基于碳纤维/PEDOT/PSS的新型乙酰胆碱神经递质生物传感器及血清乙酰胆碱酯酶检测
,1 ,2 ,1 ,三，4,* ,2,三和1,*
阿布德·加利尔·阿姆尔
三沙特阿拉伯利雅得沙特国王大学药学院药物化学系，药物研发主席（DEDC），邮编11451
4埃及吉萨12622 Dokki国家研究中心应用有机化学部
罗伯托·费尔南德斯·拉芬特，学术编辑
三沙特阿拉伯利雅得沙特国王大学药学院药物化学系，药物研发主席（DEDC），邮编11451
4埃及吉萨12622 Dokki国家研究中心应用有机化学部
接收日期：2019年3月28日；2019年4月16日验收。
摘要
使用聚（3,4-亚乙基二氧噻吩）/聚（苯乙烯磺酸）（PEDOT/PSS）作为乙酰胆碱（ACh）生物测定中传感膜和电基质之间的固体接触，制备了新的可靠且坚固的电位型离子选择电极。将PEDOT/PSS薄膜沉积在陶瓷基片制成的固体碳屏涂平台上。离子选择电极（ISE）传感器膜中使用的选择性材料是乙酰胆碱四苯硼酸盐（ACh/TPB/PEDOT/PSS-ISE）（传感器I）和三乙酰-β-环糊精（β-CD/PEDOT/PSS-ISE）（传感器II）。传感器显示出明显增强的能斯特响应，阳离子斜率为56.4±0.6和55.3±1.1 mV/decade（ACh+)1.0×10动态线性范围内的离子−6–1 × 10−3和2.0×10−6–1.0 × 10−3pH值为5时为M，检测限为2.0×10−7和3.2×10−7M分别表示传感器I和II。还测试了两种传感器的选择性行为，并且传感器对ACh表现出显著的高选择性+在不同的常见有机和无机阳离子上。采用计时电位法评估了固相（SC）/ISE的电位响应稳定性，并与未添加固相材料的电极（PEDOT/PSS）进行了比较。这些具有成本效益的传感器具有更高的准确性、优异的重复性、良好的再现性、潜在稳定性以及高选择性和灵敏度。传感器还用于测量乙酰胆碱酯酶（AChE）的活性。ACh水解初始速率之间的线性图+底物和酶活性保持在5.0×10−3–5.2国际单位升−1乙酰胆碱酯酶。将其应用于人血清中乙酰胆碱的测定，并与标准比色法进行了比较。
关键词：固体控制/ISE、PEDOT/PSS、乙酰胆碱、生物传感器、乙酰胆碱酯酶
1.简介
神经递质被归类为重要的内源性化学信使。这些信使在神经元和其他细胞之间传递和增强特定信号。它们在大脑的行为和认知功能中起着重要作用。此外，它们可以在肌肉张力和心率调节中发挥重要作用。此外，它们还负责调节人体的学习、睡眠、记忆、意识、情绪和食欲[1,2]. 乙酰胆碱（ACh）被认为是动物界最古老的神经递质之一，在外周和中枢神经系统中都是如此[2]. 它与特定受体结合，调节外周神经系统中的肌肉收缩。另一方面，在与行为活动相关的过程中，它在中枢神经系统中发挥着重要作用。在神经元中，乙酰胆碱是通过胆碱乙酰转移酶（ChAT）和乙酰辅酶A从胆碱中制备的[1,2,三]. 人类血液中ACh的水平男性约0.52µM，女性约0.47µM[4]. ACh作为眼内冲洗液也有治疗作用[5]. 另一方面，缺乏ACh会导致神经冲动传递障碍、瘫痪和死亡[6]。
综上所述，人体血液中乙酰胆碱酯酶的水平非常关键，找到一种分析工具来追踪其在人体中的水平非常重要。多年来，开发可靠、稳健的分析设备以快速、灵敏地评估乙酰胆碱是一个极具挑战性的目标。ACh不吸收紫外线，无荧光信号，不可衍生。因此，ACh的追踪是一个具有挑战性的分析问题。因此，只有繁琐的程序，如生物测定[7]，基于放射化学分析的方法[8]，基于酶的液相色谱（LC）[9,10,11,12]，和基于质谱检测的LC[13,14,15,16]经常使用。此外，这些报道的方法有几个缺点，例如分析时间长、分析成本高，以及需要专门使用实验室设施的高技能人员。
电分析技术具有许多优点，例如用于分析的设备简单，使用方便，分析时间短。单酶、双酶和三酶/介体生物传感器，包括化学发光法[17]，安培[18,19,20]，电导法[21]和伏安法[22]另一方面，所有这些方法都需要较长的分析时间，并且需要配备专业人员和实验室设施。
与不同的技术相比，电位型离子选择电极（ISE）具有一些独特的性能特征，例如易于小型化、易于操作、便携和低成本[23,24,25,26]. 最近，固态电势离子选择传感器显示了分析生物、生物医学和环境样品的巨大能力[27,28,29]. 全固态ISE的配置似乎适合小型化传感器制造，其特点是具有良好的分析特性，可以检测不同基质中的不同离子。
如文献所述，很少开发出电位型离子选择电极（ISE）[30,31,32,33,34,35,36]. 其中一些包括乙酰胆碱的离子对复合物作为电活性材料。这表明分析的线性范围有限，响应时间长[30,31,32]. 其他包括大环载体，如β-环糊精和分子印迹聚合物[33,35,36]. 有趣的是，将建议的ACh电极的选择性和工作方式与之前报告的进行比较(). 含有内填充溶液的传统电势ISE配置具有良好的台式离子传感性能。但是，对于小容量样本，此配置会失败。这些类型的样品需要与小型化的要求一起解决。考虑到体内生物医学分析，液相控制离子选择电极（ISE）的使用有许多缺点。例如，内部填充溶液会蒸发，样品的温度和压力也会发生变化。此外，由于样品和内部填充溶液的离子强度不同，可能会产生渗透压。这种上升的渗透压会产生从内部填充溶液到内部填充溶液的净液体传输，并导致体积变化。这可能会引发ISM分层[37]. 作为固体控制电极的一个例子，屏幕涂层电极被证明是一种很好的传感器小型化技术，因为它们简单、廉价、易于大规模生产。屏幕涂层电极的这些良好特性使得这种电极类型有望用于有机物种的检测。
表1
| 离子载体 | 斜率（mV十年−1) | 线性范围，（M） | 检测限（M） | pH值范围 | 干扰 | 裁判。 |
|---|
| 乙酰胆碱二苦胺酸盐 | 54.4 | 5.0 × 10−5–1.0 × 10−2 | 3.0×10−5 | 尼泊尔卢比 | 胆碱（-1.35）；丁酰胆碱（-1.02）；多巴胺（-2.21）；酪氨酸（−2.39）；氨基丁酸（-2.82）；卡巴胆碱（−1.43）；苯丙胺（-1.06）；K（K）+(−2.65); 全日空航空公司4+(−3.39) | [30] |
| 南瓜（6）尿苷衍生物 | 49.1 | 1.0 × 10−6–1.0 × 10−3 | 9.70×10−7 | 7.2 | 胆碱（-2.51）；全日空航空公司4+(−1.96); NMe公司4+(−1.93); NEt公司4+(−1.93); K（K）+(−1.57); 纳+(−1.83); 多巴胺（-1.51）；抗坏血酸（-2.45） | [31] |
| 二辛基十八胺N个,N个-二癸基-氨基甲基-苯 | 41.4
52.9 | 3.0 × 10−6–4.5 × 10−5
1.0 × 10−5–8.0 × 10−3 | 2.0 × 10−6–5.0 × 10−6
5.0×10−6 | 8
8 | 尼泊尔卢比
尼泊尔卢比 | [32] |
| 利特基斯（Tetrakis）(第页-氯苯基）硼酸盐 | 尼泊尔卢比 | 尼泊尔卢比 | 1.0 × 10−5 | 6 | 尼泊尔卢比 | [33] |
| 二苯并-18-冠-6 | 尼泊尔卢比 | 尼泊尔卢比 | 1.0 × 10−5 | 6 | 尼泊尔卢比 |
| 杯[6]芳烃六酯 | 尼泊尔卢比 | 尼泊尔卢比 | 1.7 × 10−5 | 6 | 尼泊尔卢比 |
| β-环糊精（β-CD）衍生物 | 55.6 | 1.00 × 10−5–1.0×10−2 | 2.70 × 10−6 | 3.0–10 | 胆碱（-2.50）；全日空航空公司4+(−3.80); 柠檬酸盐（-2.53）；锂+(−3.76); K（K）+(−3.89); 咖啡因（-2.30） | [34] |
| 基于甲基丙烯酸单体（MAA）和四苯硼酸盐（TPB）添加剂的分子印迹聚合物（MIP） | 55.2 | 1.00 × 10−5–1.0 × 10−2 | 4.5 × 10−6 | 3.0–9.0 | 谷氨酰胺（-1.52）；可待因（-1.37）；麻黄碱（−1.45）；吗啡（-1.50）；咖啡因（-1.5）；奎宁（-1.57）；组氨酸（-1.60）；胆碱（-1.62）；半胱氨酸（-1.70）；K（K）+(−2.51); 钙2+(−2.54); 镁2+(−2.82); 文学士2+(−2.93) | [35] |
| 体印迹中的多壁碳纳米管（MWCNT）和苯胺（ANI）。 | 75.9 | 3.45 × 10−5–1.0×10−2 | 3.13 × 10−5 | 4 | 肌酐（-0.04）、肌酸（+0.82）、半胱氨酸（+0.08）、谷氨酰胺（-0.35）、尿素（-0.23） | [36] |
| ACh/TPB/踏板/PSS-ISE | 56.4 ± 0.6 | 1.00 × 10−6–10 × 10−3 | 2.0 × 10−7 | 3–10 | 胆碱（−3.3）、尿素（−4.2）、六胺（−4.3）、乙二胺（−6.2）、二甲胺（−3.2）、羟胺（−3.1）、甲胺（−3.3）、组氨酸（−4.5）、丙氨酸（−4.4）、麻黄碱（−3.3）、可待因（−2.7）、吗啡（−2.9）、K+(−5.3); 钙2+(−6.8); 镁2+(−7.1); 纳+(−5.3) | 这项工作 |
| β-CD/PEDOT/PSS-ISE | 55.3 ± 1.1 | 2.00 × 10−6–1.00 × 10−3 | 3.2 × 10−7 | 4.5–10 | 胆碱（-3.5）、尿素（-4.5）、己胺（-4.1）、乙二胺（-6.1）、二甲胺（-4.9）、羟胺（-4.8）、甲胺（-4.5）、组氨酸（-4.4）、丙氨酸（-4.3）、麻黄碱（-1.2）、可待因（-1.0）、吗啡（-1.1）、钾+(−5.1); 钙2+（−7.1）；镁2+(−7.3); 纳+(−6.2). |
在此，我们提出了一种新的强健、可靠的电位固体控制ISE，用于乙酰胆碱的痕量测定。采用聚（3,4-亚乙基二氧噻吩）/聚（苯乙烯磺酸盐）（PEDOT/PSS）薄膜作为固体接触。传感器用于在静态和流体动力操作模式下测定ACh。该传感器还可用于简单、灵敏和快速监测乙酰胆碱酯酶（AChE）的酶活性。酶监测方法基于酶与ACh的反应+底物，同时监测ACh的减少+使用建议的ACh传感器的浓度。
2.结果和讨论
2.1. 传感器性能特征
乙酰胆碱与四苯硼酸钠反应，以1:1的化学计量比形成乙酰胆碱-四苯硼酸盐（ACh/TPB）离子相关络合物。将所得沉淀物纯化、分离并干燥。两种聚合物电位乙酰胆碱传感器基于在增塑聚氯乙烯（PVC）基质中使用ACh/TPB（ACh/TPB/PEDOT/PSS-ISE）和三乙酰基-β-环糊精（β-CD/PEDOT/PSS-ISE），1.5 wt.%四十二烷基四（4-氯苯基）硼酸铵（ETH 500）和3.0 wt.%离子载体。建议电极的所有校准图如所示。从三份研究中获得的结果显示，近能斯特斜率为56.4±0.6(对2=0.999）和55.3±1.1(对2=0.998）mV/decade，检测限2.00×10−7和3.20×10−7M、 分别用于传感器I和II。性能响应特性如表所示.
表2
| 参数 | ACh/TPB/踏板/PSS-ISE | β-CD/PEDOT/PSS-ISE |
|---|
| 斜率（mV十进制−1) * | 56.4 ± 0.6 | 55.3 ± 1.1 |
| 相关系数(对2) | 0.999 | 0.998 |
| 线性范围，M* | 1.0 × 10−6–1 × 10−3 | 2.0 × 10−6–1.0×10−3 |
| 检测限，M* | 2.0 × 10−7 | 3.2 × 10−7 |
| 工作范围（pH） | 3–10 | 4.5–10 |
| 响应时间（s） | <10 | <10 |
| 准确度（%） | 99.2 | 99.3 |
| 精度（%） | 0.6 | 0.7 |
还研究了pH对所提出的传感器的影响。两种不同浓度的ACh+(10−4–10−3M） 在pH值为2至10的范围内进行本试验。传感器I和II通过工作pH值范围分别为3–10和4.5–10的pH值变化，显示了所述浓度下的稳定电位和未受影响电位。当pH>10时，由于氢氧化物离子的干扰，电位急剧下降。当pH值<3时，传感器响应受到H的严重影响三O（运行）+.A 10−2随后的所有测量均选择pH值为7的磷酸盐缓冲盐水（PBS）的M浓度。
在一个工作日内的短时间间隔内（日内再现性），使用所提出的传感器和相同的试剂测量了使用10µg/mL内部质量控制ACh样品获得的相互独立的重复测试结果之间的一致性，以及显著较小的变化（±0.5%）从最终mV读数中发现。通过连续五天使用不同批次的试剂测量10µg/L内部质量控制ACh样品并每天重新校准，也测试了结果的再现性（日常响应变化）。与重复性实验获得的结果相比，获得了较小的结果变化。ACh/TPB/PEDOT/PSS-ISE和β-CD/PEDOT/PSS-ISE的相对标准偏差计算结果分别为1.7%和2.2%。这些数据表明，所提出的固体控制（SC）/ISE具有良好的响应稳定性。在重复校准传感器至少12周后，测试长期潜在稳定性。每天使用六周后，检测限增加到7.0×10−5两个传感器的M值和灵敏度均下降。考虑到这些类型传感器的一次性性质，六周后灵敏度降低的问题并不是一个大问题。
2.2. 传感器选择性
在不同的常见离子上测试了所提出的传感器对乙酰胆碱的选择性行为。选择性系数(K（K）ACh，J公司)使用Bakker改进的分离溶液法（SSM）进行评估[38]。给出了所有传感器的电位选择性系数值。根据中显示的结果基于β-CD（β-CD/PEDOT/PSS-ISE）的传感器对ACh的选择性+胆碱、甲胺、尿素、二甲胺、钠上的离子+，加利福尼亚州2+、和镁2+离子比基于ACh/TPB（ACh/TBB/PEDOT/PSS-ISE）的传感器要好得多。与其他含氮化合物相比，三乙酰基-β-CD对乙酰胆碱络合的高亲和力可以解释这一点。另一方面，基于ACh/TPB/PEDOT/PSS-ISE（传感器I）的传感器对ACh具有更好的选择性+超过K+组氨酸、乙二胺、己胺、羟胺、麻黄碱、可待因、吗啡和丙氨酸，而不是β-CD/PEDOT/PSS-ISE。
表3
选择性值(K（K）锅ACh、j)用于乙酰胆碱固体控制传感器。
| 干扰 | 日志K（K）锅ACh、j |
|---|
| ACh/TPB/PEDOT/PSS-ISE | β-CD/PEDOT/PSS-ISE |
|---|
| 胆碱 | −3.3 ± 0.4 | −3.5 ± 0.3 |
| 纳+ | −5.3 ± 0.7 | −6.2 ± 0.4 |
| K（K）+ | −5.3 ± 0.3 | −5.1 ± 0.1 |
| 钙2+ | −6.8±0.4 | −7.1 ± 0.4 |
| 镁2+ | −7.1 ± 0.1 | −7.3 ± 0.6 |
| 尿素 | −4.2 ± 0.3 | −4.5 ± 0.7 |
| 己胺 | −4.3 ± 0.2 | −4.1 ± 0.6 |
| 乙二胺 | −6.2 ± 0.2 | −6.1 ± 0.4 |
| 二甲胺 | −3.2±0.2 | −4.9 ± 0.6 |
| 羟胺 | −3.1 ± 0.3 | −4.8 ± 0.2 |
| 甲胺 | −3.3 ± 0.4 | −4.5 ± 0.3 |
| 组氨酸 | −4.5 ± 0.3 | −4.1 ± 0.4 |
| 丙氨酸 | −4.4 ± 0.4 | −4.3 ± 0.2 |
| 麻黄碱 | −3.3 ± 0.4 | −1.2 ± 0.3 |
| 可待因 | −2.7±0.3 | −1.0 ± 0.2 |
| 吗啡 | −2.9 ± 0.6 | −1.1 ± 0.1 |
2.3. PEDOT/PSS固体接触层的影响
使用计时电位法研究了短期电位稳定性[39]. 如所示除了ACh/TPB-ISE和β-CD-ISE的计时电位图外，还提供了ACh/PEDOT/PS-ISE和β-CD/PEDOT/PSS-ISE的典型计时电位图进行比较。斜率（ΔE类/Δt吨)的E–t较长时间的曲线可直接测量ACh+-ISE的潜在稳定性。ACh/TPB/PEDOT/PSS-ISE和β-CD/PEDOT/PSS-ISE的电位漂移分别为6.5μV/s和52.0μV/s，远低于ACh/TPB-ISE和？CD-ISE的电位漂移（分别为117.0和90.2μV/s）。从上述数据可以看出，通过将PEDOT/PSS直接引入聚合物膜中，所提出传感器的潜在稳定性大大提高。ACh/TPB/PEDOT/PSS-ISE和β-CD/PEDOT/PSS-ISE的电容估计分别为153.1μF和19.1μF。ACh/TPB-ISE和β-CD-ISE的电容分别为8.54μV/s和11.0μV/s。从这些值中，我们可以确定潜在稳定性（ΔE类/Δt吨)或电容(C类)ISEs和PEDOT/PSS作为ISEs中膜和电基板之间的固相材料的存在。
全固态乙酰胆碱（ACh）的计时电位图（外加电流：60秒为+1 nA，60秒为-1 nA）+)基于(A类)四苯硼酸盐（TPB）和(B)β-环糊精（β-CD）。
2.4. 水层效应
在离子传感膜和电子导体界面之间形成的水膜可以作为局部的微观水池[40]. 它对ISE的潜在稳定性和寿命有很大影响。因此，对ACh/TPB/PEDOT/PSS-ISE进行了无水层测试。如所示，该传感器首次在10−3M氯化钙2然后记录1.0h的电势。然后，将CaCl溶液2替换为1.0×10−4和5×10−6M ACh公司+在更换CaCl后，再记录1.0h的电位2含ACh的溶液+离子溶液中，近1.0h的稳定电位响应表明完全没有不良的水层。这可以根据PEDOT/PSS在聚合物膜中的疏水性来解释。类似的ACh+还测试了不含PEDOT/PSS的选择性膜成分，以进行比较。在没有PEDOT/PSS层作为固相材料的情况下，发现了很大的潜在漂移。这证实了这种材料的疏水性以及没有形成水层。
使用和不使用聚（3,4-亚乙基二氧噻吩）/聚（苯乙烯磺酸盐）（PEDOT/PSS）固体控制材料的乙酰胆碱ISE的水层试验(A类)ACh/TPB/PEDOT/PSS-ISE和(B)ACh/TPB-ISE。
2.5. ACh的流体动力学评估+
系统的流量喷射歧管如所示.所用的流动池准备用于提供较小的传感器尺寸。该设计用于避免样品分散，并获得潜在响应的短恢复时间。制备了含有ACh/TPB-和β-CD基膜传感器的平面型探测器（即屏幕涂层电极），并通过测量ACh对其进行了表征+流动操作下的离子。传感器记录的电位信号显示在传感器在1.0×10的线性范围内显示出60.1±1.1和52.7±0.8 mV/decade的能斯特响应斜率−5至1.0×10−3M和2.0×10−5至1.0×10−3检测限为2.5×10的M−6和3.9×10−6M分别代表ACh/TPB/PEDOT/PSS-ISE和β-CD/PEDOT/PSS-ISE。建议使用4 mL/min的值作为测量的最佳流速。所有电势特性总结如下在1.0×10浓度范围内，瞬态流量信号的相对标准偏差为±2.1%和±1.7%−6至1.0×10−2M ACh公司+离子分别用于所提出的传感器。
ACh流量注入歧管+量化。条件：磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01 M，pH 7.0）载体溶液；100μL是注入的样品体积，流速为4.0 mL/min。
用于评估ACh的流动注射信号+在优化的流动注射条件下，使用：(A类)ACh/TPB/PEDOT/PSS-ISE和(B)β-CD/PEDOT/PSS-ISE。
表4
| 参数 | ACh/TPB/PEDOT/PSS-ISE | β-CD/PEDOT/PSS-ISE |
|---|
| 斜率（mV/decade）* | 60.1 ± 1.1 | 52.7 ± 0.8 |
| 相关系数 | 0.995 | 0.996 |
| 检测限（M*） | 2.5 × 10−6 | 3.9 × 10−6 |
| 线性范围（M*） | 1.0 × 10−3–1.0 × 10−5 | 1.0 × 10−3–2.0 × 10−5 |
| 最佳流速（mL/min） | 4 | 4 |
| 寿命，（周） | 8 | 8 |
| 样本吞吐量（h） | 24–25 | 29–30 |
2.6. 人血清中乙酰胆碱含量测定
通过测定采集的人类血清样本中的乙酰胆碱酯酶，验证了该方法的有效性。为了与当前的电位法进行比较，还使用标准商用分光光度计试剂盒（编号ab65345，Abcam，Boston，MA，USA）在25°C下对样品进行了分析。在本试验方案中，游离胆碱被胆碱氧化酶氧化为甜菜碱和H2O（运行）2.然后用高比色探针检测过氧化氢。辣根过氧化物酶被用作此反应的催化剂。反应产物在λ=540至570 nm处产生颜色测量。标准和建议方法的结果见.安F类-测试表明，分光光度法和电位法结果集的平均值和方差之间没有显著差异。
表5
使用ACh/TPB/PEDOT/PSS-ISE和分光光度法对人体血清样本中的ACh进行电位测定。
| 样品 | 性别 | 年龄 | ACh量，µM* |
|---|
| 电位测定法 | 分光光度法 |
|---|
| 1 | 男性 | 55–65 | 0.60 ± 0.03 | 0.52 ± 0.03 |
| 2 | 男性 | 35–50 | 0.48 ± 0.02 | 0.55 ± 0.04 |
| 三 | 男性 | 20–30 | 0.71±0.01 | 0.57 ± 0.01 |
| 4 | 女性 | 40–55 | 0.46 ± 0.02 | 0.41 ± 0.02 |
| 5 | 女性 | 20–35 | 0.53 ± 0.04 | 0.46 ± 0.05 |
此外，使用四个不同的传感器组件和两个不同的仪器在不同的日期重复测定不同样本大小的乙酰胆碱酯酶。重复性（日内）和再现性（日间）测量结果显示，潜在变化范围为2–3 mV。这些结果表明，这些参数的影响在规定的公差范围内，且变化在方法的稳健性范围内。
2.7. 乙酰胆碱酯酶活性的动力学监测
胆碱能突触中传输脉冲的终止是通过乙酰胆碱（ACh）快速水解为胆碱（Ch）和乙酸来完成的，如方案1[41]。
在酶反应中，当酶与底物饱和时的反应速率可以被视为最大反应速率(V（V）最大值)，以及K（K）米是底物的浓度，使酶达到一半V（V）最大值。的值K（K）米和V（V）最大值使用建议的Ach传感器估计酶反应的活性。
记录不同浓度ACh的电位变化+（1.0×10−6至1.0×10−3M） 使用固定酶活性（0.5 IU L−1). 1.0×10−6，测量的初始速率没有显著增加。这是因为传感器在低浓度ACh下的灵敏度较低+离子。浓度≥5.0×10时−5M、 测量的初始速率显著增加。1.0×10−4M交流+所有后续的乙酰胆碱酯酶测量都选择了溶液，因为它显示了酶活性低时反应速率的良好可测量变化。如所示，它提供的值为8.9×10−5M和59 mV最小值−1对于K（K）米、和V（V）最大值分别是。此值为K（K）米接近之前获得的震级[35,42]。
拟用传感器获得的初始反应速率符合Michaelis–Menten方程（乙酰胆碱酯酶（AchE）活性=0.5 IU/L）。
对于AChE活性的估算，5.0×10−4M ACh公司+浓度作为固定底物浓度，酶的活性从1.0×10改变−3记录电位变化与时间的关系，绘制初始速率与乙酰胆碱酯酶活性的关系图。线性图(对2=0.9994），浓度范围为5.0×10−3至5.2 IU/L，检测限为3.0×10−3IU/L，如所示.
(A类)在25°C下使用初始速率法水解ACh底物；(B)为AChE量化构建的校准曲线。
3.材料和方法
3.1. 化学品和试剂
工作中使用的所有化学品均为分析级，所有溶液均使用去离子水制备（电导率<0.1µS cm−1). 氯化乙酰胆碱（ACh）、氯化胆碱（Ch）、肌酐（Creat）、肌酸（Crt）、四（4-氯苯基）硼酸钾（KTpClPB）、四苯硼酸钠（NaTPB）、2-硝基苯基辛基醚(o个从西格玛化学公司（美国密苏里州圣路易斯）购买了四（4-氯苯基）硼酸十四烷基铵（ETH 500）、聚（3,4-亚乙基二氧噻吩）/聚（苯乙烯磺酸盐）（PEDOT/PSS）、三乙酰基-β-环糊精（β-CD）和高分子量聚氯乙烯（PVC）。四氢呋喃（THF）购自Fluka（Ronkonama，NY，USA）。从Electrochorus electricus（electroceel，EC 3.1.1.7，288 U/mg固体）获得的乙酰胆碱酯酶（VI-S型）来自Sigma-Aldrich（德国慕尼黑）。
甲1.0×10−1M库存ACh+通过将盐溶解在100 mL pH为7的0.05 M磷酸盐缓冲盐水溶液（PBS）中制备溶液。工作标准溶液（1.0×10−2–1.0 × 10−8M） 每天在原液稀释后制备。对于电位选择性研究−2使用0.05 M PBS，pH 7制备M干扰离子溶液。
3.2. 仪器
所有EMF测量都是在环境温度下使用pH/mV测量仪（Orion，Cambridge，MA，USA，SA 720型）和数据记录器（Pico Technology Limited，ADC-16型）进行的。流动注射（FI）歧管由Ismatech蠕动泵（Ms–REGLO型号）和Omnifit注射阀（Omnifit，Cambridge，UK）组成，Ismatech蠕动泵带有用于输送溶液的聚乙烯管（内径0.71 mm），Omnifit注射阀带有100-μL体积的回路样品。
为了估计所用固体材料的电位稳定性和电容，在10−3M ACh公司+使用传统的三电极系统电池。采用双结Ag/AgCl作为参比电极，铂板作为辅助电极。传感器上施加的恒定电流为±1 nA，持续60秒。
3.3. ISE膜和电极测量
至屏幕印刷平台中的导电碳层()，通过滴注将10µL PEDOT/PSS溶液施加在该孔上。干燥后，形成厚度接近0.25µm的层并用作固体压缩层。通过将100 mg总成分溶解在1.0 mL THF中制备传感器膜：离子载体（3.0 mg）、PVC（32.4 wt.%）、ETH 500（1.5 wt.%o个-NPOE（63.1 wt.%）。然后，将20µL膜鸡尾酒滴注到屏幕展示平台的孔口上，并让其干燥6小时。
传感器通过浸泡在1.0×10中进行调节−3ACh的M+水溶液2小时。通过添加标准ACh的不同等分溶液，试验溶液的pH值保持在7.0+溶于25 mL 0.01 M PBS溶液中。在不同浓度的ACh下测量测试溶液的电位+在1.0×10范围内−8至1×10−2M。EMF被绘制为ACh对数的函数+浓度。
3.4. 人血清中乙酰胆碱的测定
从不同患者采集不同的人血样本，并在提取后3 h内进行分析。样品收集在试管中，然后与9 mL无水乙醇混合；在以4000转/分的速度离心之前，将其放置10分钟。将上清液从颗粒物中分离出来，转移到10-mL量瓶中，并按10倍的标准完成−2pH 7.2的磷酸盐缓冲溶液。将电池电极浸入缓冲溶液中，并在电极电位稳定后记录EMF读数。使用log[ACh之间构建的校准图计算ACh的量+]与潜在读数相比。
3.5. 乙酰胆碱酯酶（AChE）的生物测定
将30.0 mL pH值为7.0的PBS转移到热固定容器中，并将电池电极浸入溶液中。在获得电化学系统的稳定电位读数后，1.0 mL 10−2ACh的M+添加了工作溶液。当电位再次稳定时，含有1.0×10的100-μL等分试样−3–6.0国际单位升−1添加AChE酶的量。从电位动力学曲线来看，电位随时间的变化（ΔE类/Δt吨)以初始利率表示(t吨=0）绘制与酶活性的关系图。然后将获得的线性校准曲线用于所有未知酶活性的监测。在相同条件下，在没有酶的情况下进行空白实验。
4.结论
在这里，我们重点展示了小型屏幕显示的固态控制ISE在面临复杂且相关的分析挑战时的价值。这项工作涉及使用碳基屏幕涂层陶瓷基底制备和表征电位型乙酰胆碱选择性膜传感器。PEDOT/PSS在用作离子到电子转换器时显示出优异的导电性。所开发的传感器基于TPB离子交换器和三乙酰基-β-CD离子载体的使用，o个-硝基苯甲醚(o个-NPOE）作为增塑剂，PVC作为聚合物基质。使用这些传感器获得了更高的准确度和精密度、良好的再现性、潜在稳定性、快速响应、可接受的选择性和高灵敏度。这些简单且经济高效的电势生物传感器还提供了与自动化系统的可能接口。高样品吞吐量范围为25–30个样品/h，使用流通系统也获得了良好的响应特性。乙酰胆碱酯酶（AChE）的活性也使用所提出的传感器进行测定。酶活性为5.0×10−3–5.2 IU/L。
致谢
作者感谢沙特国王大学科学研究院长通过科学研究副院长主席的资助。
作者贡献
A.H.K.、N.H.A.、A.E.-G.E.A.和T.A.Y.对研究进行了概念化，解释了结果，进行了实验，并准备了手稿；A.H.K.和A.E.-G.E.A合作编写了手稿；N.H.A.、A.E.-G.E.A.、A.A.A.和M.A.A.-O.进行了临床研究。所有作者阅读并批准了最终手稿。
基金
作者感谢沙特国王大学科学研究院长通过科学研究副院长主席的资助。
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