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.2002年3月4日；156(5):905-19.
doi:10.1083/jcb.200108062。 Epub 2002年2月25日。

PKCα通过细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）调节心肌细胞的肥大生长

朱利安·C·布拉兹 1, 奥兰多F布埃诺, 莱昂·德温特, 杰弗里·德·莫尔肯廷（Jeffery D Molkentin）
附属公司

PKCα通过细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）调节心肌细胞的肥大生长

朱利安·C·布拉兹等。 J细胞生物学. .

摘要

蛋白激酶C（PKC）同工酶家族的成员在几乎所有哺乳动物细胞类型中都是重要的信号转导子。在心脏内，PKC同工酶被认为参与了一个信号网络，该网络对发育和病理性心肌细胞肥大生长进行编程。为了研究PKC信号在调节心肌细胞生长中的作用，在培养的新生大鼠心肌细胞中进行了腺病毒介导的PKCα、βII、δ和ε（仅野生型zeta）野生型和显性阴性突变体的基因转移。野生型PKCα、βII、δ和ε的过度表达在激活时显示出不同的亚细胞定位，表明心肌细胞中每个同工酶的独特功能。事实上，野生型PKCα（而非βI、δ、ε或zeta）的过度表达诱导了心肌细胞的肥大生长，其特征是细胞表面积增加，[（3）H]-亮氨酸掺入增加，肥大标记基因心钠素的表达增加。相反，显性阴性PKCα、βII、δ和ε的表达揭示了PKCα作为激动剂诱导的心肌细胞肥大的介体的必要作用，而显性阴性PKC-ε降低了细胞存活率。野生型PKCα诱导细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2），显性负性PKCα抑制PMA诱导的ERK1/2激活，显性负的MEK1/2（ERK1/2上游），提示PKCα可能调节肥大的机制抑制野生型PKCα诱导的肥大生长。这些结果表明PKCα是心肌细胞肥大生长的必要介质，部分通过ERK1/2依赖性信号通路。

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数字

图1。
图1。
腺病毒介导心肌细胞中野生型PKCα、βII、δ和ɛ的基因转移。（A） Western blot分析PKCα、βII、δ和AdPKCα，AdPKCβII、AdPKCδ、AdPKC-δ或对照Adβgal感染的新生儿心肌细胞的抗体交叉反应性。（B） 在基线时或用PMA刺激后对每个PKC亚型的细胞溶质和颗粒亚细胞蛋白分布进行Western blot分析。显示内源性和过度表达蛋白的分布。（C） PKC颗粒（开放区）和可溶性（暗区）蛋白质水平的直方图表示表明蛋白质表达增加了5-6倍(P（P）< 0.05). 结果是三个独立实验的平均值。
图2。
图2。
经激动剂治疗后，腺病毒介导的PKCα、βII、δ和ɛ在新生儿心肌细胞中的基因转移显示出明显的亚细胞定位和移位。（A） 免疫细胞化学分析AdPKCα-、AdPKCβII-、AdPKCδ-和AdPKC感染心肌细胞的PKC抗体特异性。抗体显示在顶部，病毒感染显示在左侧。（B） 研究了PMA和PE处理前后PKC同工酶的分布。在三个独立的实验中也得到了类似的结果。箭头所示为激动剂刺激后显著重新分布的区域。（C） PKCα仅在先前肥大的心肌细胞中显示出向颗粒组分的有效移位。
图2。
图2。
经激动剂治疗后，腺病毒介导的PKCα、βII、δ和ɛ在新生儿心肌细胞中的基因转移显示出明显的亚细胞定位和移位。（A） 免疫细胞化学分析AdPKCα-、AdPKCβII-、AdPKCδ-和AdPKC感染心肌细胞的PKC抗体特异性。抗体显示在顶部，病毒感染显示在左侧。（B） 研究了PMA和PE处理前后PKC同工酶的分布。在三个独立的实验中也得到了类似的结果。箭头所示为激动剂刺激后显著重新分布的区域。（C） PKCα仅在先前肥大的心肌细胞中显示出向颗粒部分的有效易位。
图3。
图3。
腺病毒介导的野生型PKCα基因转移足以导致心肌细胞肥大。（A） α-肌动蛋白（橙色）或ANF（绿色）联合免疫增强心肌细胞培养揭示了心肌细胞形态、肌群组织和肥大的ANF表达（箭头显示核周ANF蛋白表达）。（B） 从无血清、Adβgal-、Adαgal+PE–、AdPKCα-、AdPKC-βII-、Ad PKCδ-、AdPKCɛ-和AdPKCζ-感染的培养物中量化心肌细胞表面积。用NIH图像软件对α-肌动蛋白染色的细胞进行成像并计算表面积(n个=每个100个单元格）。（C） 表达ANF蛋白的心肌细胞百分比。(n个=放大400倍时25个场）。（D） 相对值的量化[三H] 每μg蛋白质的亮氨酸掺入量标准化为对照组的百分比。（E） PKC特异性激酶分析显示，每个亚型的过度表达导致活性显著增加。对A–D的三个独立实验的结果进行平均，并显示E的一个代表性实验*P（P）<0.05 vs.Adβgal，# P（P）<0.05 vs.Adβgal+PE，† P（P）<0.05 vs.Adβgal+PMA。
图3。
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腺病毒介导的野生型PKCα基因转移足以导致心肌细胞肥大。（A） α-肌动蛋白（橙色）或ANF（绿色）联合免疫增强心肌细胞培养揭示了心肌细胞形态、肌群组织和肥大的ANF表达（箭头显示核周ANF蛋白表达）。（B） 从无血清、Adβgal-、Adαgal+PE–、AdPKCα-、AdPKC-βII-、Ad PKCδ-、AdPKCɛ-和AdPKCζ-感染的培养物中量化心肌细胞表面积。用NIH Image软件对α-肌动蛋白染色的细胞成像并计算表面积(n个=每个100个单元格）。（C） 表达ANF蛋白的心肌细胞百分比。(n个=放大400倍时25个场）。（D） 相对值的量化[三H] 每μg蛋白质的亮氨酸掺入量标准化为对照组的百分比。（E） PKC特异性激酶分析显示，每个亚型的过度表达导致活性显著增加。对A-D的三个独立实验的结果进行了平均，并显示了E的一个代表性实验*P（P）<0.05 vs.Adβgal，# P（P）<0.05 vs.Adβgal+PE，† P（P）<0.05 vs.Adβgal+PMA。
图3。
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腺病毒介导的野生型PKCα的基因转移对于心肌细胞肥大是足够的。（A） α-肌动蛋白（橙色）或ANF（绿色）联合免疫增强心肌细胞培养揭示了心肌细胞形态、肌群组织和肥大的ANF表达（箭头显示核周ANF蛋白表达）。（B） 从无血清、Adβgal-、Adαgal+PE–、AdPKCα-、AdPKC-βII-、Ad PKCδ-、AdPKCɛ-和AdPKCζ-感染的培养物中量化心肌细胞表面积。用NIH Image软件对α-肌动蛋白染色的细胞成像并计算表面积(n个=每个100个单元格）。（C） 表达ANF蛋白的心肌细胞百分比。(n个=放大400倍时25个场）。（D） 相对定量[三H] 每μg蛋白质的亮氨酸掺入量标准化为对照组的百分比。（E） PKC特异性激酶分析显示，每个亚型的过度表达导致活性显著增加。对A–D的三个独立实验的结果进行平均，并显示E的一个代表性实验*P（P）<0.05 vs.Adβgal，# P（P）<0.05 vs.Adβgal+PE，† P（P）<0.05 vs.Adβgal+PMA。
图4。
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腺病毒介导的大鼠新生心肌细胞PKCα基因转移与α-微管蛋白共定位。（A） PMA刺激后进行期PKCα易位的免疫细胞化学分析。（B） PKCα（绿色）和α-微管蛋白（红色）的共存显示出一致的免疫反应性。（C） 作为对照，AdPKCα、Adβgal和PMA均未改变α-微管蛋白定位的正常模式。在三个独立的实验中观察到类似的结果。
图5。
图5。
腺病毒介导的多个PKC同工酶的基因转移不会改变PKCα的亚细胞定位。（A） 与AdPKCα联合AdPKCβII、AdPKCδ或AdPKCɛ感染的心肌细胞中PKCα易位的免疫细胞化学分析。（B） 对来自类似感染心肌细胞的PKCα蛋白进行的Western blot分析表明，其他PKC同工酶的过度表达并未显著破坏内源性PKCα亚细胞定位。（C） PKC颗粒（开放区）和细胞溶质（暗区）蛋白质水平的直方图表示(n个=3个实验）。PKCβII、δ或ɛ的共表达不会降低腺病毒介导的PKCα的表达和重新分布(P（P）< 0.05).
图5。
图5。
腺病毒介导的多种PKC同工酶的基因转移不会改变PKCα的亚细胞定位。（A） 与AdPKCα联合AdPKCβII、AdPKCδ或AdPKCɛ感染的心肌细胞中PKCα易位的免疫细胞化学分析。（B） 对来自类似感染心肌细胞的PKCα蛋白进行的Western blot分析表明，其他PKC同工酶的过度表达并未显著破坏内源性PKCα亚细胞定位。（C） PKC颗粒（开放区）和细胞溶质（暗区）蛋白质水平的直方图表示(n个=3个实验）。PKCβII、δ或ɛ的共表达不会降低腺病毒介导的PKCα的表达和重新分布(P（P）< 0.05).
图6。
图6。
腺病毒介导的显性阴性PKCα、βII、δ和ɛ在新生儿心肌细胞中的基因转移。（A） AdPKCαdn-、AdPKCβIIdn-、AdPKCδdn-或AdPKCɛdn-感染心肌细胞蛋白表达水平的Western blot分析。（B） PKC同工酶总蛋白水平的直方图表示表明，与内源性野生型蛋白水平相比，腺病毒感染后蛋白增加了7-9倍(n个= 3).
图7。
图7。
表达显性阴性PKC同工酶的心肌细胞肥大的评估。（A） α-肌动蛋白（橙色）和ANF（绿色）联合免疫增强心肌细胞培养。（B） 从无血清、Adβgal-、Ad？gal+PE–、AdMKP-1–、Ad MKP-1+PE–，AdPKCαdn+PE–和AdPKCδdn+PE-感染的培养物中定量心肌细胞表面积。α-肌动蛋白染色细胞用共焦显微镜成像并数字化，表面积用NIH Image软件计算(n个=每个100个单元格）。（C） 表达ANF蛋白的心肌细胞百分比(n个=放大400倍时25个场）。（D） 量化[三H] 每μg蛋白质的亮氨酸掺入。所有结果都是在三个独立的实验中获得的*P（P）<0.05 vs.Adβgal。† P（P）<0.05 vs.Adβgal+PE。
图7。
图7。
表达显性阴性PKC同工酶的心肌细胞肥大的评估。（A） α-肌动蛋白（橙色）和ANF（绿色）联合免疫增强心肌细胞培养。（B） 从无血清、Adβgal-、Ad？gal+PE–、AdMKP-1–、Ad MKP-1+PE–，AdPKCαdn+PE–和AdPKCδdn+PE-感染的培养物中定量心肌细胞表面积。α-肌动蛋白染色细胞用共焦显微镜成像并数字化，表面积用NIH Image软件计算(n个=每个100个单元格）。（C） 表达ANF蛋白的心肌细胞百分比(n个=放大400倍时25个场）。（D） 量化[三H] 每μg蛋白质的亮氨酸掺入。所有结果都是在三个独立的实验中获得的*P（P）<0.05 vs.Adβgal。† P（P）<0.05 vs.Adβgal+PE。
图8。
图8。
PKCα和ɛ的过度表达诱导ERK1/2磷酸化。（A） AdPKC感染的心肌细胞中ERK1/2、p38和JNK野生型和磷酸化形式的蛋白质印迹分析。茴香霉素仅用作JNK和p38激活的对照。（B） 三个独立实验的定量结果表明，与Adβgal感染相比，AdPKCα和ɛ感染诱导的ERK1/2激活显著*P（P）<0.05 vs.Adβgal。
图9。
图9。
AdPKCαdn抑制PMA诱导的新生儿心肌细胞ERK1/2磷酸化。（A） PMA治疗前后AdPKCαdn-、AdPKCβIIdn-、AdPKCδdn-和AdPKCɛdn-感染心肌细胞磷酸化ERK1/2的Western blot分析。ERK1/2总量没有变化。（B） 直方图显示仅AdPKCαdn感染时磷酸化ERK1/2显著降低(n个= 3). *P（P）<0.05 vs.Adβgal；† P（P）<0.05 vs.Adβgal+PMA。
图10。
图10。
显性阴性MEK1腺病毒介导的基因转移可减轻PKCα诱导的新生儿心肌细胞肥大。（A） α-肌动蛋白（橙色）和ANF（绿色）联合免疫增强心肌细胞培养揭示了心肌细胞的特异性形态和肌群组织（细胞核为浅蓝色）。AdMEK1dn感染可减轻形态学肥大，但AdMKK3dn不能。（B） 使用NIH Image软件对心肌细胞表面积进行成像和量化(n个=每个100个单元格）。（C） ANF阳性心肌细胞百分比的定量(n个=放大400倍时25个场）。（D） 相对值的量化[三H] 每μg蛋白质的亮氨酸掺入量标准化为对照组的百分比。所有结果均通过三个独立实验进行量化*P（P）<0.05 vs.Adβgal；† P（P）<0.05 vs.AdPKCα+Adβgal。
图10。
图10。
显性阴性MEK1腺病毒介导的基因转移可减轻PKCα诱导的新生儿心肌细胞肥大。（A） α-肌动蛋白（橙色）和ANF（绿色）联合免疫增强心肌细胞培养揭示了心肌细胞的特异性形态和肌群组织（细胞核为浅蓝色）。AdMEK1dn感染，而不是AdMKK3dn，可减轻形态学肥大。（B） 使用NIH Image软件对心肌细胞表面积进行成像和量化(n个=每个100个单元格）。（C） ANF阳性心肌细胞百分比的定量(n个=放大400倍时25个场）。（D） 相对值的量化[三H] 每μg蛋白质的亮氨酸掺入量标准化为对照组的百分比。所有结果均来自三个独立实验*P（P）<0.05 vs.Adβgal；† P（P）<0.05 vs.AdPKCα+Adβgal。
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