Cloning and immunocytochemical localization of a cyclic nucleotide-gated channel alpha-subunit to all cone photoreceptors in the mouse retina

doi:10.1002/(sici)1096-9861(20000522)421:1<80::aid-cne5>3.0.co;2-o

.2000年5月22日；421(1):80-94.

doi:10.1002/（sici）1096-9861（20000522）421:1<80:：aid-cne5>3.0.co；2个。

小鼠视网膜全锥体光感受器环状核苷酸门控通道α亚单位的克隆和免疫细胞化学定位

A A平野¹, I哈克, 哈瓦塞, R M杜瓦辛

附属公司

PMID： 10813773
预防性维修识别码：项目经理2833090
内政部： 10.1002/（sici）1096-9861（20000522）421:1<80:：aid-cne5>3.0.co；2个

小鼠视网膜所有视锥光感受器环核苷酸门控通道α亚基的克隆和免疫细胞化学定位

A A平野等。《计算机神经学杂志》. 2000.

.2000年5月22日；421(1):80-94.

doi:10.1002/（sici）1096-9861（20000522）421:1<80:：aid-cne5>3.0.co；2个。

作者

A A平野¹, I哈克, 哈瓦塞, R M杜瓦辛

附属

¹Max-Planck-Institut für Hirnforschung，D-60528 Frankfurt am Main，德国。hirano@mpih-frankfurt.mpg.de

PMID： 10813773
预防性维修识别码：项目经理2833090
内政部： 10.1002/（sici）1096-9861（20000522）421:1<80:：aid-cne5>3.0.co；2个

摘要

环状核苷酸门控通道（CNGC）是一种配体门控离子通道，可根据第二信使细胞内浓度的变化而开启和关闭；，5;-环磷酸腺苷和3；，5;-环磷酸鸟苷。最值得注意的是，它们将光感受器中吸收光所产生的化学信号转换为膜电位变化，然后将其传递到提升视觉通路。CNGC还参与感光细胞下游其他神经元的信号转导，特别是ON-双极细胞，以及中枢神经系统的其他区域。因此，我们研究了视网膜中表达的其他环状核苷酸门控通道。采用简并逆转录聚合酶链反应方法扩增低拷贝数信息，从小鼠视网膜分离出一个编码CNGCα亚单位新剪接变异体的cDNA，并将其分类为mCNG3。根据羧基末端序列制备的抗血清确定了表达mCNG3的视网膜细胞类型为锥体光感受器。包埋前免疫电子显微镜显示其膜定位于外节，与其在光转导中的作用一致。用锥体特异性标记物进行的双标记实验表明，小鼠视网膜中的所有锥体光感受器都使用相同或高度保守的环核苷酸门控通道。因此，预计该通道中的缺陷将严重损害明视视力。

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数字

图1
抗mCNG3蛋白抗血清的特异性。蛋白质印迹分析显示，mCNG3抗血清在视网膜中标记了一条表观分子量≈70 kDa的单一条带。小脑或肝脏中未检测到条带；然而，在舌中观察到一条≈40kDa的谱带。分子量标记的位置显示在KDa的左侧。R、视网膜；C、小脑；五十、肝脏；T、舌头。

图2
与相关环核苷酸门控通道α亚基的序列比对。mCNG3 cDNA蛋白编码序列显示在第一行上，并按序列相似性的降序排列为大鼠CNGgust（Misaka等人，1997）、牛锥体/睾丸CNG3（bCNG3，Biel等人，1994；Weyand等人，1994）、人锥体CNG3和鸡球果CNG3（cCNG3，Bönigk et al.，1993）cDNA序列。环核苷酸门控通道的以下保守结构特征被表示出来：六个假定的跨膜结构域序列，S1到S6，孔（P）区域和羧基末端的环核苷酸结合域。在氨基末端发现了一个拟议的钙-钙调蛋白结合位点。推测的翻译后修饰位点包括一个用于N-糖基化（+），几个用于蛋白质磷酸化（*）。序列比对中的间隙用连字符（-）表示，氨基酸与mCNG3的相同性用句点（.）表示。

图3
mCNG3抗血清标记光感受器的荧光显微照片(A类)老鼠(B类)鼠标，和(C类)鸡视网膜。请注意，免疫反应集中在外段，较模糊的标记延伸到内段。箭头指向鸡视网膜中的一个双锥体（C）。比例尺=20μm。

图4
小鼠视网膜感光层锥体感光通道免疫反应的电子显微照片。图中显示了规则间隔的光感受器外节中的银增敏二氨基联苯反应产物，根据杆控视网膜中的相对频率及其在外节层中的深度，这些光感受者很可能是锥体。比例尺=2μm。

图5
高倍电子显微照片显示，在标记的锥体外段的质膜中，银强化的二氨基联苯胺反应产物。比例尺=1μm。

图6
荧光显微照片显示，蛋白激酶C（PKC）抗体特异性地标记小鼠视网膜感光层中的S锥。答：一种抗PKC抗体（克隆MC5）标记光感受器层（PR）的外部片段以及内核层（INL）的杆状双极细胞。**B类：**使用人S锥视蛋白抗血清（JH455）对S锥进行鉴定。视网膜层在图中使用Nomarski光学器件显示(C类). PR层的高倍视图显示PKC的同位化(D类)和蓝锥视蛋白(E类)免疫反应。ONL，外核层；OPL，外丛状层；IPL，内丛状层；GCL，神经节细胞层。A–C的比例尺=42μm；D、E为20μm。

图7
荧光显微照片显示，S-cones在小鼠视网膜中表达mCNG3蛋白。答：抗蛋白激酶C（PKC）抗体识别了感光层（PR）中S锥的外段和内核层（INL）中的杆双极细胞。**B类：**mCNG3抗血清在PR层标记与抗PKC抗体相同的外段。视网膜层用Nomarski光学显示(C类). PR层的高倍视图显示了抗PKC的共定位(D类)和mCNG3(E类)免疫反应，表明S-cones表达这种CNG通道亚单位。在这一节中，很可能取自下视网膜，mCNG3抗血清识别的所有感光细胞似乎都是S-锥体。ONL，外核层；OPL，外丛状层；IPL，内丛状层；GCL，神经节细胞层。A–C的比例尺=42μm；D、E为20μm。

图8
荧光显微照片显示，S锥和可能的M锥在大鼠视网膜中表达mCNG3通道亚单位。答：抗蛋白激酶C（PKC）抗体鉴定了S锥的外段。**B类：**mCNG3抗血清标记了抗PKC抗体识别的四个外段（箭头）以及推测的M锥的额外外段。比例尺=20μm。

图9
荧光显微照片显示锥体光感受器标记物花生凝集素（PNA）和mCNG3免疫反应在大鼠视网膜中的共定位。答：用异硫氰酸荧光素（FITC）-PNA标记每个锥体周围的光受体间基质（Blanks and Johnson，1984）。**B类：**在FITC-PNA标记的每一个外壳中都观察到由mCNG3抗血清标记的锥体光感受器外段，表明所有锥体都表达mCNG3-样蛋白。比例尺=10μm。

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1. Ahmad I、Leinders-Zufall T、Kocsis JD、Shepherd GM、Zufall-F、Barnstable CJ。视网膜神经节细胞表达可被一氧化氮供体激活的cGMP门控阳离子电导。神经元。1994;12:155–165.-公共医学
1. Biel M、Zong X、Distler M、Bosse E、Klugbauer N、Murakami M、Flockerzi V、Hofmann F。环状核苷酸门控通道家族的另一个成员在睾丸、肾脏和心脏中表达。美国国家科学院院刊，1994年；91:3505–3509.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Biel M，Zong X，Hofmann F.环核苷酸门控阳离子通道的分子多样性。Naumyn-Schmiedebergs Arch Pharmacol公司。1995;353:1–10.-公共医学
1. Biel M，Zong X，Ludwig A，Sautter A，Hofmann F.环状核苷酸门控阳离子通道调节亚单位的分子克隆和表达。生物化学杂志。1996;271:6349–6355.-公共医学
1. Biel M、Seeliger M、Pfeifer A、Kohler K、Gerstner A、Ludwig A、Jaissle G、Fauser S、Zrenner E、Hofmann F。缺乏环状核苷酸门控通道CNG3的小鼠的锥体功能选择性丧失。美国国家科学院院刊1999a；96:7553–7557.-项目管理咨询公司-公共医学

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[5] Biel M，Zong X，Hofmann F.环核苷酸门控阳离子通道的分子多样性。Naumyn-Schmiedebergs Arch Pharmacol公司。1995;353:1–10.-公共医学

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[8] Biel M，Zong X，Ludwig A，Sautter A，Hofmann F.环状核苷酸门控阳离子通道调节亚单位的分子克隆和表达。生物化学杂志。1996;271:6349–6355.-公共医学

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