来自两个单独的核提取物,一式三份,均数±SD。序列比对数据如图S4所示(可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200804155/DC1).
图6。
图6。
最小1Δ/Δ细胞更容易受到氧化应激的影响,并具有高水平的活性氧。(A) 百分比表示与平行分析的相同类型细胞的未处理孔相比,处理孔的活细胞计数。最小1Δ/Δ细胞比WT更容易受到氧化应激的影响(根据Student’s测试)。(B) 细胞渗透性荧光探针H2DCFDA用于细胞内活性氧检测。10月1日−/−最小1Δ/Δ、和最小1siRNA处理的WT细胞在染料处理后显示出明显更强烈的荧光信号,这表明它们的ROS水平高于未处理的野生型细胞。(C) WT中ROS水平的定量,10月1日−/−、和最小1Δ/Δ细胞处理前后最小1siRNA,表明突变体细胞中的ROS水平升高,并且在WT细胞中的层粘连B1表达降低后。ROS水平也归一化为接近WT水平10月1日siRNA–处理最小1Δ/Δ细胞。每种情况下分析50个细胞。(D) WT细胞转染最小1小干扰RNA。转染48小时后测量ROS水平(绿色)和层粘连蛋白B1(红色)。层粘连蛋白B1表达水平降低的细胞具有较高的活性氧水平。箭头显示一个表达层粘连蛋白B1的细胞,与周围细胞相比,其活性氧水平较低。(E) 用对照siRNA(Trap1)转染的细胞没有显示ROS水平升高。箭头表示Trap1表达减少且ROS水平没有增加的单元格示例。(F) 转基因最小1Δ/Δ表达全长层粘连蛋白B1(红色)的细胞会降低活性氧的水平,这表明对细胞内活性氧水平的影响最小1Δ/Δ细胞与全长层粘连蛋白B1表达的丧失直接相关。显示了平均值±SD值(通过方差分析,P<0.001)。棒材,10μm。
图7。
图7。
层粘连蛋白B1缺陷细胞中失调的基因表达和对氧化应激的敏感性由Oct-1介导。(A) WT细胞转染Oct-1–EGFP或H2B-EGFP作为对照(灰色条),而最小1Δ/Δ细胞被转染10月1日siRNA或对照siRNA(白色条)。用2mM H处理后2O(运行)2,按照材料和方法进行细胞存活分析。标准化细胞存活率是治疗细胞与对照细胞的细胞存活百分比的比值。比率>1,如最小1Δ/ΔOct-1水平降低的细胞反映了细胞存活率的提高。与WT细胞过度表达Oct-1的情况一样,比率<1反映了细胞存活率的降低。WT中Oct-1的过度表达增加了其敏感性,而WT中的Oct-1水平降低最小1Δ/Δ细胞降低了其敏感性,表明层粘连B1缺陷细胞对氧化应激的敏感性由Oct-1介导。(B) 的表达水平Gpx3型路1、和百万像素13转染Oct-1–EGFP(灰条)和最小1Δ/Δ转染细胞10月1日测量siRNA(白色条),并将其表示为与相关对照组相比的折叠变化。结果表明,在WT中Oct-1的过度表达或在层粘连蛋白B1缺陷细胞中其水平的降低逆转了这些基因的基因表达模式,这些基因参与氧化应激反应。水平线表示比率为1,如果与对照组相比,未观察到基因表达或敏感性的变化,则为条形。数据是三个独立执行的重复的平均值±SD。

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