Human MUC1 carcinoma-associated protein confers resistance to genotoxic anticancer agents

doi:10.1016/s1535-6108(04)00020-0

.2004年2月；5(2):163-75.

doi:10.1016/s1535-6108（04）00020-0。

人类MUC1癌相关蛋白对基因毒性抗癌药物产生耐药性

健仁¹, 直系阿加塔, 陈东舒, 李永清, 魏秀余, 雷黄（Lei Huang）, 迪帕克·雷纳, 文晨（Wen Chen）, 苏伦德·卡尔班达, 唐纳德·库夫

附属机构

采购管理信息： 14998492
PMCID公司：项目经理4217165
内政部： 10.1016/s1535-6108（04）00020-0

人MUC1癌相关蛋白赋予对基因毒性抗癌剂的耐药性

健仁等。癌细胞. 2004年2月.

.2004年2月；5(2):163-75.

doi:10.1016/s1535-6108（04）00020-0。

作者

健仁¹, 直系阿加塔, 陈东舒, 李永清, 魏秀余, 雷黄（Lei Huang）, 迪帕克·雷纳, 陈文, 苏伦德·卡尔班达, 唐纳德·库夫

附属

¹美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院达纳-法伯癌症研究所，邮编02115。

采购管理信息： 14998492
PMCID公司：项目经理4217165
内政部： 10.1016/s1535-6108（04）00020-0

摘要

MUC1转化蛋白被大多数人类癌症过度表达。目前的研究表明，MUC1 C-末端亚单位（MUC1 C-ter）定位于HCT116/MUC1结肠癌细胞的线粒体，并且异黄素刺激MUC1 C-te的线粒体靶向性。我们还发现，MUC1可减弱顺铂诱导的（1）线粒体凋亡因子的释放，（2）caspase-3的激活，以及（3）凋亡诱导。此外，MUC1siRNA敲低A549肺和ZR-75-1乳腺癌细胞中MUC1的表达与体内外对基因毒性药物的敏感性增加有关。这些发现表明，MUC1减弱了对DNA损伤的凋亡反应，并且这种癌蛋白对基因毒性抗癌药物具有耐药性。

PubMed免责声明

数字

**图1。MUC1 C-ter定位于线粒体**
转染HCT116细胞以稳定表达空载体MUC1或MUC1（Y46F）。克隆(A类和B类)从两个独立的转染中选择。答：用抗MUC1 N-ter（DF3）、抗MUC1 C-ter（Ab5）和抗β-actin对裂解产物进行免疫印迹分析。**B类：**细胞与抗MUC1 N-ter（开放模式）或对照小鼠IgG（封闭模式）孵育，并通过流式细胞术分析免疫荧光。**抄送：**用抗MUC1 N-ter（DF3）或C-ter（Ab5）染色的HCT116/Vector-A、HCT116/MUC1-A和HCT116/MUC1（Y46F）-A细胞的共焦显微镜观察。线粒体用线粒体追踪红染色，细胞核用TO-PRO-3染色。比例尺表示上部三个面板中的20μm，下部面板中的10μm。**医生：**用抗MUC1 C-ter（Ab5）、Mitotracker Red CMXRos和TO-PRO-3染色的HCT116/MUC1-A细胞的高倍放大。共聚焦图像聚焦于细胞膜（上面板）和线粒体（下面板）的抗MUC1 C-ter染色。比例尺代表10μm。**电子邮箱：**对HCT116/vector-A、HCT116/MUC1-A和HCT116/MUC1（Y46F）-A细胞的线粒体部分进行SDS-PAGE和免疫印迹，并使用所示抗体。包括全细胞裂解物（WCL）作为检测膜相关MUC1 N-ter、细胞质IκBα、核PCNA和内质网相关钙网蛋白的对照。

**图2。HRG刺激靶向线粒体的MUC1 C-ter**
答：MUC1 C-ter与所示抗体识别的位点的示意图（上面板）。HCT116/MUC1-A细胞的细胞膜（CM）和线粒体（Mito）组分的裂解物用所示抗体进行SDS-PAGE和免疫印迹分析（下表）。**B类：**用0、50或100μg/ml胰蛋白酶在4°C下处理纯化的线粒体（0.4 mg蛋白质/ml）20分钟（左）。用所示抗体对样品进行免疫印迹分析。纯化的线粒体（0.4 mg蛋白质/ml）重新悬浮在0.1 M Na中₂一氧化碳_三（pH 11.5），在0°C下培养30分钟，然后在4°C下以100000×μg离心30分钟（右）。上清液（S）和沉淀（P）用指示的抗体通过免疫印迹进行分析。**抄送：**用GFP标记的MUC1 C-ter（GFP-MUC1 C-te）瞬时转染HCT116细胞，并于36小时后收获。用所示抗体对细胞膜（CM）和线粒体（Mito）部分的裂解物进行免疫印迹分析（左）。将全细胞裂解物（WCL）作为对照。用MitoTracker Red和TO-PRO-3染色后，对转染的HCT116细胞进行共聚焦显微镜检查。比例尺代表10μm。**医生：**用EGF刺激HCT116/MUC1和HCT116/MUC1（Y46F）细胞30分钟（左）或HRG刺激指定时间（右）。线粒体裂解物用抗MUC1 C-ter和抗HSP60进行免疫印迹分析。信号强度通过密度扫描确定。

**图3。MUC1减弱CDDP诱导的固有线粒体凋亡途径的激活**
答：用100μM CDDP处理所示细胞8小时和12小时。用抗细胞色素c和抗β-肌动蛋白免疫印迹法分析细胞溶解物。**B和C：**用100μM CDDP处理所示细胞8小时和24小时。用抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3免疫印迹法分析细胞裂解物(B类)或抗PKCδ(C类)和抗β-肌动蛋白。**医生：**用100μM CDDP处理所示细胞24、48和72小时。用所示抗体进行免疫印迹分析细胞溶胶裂解物。

**图4。MUC1减轻DNA损伤和TRAIL诱导的细胞凋亡**
答：用100μM CDDP处理所示细胞24小时，然后分析亚G1 DNA。**B类：**所示细胞的克隆A和克隆B未经处理（开条）或用100μM CDDP处理24小时（实心条）。**抄送：**所示细胞的克隆A和克隆B未经处理（开条）或用70μM足叶乙甙处理48小时（实心条）。**医生：**所示细胞的克隆A和克隆B未经处理（开放条）或用20 ng/ml TNF-α和10μg/ml CHX处理12小时（封闭条）。结果显示为通过分析亚G1 DNA确定的凋亡百分比（三个独立实验的平均值±SD）。**电子邮箱：**所示细胞未经处理（开放栏）或用100 ng/ml TRAIL处理14小时（封闭栏）（左）。如图所示，用100 ng/ml TRAIL和/或10μg/ml CHX处理HCT116/MUC1细胞14小时（右）。结果显示为通过分析亚G1 DNA确定的凋亡百分比（三个实验的平均值±SD）。

**图5。MUC1 C-ter定位于不同癌细胞的线粒体**
答：将稳定转染以表达空载体或MUC1的SW480癌细胞与抗MUC1 C-ter和FITC-结合二级抗体孵育。线粒体用线粒体追踪红染色，细胞核用TO-PRO-3染色。比例尺代表20μm。**B–D：**A549肺(B类)，T-47D胸围(C类)，和ZR-75-1乳腺(D类)通过抗MUC1 C-ter、MitoTracker红和TO-PRO-3染色分析癌细胞。比例尺代表10μm(B类)或20微米(C类和D类).

**图6。MUC1表达的短暂下调使A549癌细胞对CDDP诱导的凋亡敏感**
答：用CsiRNA或MUC1siRNA处理A549细胞，并在转染后72小时收获。用抗MUC1 N-ter和抗β-肌动蛋白免疫印迹法分析裂解产物。**B类：**A549细胞保持未转染状态（MOCK）或转染MUC1siRNA或CsiRNA，培养72小时，然后用10μM CDDP处理48小时。细胞用FITC-结合膜联蛋白V染色并进行流式细胞术分析。**抄送：**MOCK（开条）、MUC1siRNA转染（实心条）或CsiRNA转导（阴影条）细胞的结果表示为凋亡百分比（三个独立实验的平均值±SD）。

**图7。MUC1的稳定下调使ZR-75-1细胞对CDDP-和足叶乙甙诱导的凋亡敏感**
答：用对照逆转录病毒载体或表达MUC1siRNA的载体感染ZR-75-1细胞。在G418存在下选择稳定的转染体。细胞与抗MUC1 N-ter（开放模式）或对照小鼠IgG（封闭模式）孵育，并通过流式细胞仪分析免疫荧光（左）。用所示抗体对裂解液进行免疫印迹分析（右侧面板）。**B类：**ZR-75-1/载体和ZR-75-1/MUC1siRNA细胞与DiOC孵育₆[3] 然后不治疗（对照组）或暴露于25μM CDDP 48小时。通过流式细胞术（上部面板）评估线粒体跨膜电位。用所示抗体（下面板）通过免疫印迹法分析细胞溶解物。**C和D：**用25μM CDDP处理ZR-75-1/载体（开条）和ZR-75-1-MUC1siRNA（实心条）细胞72小时(C类)或使用10和50μM足叶乙甙72小时(D类). 对细胞进行亚G1 DNA分析。结果显示为凋亡百分比（三个独立实验的平均值±SD）。

**图8。MUC1在体内对CDDP治疗产生耐药性**
答：HCT116/载体(○, ●) 或HCT116/MUC1(□, ■) 电池（1×10⁶)裸鼠后侧翼皮下注射。**B类：**ZR-75-1/矢量(○、●）或ZR-75-1/MUC1siRNA(○, ●) 电池（1×10⁷)将其注射到经β-雌二醇预处理的裸鼠体内。按照指示（箭头）对小鼠进行腹腔注射PBS(□, ○) 或7 mg/kg CDDP(■, ●). 根据指定时间的二维测量值计算肿瘤体积。结果表示为每组4-8只小鼠的肿瘤体积（平均值±SD）。

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中的注释

蛋白质劫持：关键蛋白质被强行捕获。
Traven A、Huang DC、Lithgow T。 Traven A等人。癌细胞。2004年2月；5(2):107-8. doi:10.1016/s1535-6108（04）00029-7。癌细胞。2004 采购管理信息：14998483 审查。

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