公共科学图书馆一号。2019; 14（2）：e0212978。
新辅助放化疗治疗局部晚期直肠癌患者可溶性编程细胞死亡-1和可溶性编程细胞死亡率-1的临床意义
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富田哲郎
1日本东京京都日本癌症研究基金会癌症研究所医院胃肠外科胃肠中心
秋叶高志（Takashi Akiyoshi）
1日本东京京都日本癌症研究基金会癌症研究所医院胃肠外科胃肠中心
山本北彦
2日本东京日本癌症研究基金会癌症研究所病理科
田口贤三
三日本东京日本癌症研究基金会癌症研究所医院放射肿瘤学系
森喜朗
4日本东京日本癌症研究基金会癌症精确医学中心
长崎俊彦
1日本东京京都日本癌症研究基金会癌症研究所医院胃肠外科胃肠中心
福田洋介
1日本东京京都日本癌症研究基金会癌症研究所医院胃肠外科胃肠中心
上野正史
1日本东京京都日本癌症研究基金会癌症研究所医院胃肠外科胃肠中心
阿米尔·艾哈迈德，编辑器
1日本东京京都日本癌症研究基金会癌症研究所医院胃肠外科胃肠中心
2日本东京日本癌症研究基金会癌症研究所病理科
三日本东京日本癌症研究基金会癌症研究所医院放射肿瘤学系
4日本东京日本癌症研究基金会癌症精确医学中心
美国南阿拉巴马大学米切尔癌症研究所
竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。
2018年12月9日收到；2019年2月12日验收。
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S1表：患者特征取决于放化疗前后血清sPD-1水平。（DOCX）
GUID:C22CD58C-84B8-4180-8973-DEB8176E3D35
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所有相关数据都在手稿及其支持信息文件中。
摘要
背景
抑制程序性细胞死亡-1/PD-L1轴结合放射治疗可能是一种很有前景的治疗癌症的方法。在本研究中，我们旨在评估接受新辅助放化疗（CRT）治疗的晚期直肠癌患者的血清可溶性PD-1/PD-L1水平。
方法
采用酶联免疫吸附法测定117例低位直肠癌患者CRT治疗前后血清可溶性PD-L1和PD-1水平。评估CRT后sPD-L1/PD-1水平的变化，以及sPD-L1/1水平与临床病理特征或无病生存期（DFS）的相关性。
结果
CRT后sPD-L1水平显著升高（p<0.0001），而sPD-1水平没有显著变化（p=0.1050）。CRT前高sPD-L1与年轻人显著相关（p=0.044），CRT后与淋巴血管侵犯显著相关（p=0.021）。CRT前后的高sPD-1与肿瘤离肛门边缘的距离较长显著相关（均p＜0.001）。sPD-L1水平与基质免疫细胞局部PD-L1表达无相关性。CRT后高sPD-L1水平往往与较差的DFS相关（p=0.0752）。多变量分析不能证明CRT后sPD-L1水平与DFS的独立相关性。
结论
CRT后sPD-L1水平显著升高，提示抗PD-L1治疗可能是与CRT联合治疗晚期直肠癌的一种潜在治疗策略。
材料和方法
患者
我们前瞻性地收集了117例接受常规长程新辅助放疗的低位直肠癌患者的血清样本，这些患者于2013年7月至2017年4月在我院接受手术治疗，分别在放疗开始前和放疗结束后（即手术前）采集血清样本。根据CT和MRI对治疗前临床分期进行评估。CRT的适应证为：低位直肠癌，下缘位于腹膜反射下；CT和/或MRI检查的临床T3/T4和/或结节阳性疾病；没有远处转移的证据。CRT包括口服5-氟尿嘧啶和总剂量为50.4Gy的放射治疗。CRT完成后6-8周进行手术。
收集所选患者的临床特征，包括性别、手术年龄、肿瘤与肛门边缘的距离、预处理癌胚抗原（CEA）水平以及临床T和N分类。收集的手术和病理数据包括手术程序、病理T和N分类、肿瘤退化等级（TRG）、组织学类型、淋巴血管浸润状态和辅助化疗。目前的回顾性研究由日本东京癌症研究所医院的机构审查委员会批准（批准号“2013-1003”），并根据《赫尔辛基宣言》进行。所有患者均已签署知情同意书。
sPD-L1和sPD-1 ELISA
在常规静脉穿刺期间，从每位患者身上采集血样。全血通过离心分离成血清和细胞组分（4°C下3000 rpm，10分钟）。然后对上清液进行校准，并将其储存在−80°C下。根据制造商的建议，使用商用夹心ELISA试剂盒（美国德克萨斯州休斯顿Cloud-Clone公司，目录号SEA788Hu（sPD-L1），SEA751Hu（s PD-1））测量可溶性PD-L1和PD-1水平。对每个样本进行一式两份的分析。sPD-L1和sPD-1的最小可检测浓度为0.057 ng/ml，检测范围为0.156至10 ng/ml。如果检测值小于0.057 ng/ml，则替换为0.01 ng/ml。sPD-L1和sPD-1浓度在等于或大于0.156 ng/mL时被定义为高（sPD-Ll高或sPD-1高），而在小于0.156 ng/mL时则被定义为低（sPD-L1低或sPD-1低）。组内和组间变异系数均低于20%。使用标准曲线计算sPD-L1或sPD-1浓度。
肿瘤回归等级
根据德沃拉克标准，在苏木精-伊红染色样本上评估术前CRT后原发肿瘤的TRG[18]：TRG 0，无回归；TRG 1，占优势的肿瘤肿块，有明显的纤维化和/或血管病变；TRG 2，占优势的纤维化改变，肿瘤细胞或组很少；TRG 3，在有或无粘液物质的纤维化组织中很少有肿瘤细胞；和TRG 4，没有活的肿瘤细胞，只有纤维化细胞。
免疫组织化学
如前所述，使用兔单克隆抗PDL1抗体（稀释度1:1200，ab205921；英国剑桥Abcam）对2014年12月之前手术患者CRT前后的福尔马林固定石蜡包埋标本（活检和切除标本）进行免疫染色[15]. 超过5%的基质免疫细胞中中度至强表达PD-L1阳性[15].
统计分析
使用卡方检验或Fisher精确检验比较分类变量的差异。采用Mann-Whitney U检验分析连续变量。采用Wilcoxon配对符号秩检验比较CRT前后sPD-L1或sPD-1水平。生存分析采用Kaplan–Meier方法和log-rank检验。DFS定义为从手术到任何原因导致的复发或死亡的时间。所有小于0.05的P值均被视为显著。使用Cox比例风险模型进行单因素和多因素分析，以评估复发的预测因素。单变量分析中P值小于0.2的变量通过多变量分析进行检验。使用GraphPad Prism 7软件（GraphPad-software Inc.，加利福尼亚州圣地亚哥，美国）或JMP软件V10.0.2（SAS Institute Inc.；Cary，NC，美国）进行统计分析。
结果
显示了参与本研究的117名患者的临床病理特征。肿瘤与肛门边缘的中间距离为40 mm（范围为0至80 mm）。大多数患者被诊断为T3。
表1
117例患者的临床病理特征。
| 性别 | |
| 男性 | 77 (65.8%) |
| 女性 | 40 (34.2%) |
| 年龄（年）（范围） | 61 (27–79) |
| 肿瘤与AV的距离（mm）（范围） | 40 (0–80) |
| 基线CEA>5 ng/ml | 35 (29.9%) |
| 临床T类 | |
| T2段 | 1 (0.9%) |
| T3航站楼 | 105 (89.7%) |
| T4类 | 11人（9.4%） |
| 临床阶段 | |
| 二 | 55 (47.0%) |
| 三 | 62 (53.0%) |
| 组织学类型 | |
| 良好/中等 | 113 (96.6%) |
| 贫穷的 | 4（3.4%） |
| 操作程序 | |
| 保存狮身人面像 | 81 (69.2%) |
| Sphinctor非储备 | 36 (30.8%) |
| ypT类别 | |
| ypT0型 | 12 (10.2%) |
| ypT类型 | 2 (1.7%) |
| ypT1型 | 10 (8.6%) |
| ypT2型 | 40 (34.2%) |
| ypT3型 | 51 (43.6%) |
| 类型T4 | 2 (1.7%) |
| ypN类别 | |
| 类型N0 | 92 (78.6%) |
| ypN1型 | 19 (16.2%) |
| ypN2型 | 6 (5.2%) |
| 肿瘤回归等级 | |
| TRG1号机组 | 37 (31.6%) |
| TRG2型 | 63 (53.8%) |
| TRG3型 | 4 (3.4%) |
| TRG4型 | 13 (11.2%) |
| 辅助化疗 | 42 (35.9%) |
在CRT治疗前后检测sPD-L1和sPD-1的血清浓度。对所有（117）例CRT前患者和91例CRT后患者的sPD-L1进行评估。CRT前67名患者（57%；n=117）和CRT后27名患者（30%；n=91）的sPD-L1水平低于检测下限。CRT后sPD-L1水平显著升高（p<0.0001）(). 对113例CRT患者和88例CRT后患者的sPD-1进行评估。CRT前80名患者（71%；n=113）和CRT后53名患者（60%；n=88）的sPD-1水平低于检测下限。CRT前后sPD-1水平无显著差异（p=0.1050；).
放化疗前后可溶性编程细胞死亡-1（PD-L1）和可溶性编程细胞凋亡-1（PD-1）表达水平的变化。（A） sPD-L1水平的变化。（B） sPD-1水平的变化。
根据CRT前后血清sPD-L1水平（高或低）显示患者特征。CRT前高sPD-L1与年轻人显著相关（p=0.044），CRT后高sPD-L1与淋巴血管侵犯显著相关（p=0.021）。CRT前和CRT后高sPD-1与肿瘤离肛门边缘的距离较长（均p<0.001）和保肛手术率较高（分别p=0.007和p=0.004；S1表).
表2
患者特征取决于放化疗前后血清sPD-L1水平。
| 预CRT（N=117） | | 后CRT（N=91） | |
|---|
| sPD-L1低（N=87） | sPD-L1高（N=30） | P（P） | sPD-L1低（N=45） | sPD-L1高（N=46） | P（P） |
|---|
| 性别 | | | 0.436 | | | 0.274 |
| 男性 | 59 (67.8%) | 18 (60.0%) | | 27 (60.0%) | 33 (71.7%) | |
| 女性 | 28 (32.2%) | 12（40.0%） | | 18 (40.0%) | 13 (28.3%) | |
| 年龄（年）（范围） | 63 (27–79) | 57 (29–75) | 0.044 | 63（34–77） | 61 (27–79) | 0.744 |
| 肿瘤与AV的距离（mm）（范围） | 40 (0–80) | 35 (0–70) | 0.096 | 40 (0–70) | 40 (0–80) | 0.745 |
| 预处理CEA（ng/mL）（范围） | 3.5 (0.5–104.1) | 3.4 (0.9–12.6) | 0.195 | 3.4 (1.2–58.5) | 3.4 (0.5–104.1) | 0.411 |
| 操作程序 | | | 0.591 | | | 0.207 |
| 低位前切除术 | 36 (41.4%) | 10 (33.3%) | | 21 (46.7%) | 14 (30.4%) | |
| 鞘间切除术 | 26 (29.9%) | 8 (26.7%) | | 11 (24.4%) | 18人（39.1%） | |
| 哈特曼程序 | 1 (1.1%) | 0 (0%) | | 1 (2.2%) | 0 (0%) | |
| 腹会阴切除术 | 24 (27.6%) | 12（40.0%） | | 12 (26.7%) | 14 (30.4%) | |
| 临床T类 | | | 0.247 | | | 0.573 |
| T2段 | 1 (1.1%) | 0（%） | | 1 (2.2%) | 0 (0%) | |
| T3航站楼 | 80 (92.0%) | 25 (83.3%) | | 40 (88.9%) | 41 (89.1%) | |
| T4类 | 6 (6.9%) | 5 (26.7%) | | 4 (8.9%) | 5 (10.9%) | |
| 临床阶段 | | | 0.372 | | | 0.114 |
| 二 | 43 (49.4%) | 12 (40.0%) | | 27 (60.0%) | 20 (43.5%) | |
| 三 | 44 (50.6%) | 18 (60.0%) | | 18 (40.0%) | 26 (56.5%) | |
| ypT类别 | | | 0.408 | | | 0.312 |
| ypT0型 | 10 (11.5% | 2 (6.7%) | | 6 (13.3%) | 4 (8.7%) | |
| ypT类型 | 2 (2.2%) | 0 (0%) | | 2（4.4%） | 0 (0%) | |
| ypT1型 | 9 (10.3%) | 1 (3.3%) | | 2 (4.4%) | 3 (6.5%) | |
| ypT2型 | 26人（29.9%） | 14 (46.7%) | | 19 (42.2%) | 14 (30.4%) | |
| ypT3型 | 39 (45.0%) | 12 (40.0%) | | 16 (35.6%) | 23 (50.0%) | |
| 类型T4 | 1 (1.1%) | 1 (3.3%) | | 0 (0%) | 2 (4.4%) | |
| ypN类别 | | | 0.731 | | | 0.410 |
| 类型N0 | 69 (79.3%) | 23 (76.7%) | | 38 (84.4%) | 36 (78.3%) | |
| ypN1型 | 13 (14.9%) | 6 (20.0%) | | 6人（13.3%） | 10 (22.7%) | |
| ypN2型 | 5 (5.8%) | 1 (3.3%) | | 1 (2.2%) | 0 (0%) | |
| 肿瘤回归等级 | | | 0.490 | | | 0.299 |
| TRG1号机组 | 27 (31.0%) | 10 (33.3%) | | 11 (24.4%) | 18 (39.1%) | |
| TRG2型 | 45人（51.7%） | 18 (60.0%) | | 27 (60.0%) | 20 (43.5%) | |
| 3号机房 | 4 (4.6%) | 0 (0%) | | 1 (2.2%) | 3 (6.5%) | |
| TRG4型 | 11 (12.7%) | 2 (6.7%) | | 6 (13.3%) | 5 (10.9%) | |
| 组织学类型 | | | 1 | | | 1 |
| 良好/中等 | 84 (96.5%) | 29 (96.7%) | | 44 (97.8%) | 45 (97.8%) | |
| 可怜的 | 3 (3.5%) | 1 (3.3%) | | 1 (2.2%) | 1 (2.2%) | |
| 淋巴管浸润 | | | 0.077 | | | 0.021 |
| 否定 | 51 (58.6%) | 12（40.0%） | | 30 (66.7%) | 19 (41.3%) | |
| 积极的 | 36 (41.4%) | 18 (60.0%) | | 15 (33.3%) | 27 (58.7%) | |
| 辅助化疗 | | | 0.434 | | | 0.824 |
| 否 | 54 (62.1%) | 21 (70.0%) | | 31 (68.9%) | 30 (65.2%) | |
| 是的 | 33 (37.9%) | 9 (30.0%) | | 14（31.1%） | 16 (44.8%) | |
接下来，我们通过免疫组织化学方法评估sPD-L1水平与基质免疫细胞组织PD-L1表达之间的相关性。在44例患者中，我们可以在CRT前评估活检标本中PD-L1的表达和sPD-L1水平，活检标本中高PD-L1表达和低PD-L1表现的比例没有显著差异[5.6%（1/18）vs 15.4%（4/26）；p=0.6337]。在33例患者中，我们可以在CRT后评估切除标本中PD-L1的表达和sPD-L1水平，在切除标本中高PD-L1表达和低PD-L1表示的比例没有显著差异[61.1%（11/18）vs 46.7%（7/15）；p=0.4939]。
中位随访时间为33.7个月（8.0至60.6个月）。CRT后sPD-L1水平高的患者的无病生存率（DFS）比sPD-Ll水平低的患者差（p=0.0752）；虽然，p值没有达到统计意义(). CRT前sPD-L1水平与DFS无关（p=0.3441；). CRT前后sPD-1的浓度与DFS无关（分别为p=0.6777和p=0.8885；).显示了DFS相关因素的单变量和多变量分析结果。在单变量分析中，男性（p=0.0490）、病理T3/4（p=0.0008）、病理性淋巴结转移（p<0.0001）和淋巴血管侵犯（p=0.005）与DFS恶化显著相关。在多变量分析中，病理性淋巴结转移仍是DFS的独立预测因素（HR:4.61，95%CI:1.82至12.32，p=0.0013）。CRT后sPD-L1水平未达到统计显著性（HR:1.85，95%CI:0.77-4.89，p=0.1727）。
无病生存期（DFS）与放化疗（CRT）前后可溶性程序性细胞死亡-1（PD-L1）和可溶性程序性死亡-1（PD-1）水平相关。（A） 与CRT前sPD-L1级别相关的DFS。（B） CRT后与sPD-L1水平相关的DFS。（C） 与CRT前sPD-1级相关的DFS。（D） CRT后与sPD-1水平相关的DFS。
表3
无病生存率相关因素的单变量和多变量分析。
| 变量 | 单变量分析 | 多元分析 |
|---|
| 心率（95%置信区间） | p值 | 心率（95%置信区间） | p值 |
|---|
| 年龄（<70岁vs.≥70岁） | 0.85 (0.25–2.28) | 0.7679 | | |
| 性别（女性vs男性） | 2.70（1.00–9.35） | 0.0490 | 2.28 (0.83–7.99) | 0.1149 |
| 与AV的距离（≤40 mm vs>40 mm） | 0.57 (0.22–1.36) | 0.2125 | | |
| 基线CEA>5（无与有） | 1.99 (0.82–4.64) | 0.1245 | 1.23 (0.48–3.00) | 0.6636 |
| 病理性T分类（其他vs 3/4） | 4.67 (1.84–14.21) | 0.0008 | 2.34 (0.85–7.62) | 0.1046 |
| 病理性淋巴结转移（否vs是） | 7.86 (3.37–19.19) | <0.0001 | 4.61 (1.82–12.32) | 0.0013 |
| 淋巴管侵犯（否vs是） | 4.93 (1.95–15.02) | 0.0005 | 1.96 (0.69–6.55) | 0.2163 |
| CRT后sPD-L1水平（低vs高） | 2.21 (0.93–5.80) | 0.0721 | 1.85 (0.77–4.89) | 0.1727 |
讨论
在本研究中，我们发现sPD-L1，而不是sPD-1，在CRT后显著增加。与sPD-L1水平较低的患者相比，CRT后sPD-Ll水平较高的患者表现出DFS恶化的趋势。这是首次证明晚期直肠癌患者经CRT治疗后sPD-L1水平的变化。
先前的研究表明，sPD-L1在几种恶性肿瘤中升高[7,9]，截止值为0.00965～7.32 ng/mL，阳性率为29.8%～56.0%[9]. 在本研究中，我们根据CRT后sPD-L1的中位数浓度（0.16 ng/mL）确定了截止值。我们发现，CRT前后的sPD-L1和sPD-1水平与对CRT的病理反应（如ypT、ypN和TRG）没有显著相关性，并表明sPD-L1和sPD-1都不能预测直肠癌对CRT的病理反应。
虽然以前没有在直肠癌中检测到sPD-L1，但以前的研究已经报道了通过免疫组织化学方法在结直肠癌中表达膜结合PD-L1和PD-1。Lee等人表明，错配缺陷型结直肠癌中肿瘤细胞PD-L1阳性率和肿瘤浸润淋巴细胞PD-1阳性率分别仅为2%和13%，显著低于错配缺陷性结直肠癌的阳性率（18%和50%）[12]. 考虑到直肠癌中不匹配-修复缺陷肿瘤的比例很低[19]推测sPD-L1可能由直肠癌中肿瘤细胞以外的细胞产生。
在本研究中，我们发现sPD-L1水平在CRT后显著升高。与我们的结果一致，先前对接受放疗的肝细胞癌患者的研究显示，放疗后sPD-L1水平显著升高[20]. CRT后sPD-L1水平的升高表明PD-L1可能是晚期直肠癌与CRT联合治疗的靶点。使用治疗前活检标本和接受CRT治疗的直肠癌患者的切除标本，两项免疫组织化学研究表明，CRT治疗后肿瘤细胞PD-L1表达显著增加[16,17]. 我们还发现，在晚期直肠癌患者接受CRT治疗后，基质免疫细胞上PD-L1的表达显著增加[15]. 然而，两项相互矛盾的研究表明，CRT后肿瘤PD-L1表达没有显著变化[15,21]在本研究中，通过免疫组织化学方法，我们无法检测到sPD-L1水平与基质免疫细胞局部PD-L1表达之间的显著相关性。据报道，在弥漫性大B细胞淋巴瘤中，肿瘤细胞或肿瘤微环境中非恶性细胞上的sPD-L1和PD-L1表达之间也没有类似的相关性[22,23]和胰腺癌[24]. 因此，推测sPD-L1的产生机制是复杂的，与肿瘤部位PD-L1表达没有直接关系。此外，sPD-L1可能有多个来源。事实上，之前的一项研究表明，髓源性细胞可能是sPD-L1的天然来源[25]. 关于sPD-1的水平，尽管据报道非小细胞肺癌化疗期间sPD-1水平升高[26]，我们发现CRT后sPD-1没有显著增加。
在我们的研究中，我们发现CRT后高sPD-L1水平往往与较差的DFS相关。然而，在多变量分析中，我们发现病理性淋巴结转移是DFS恶化的唯一独立预测因子，并且我们未能显示sPD-L1水平与DFS的独立相关性。虽然这可能是由于样本量较小，并且需要对更多患者进行进一步研究，以澄清sPD-L1水平和DFS之间的关系，但我们的数据表明，与ypN状态相比，sPD-Ll水平可能与DFS没有强相关性。然而，DFS恶化的趋势表明，CRT后sPD-L1水平升高可能反映了全身免疫抑制状态，CRT和免疫检查点抑制剂联合使用可能有效克服这些患者的免疫抑制环境。最近，一项Ib/II期试验的初步报告表明，CRT和抗PD-1抗体（nivolumab）联合使用可能提高晚期直肠癌的完全缓解率[27].
我们的研究有几个局限性。首先，本研究是一项单中心、回顾性、探索性分析，样本量较小。其次，使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒对sPD-L1和sPD-1的评估尚未标准化，最佳截止值尚未确定。第三，随访时间不够长。最后，血液取样仅限于CRT前后，我们无法确定手术后sPD-L1水平的变化。
总之，在晚期直肠癌患者中，sPD-L1水平在CRT后显著升高，sPD-L1水平高的患者在CRT之后往往表现出较差的DFS。CRT后sPD-L1水平的升高表明，CRT和免疫检查点抑制剂联合应用可能是一种有前景的晚期直肠癌患者的治疗策略。
支持信息
S1表
患者特征取决于放化疗前后血清sPD-1水平。（DOCX）
致谢
我们感谢丽贝卡·杰克逊的编辑支持。我们感谢井上拉木的技术援助。
资金筹措表
这项工作得到了JSPS KAKENHI的支持，批准号为15K10156（TA）和18K08664（TA）。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。
数据可用性
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1Sauer R、Becker H、Hohenberger W、Rodel C、Wittekind C、Fietkau R等。直肠癌术前与术后放化疗.N英格兰J医学. 2004;351(17):1731–40. 10.1056/NEJMoa040694[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 2Breugom AJ、van Gijn W、Muller EW、Berglund A、van den Broek CB、Fokstuen T等人。术前（化疗）放疗和全直肠系膜切除治疗直肠癌患者的辅助化疗：荷兰结直肠癌组（DCCG）随机III期试验.肿瘤学年鉴. 2015;26(4):696–701. 10.1093/annonc/mdu560[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 三。Roh MS、Colangelo LH、O'Connell MJ、Yothers G、Deutsch M、Allegra CJ等。术前多模式治疗提高直肠癌患者的无病生存率：NSABP R-03.临床肿瘤学杂志. 2009;27(31):5124–30. 10.1200/JCO.2009.22.0467[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 4Folkesson J、Birgisson H、Pahlman L、Cedermark B、Glimelius B、Gunnarsson U。瑞典直肠癌试验：放疗对生存率和局部复发率的长期益处.临床肿瘤学杂志. 2005;23(24):5644–50. 10.1200/JCO.2005.08.144[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 5Nilsson PJ、van Etten B、Hospers GA、Pahlman L、van de Velde CJ、Beets-Tan RG等。局部晚期直肠癌短程放疗后新辅助化疗——RAPIDO试验.BMC癌症. 2013;13:27910.1186/1471-2407-13-279[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 6Bujko K、Wyrwicz L、Rutkowski A、Malinowska M、Pietrzak L、Krynski J等人。cT4或固定cT3直肠癌术前长疗程奥沙利铂化疗与5 x 5 Gy和巩固化疗的比较：一项随机III期研究的结果.肿瘤学年鉴. 2016;27(5):834–42. 10.1093/annonc/mdw062[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 7Zhu X，Lang J。可溶性PD-1和PD-L1在癌症中的预测和预后意义.Oncotarget公司2017年；8(57):97671–82. 10.18632/目标18311[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 8马伟（Ma W）、吉利根（Gilligan BM）、袁杰（Yuan J）、李涛（Li T）。PD-1/PD-L1免疫检查点阻断治疗中翻译生物标志物的研究现状与展望.血液肿瘤杂志. 2016;9(1):4710.1186/s13045-016-0277年[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 9魏伟，徐斌，王毅，吴C，蒋J，吴C。循环可溶性程序性死亡配体-1在实体瘤患者中的预后意义：一项荟萃分析.医学. 2018;97(三)：e961710.1097/MD.0000000000009617[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 10Chen Y，Wang Q，Shi B，Xu P，Hu Z，Bai L等人。用于评估不同年龄段人血清和PD-L1+细胞系上清液中可溶性PD-L1（CD274）的夹心ELISA的研制.细胞因子. 2011;56(2):231–8. 2016年10月10日/截至2011年6月4日[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 11Frigola X、Inman BA、Lohse CM、Krco CJ、Cheville JC、Thompson RH等。鉴定一种保留免疫抑制活性并与侵袭性肾细胞癌相关的可溶性B7-H1.临床癌症研究. 2011;17(7):1915–23. 10.1158/1078-0432.立方厘米10-0250[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 12Lee LH、Cavalcanti MS、Segal NH、Hechtman JF、Weiser MR、Smith JJ等人。大肠癌中PD-1和PD-L1的表达模式及预后相关性.病态. 2016;29(11):1433–42. 10.1038/modpathol.2016.139[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 13Lee KS、Kwak Y、Ahn S、Shin E、Oh HK、Kim DW等。肿瘤浸润免疫细胞中CD274（PD-L1）蛋白表达对微卫星不稳定和稳定结直肠癌的预后影响.癌症免疫疗法2017年；66(7):927–39. 2007年10月10日/00262-017-1999-6[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 14Le DT、Uram JN、Wang H、Bartlett BR、Kemberling H、Eyring AD等。PD-1在失配修复缺陷肿瘤中的阻断作用.N英格兰J医学. 2015;372(26):2509–20. 10.1056/NEJMoa1500596[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 15Ogura A、Akiyoshi T、Yamamoto N、Kawachi H、Ishikawa Y、Mori S等。直肠癌放化疗前后程序性细胞死亡-1表达及CD8-阳性T细胞浸润的变化.欧洲癌症杂志. 2018;91:11–20. 2016年10月10日/j.ejca.2017.12.005[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 16Lim YJ、Koh J、Kim S、Jeon SR、Chie EK、Kim K等人。直肠癌预后不良患者中化疗诱导的程序性死亡-抗原1和CD8（+）肿瘤浸润淋巴细胞的改变：一项配对比较分析.国际放射肿瘤生物物理杂志2017年；99(5):1216–24. 2016年10月10日/j.ijrobp.2017.07.004[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 17Hecht M、Butter-Herold M、Erlenbach-Wunsch K、Haderlein M、Croner R、Grutzmann R等。直肠腺癌患者放化疗后PD-L1上调，与良好的预后相关.欧洲癌症杂志. 2016;65:52–60. 2016年10月10日/j.ejca.2016.06.015[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 18Dworak O、Keilholz L、Hoffmann A。直肠癌术前放化疗后的病理特征.国际结肠疾病杂志. 1997;12(1):19–23. [公共医学][谷歌学者] 19Yamauchi M、Morikawa T、Kuchiba A、Imamura Y、Qian ZR、Nishihara R等人。评估结肠亚段结直肠癌的分子特征对近端结肠与远端结肠分叉的概念提出了挑战.肠子2012年；61(6):847–54. 10.1136/gutjnl-2011-300865[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 20Kim HJ、Park S、Kim KJ、Seong J。肝癌放疗患者可溶性程序性细胞死亡配体-1（sPD-L1）的临床意义.放射治疗Oncol. 2018;129(1)：130–35。2016年10月10日/j.radonc.2017.11.027[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 21滕发，孟X，孔磊，穆德，朱赫，刘S，等。直肠癌新辅助化疗放疗前后肿瘤滤过性淋巴细胞、叉头盒P3、程序性死亡配体-1和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4的表达.Transl分辨率. 2015;166(6)：721–32.e1。2016年10月10日/j.trsl.2015.06.019[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 22Rossille D、Azzaoui I、Feldman AL、Maurer MJ、Laboure G、Parrens M等。可溶性程序性死亡配体1作为弥漫性大B细胞淋巴瘤患者总生存率的预后生物标志物：一项对508名患者的复制研究和联合分析.白血病2017年；31(4):988–91. 10.1038/leu.2016.385[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 23Rossille D、Gressier M、Damotte D、Maucort-Boulch D、Pangault C、Semana G等人。血液中高水平可溶性程序性细胞死亡配体1影响侵袭性弥漫性大B细胞淋巴瘤的总体生存率：来自法国一项多中心临床试验的结果.白血病. 2014;28(12):2367–75. 10.1038/leu.2014.137[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 24Kruger S、Legenstein ML、Rosgen V、Haas M、Modest DP、Westphalen CB等。晚期胰腺癌患者血清可溶性编程死亡蛋白1（sPD-1）和可溶性编程死亡配体1（sPD-L1）的水平.肿瘤免疫学2017年；6(5)：e131035810.1080/2162402X.2017.1310358[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 25Frigola X、Inman BA、Krco CJ、Liu X、Harrington SM、Bulur PA等。可溶性B7-H1：树突状细胞和T细胞产生的差异.免疫Lett2012年；142(1–2):78–82. 2016年10月10日/j.imlet.2011.1001[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 26索伦森SF、德茅斯C、韦伯B、索伦森BS、梅尔德加德P。可溶性PD-1的增加与厄洛替尼治疗的晚期EGFR-突变非小细胞肺癌患者延长生存期相关.肺癌. 2016;100:77–84. 2016年10月10日/j.lungcan.2016.08.001[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 27Bando H、Tsukada Y、Inasori K、Fukuoka S、Sasaki T、Nishizawa Y等人。电压：局部晚期直肠癌（LARC）患者术前卡培他滨放化疗（CRT）后nivolumab单药治疗和随后根治性手术的多中心Ib/II期研究.肿瘤学年鉴. 2018;29(补充5)mdy151227，10.1093/annonc/mdy151.227[交叉参考][谷歌学者] 
