国际分子医学杂志。2018年8月；42(2): 745–754.
从中提取的植酸8-O-β-吡喃葡萄糖苷虎杖通过TGF-β/MAPK途径对MH7A类风湿关节炎衍生成纤维细胞样滑膜细胞具有抗增殖和抗炎作用
,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1和2
秦庚
1山东省淄博市淄博中心医院风湿病科，山东淄博255036
乔凤伟
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王淑君
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慧丽琪
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秦朱
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刘霞
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史晓军
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文淑云
2中国山东省德州市德州市人民医院中医风湿病科，邮编253000
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2017年8月4日收到；2018年3月22日接受。
- 数据可用性声明
本研究中使用或分析的数据集可根据合理要求从相应作者处获得。
摘要
本研究旨在探讨physcion 8-O-β-吡喃葡萄糖苷（POGD）的抗关节炎作用及其可能的机制。用CCK-8法检测POGD对MH7A细胞的抗增殖作用，用ELISA法检测促炎细胞因子白介素-1β、白介素-6、IL-8、IL-12和IL-17A的释放。建立Ⅱ型胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠模型，评价POGD的抗关节炎作用体内ELISA法测定足爪体积、关节炎指数和血清肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17A水平。采用逆转录定量聚合酶链反应分析法检测基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-3、MMP-9、血管内皮生长因子（VEGF）和环氧合酶-2的mRNA表达水平，并检测转化生长因子（TGF）-β1、小母亲抗十搏停搏（Smad）4、Smad7、，western blot分析测定c-Jun N末端激酶（JNK）、磷酸化（p-）JNK、p-P38、P38、p-细胞外信号调节激酶（ERK）1/2、ERK1/2、核内核因子（NF）-κB p65、细胞溶质NF-κBp65（c）和核因子κB抑制剂（IκB）。结果表明，POGD显著抑制MH7A细胞生长。POGD显著抑制CIA大鼠的足肿胀和关节炎指数，POGD也可能抑制促炎细胞因子的释放。此外，在TNF-α诱导的MH7A细胞中，POGD下调TGF-β1、Smad4、NF-κB p65（N）、p38、p-p38、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、TGF-β1、Smad4、p-JNK、JNK、p-p38、p38、p-ERK1/2、ERK1/2和NF-κB p65（N）的表达水平，并上调Smad7、NF-κB p65（C）和IκB。综上所述，研究结果表明，POGD是一种很有前景的潜在抗炎药，并且POGD可能通过抑制TGF-β/NF-κB/有丝分裂原激活的蛋白激酶途径来降低促炎细胞因子和介质的表达。
关键词：physcion 8-O-β-吡喃葡萄糖苷，抗增殖活性，抗炎作用，类风湿性关节炎
介绍
类风湿关节炎（RA）是一种自身免疫性疾病，可导致关节和身体其他部位的慢性炎症(1). 自身免疫系统对体内组织的损伤称为自身免疫性疾病(2). RA的特点是关节周围组织发炎，这种疾病也会导致身体其他器官发炎和损伤(三). 类风湿关节炎的慢性炎症可导致永久性关节破坏和畸形，这始于滑膜巨噬细胞和成纤维细胞的增殖(4). RA的治疗包括患者教育、休息和锻炼、关节保护、药物治疗以及偶尔的手术(5). 对于药物治疗，非甾体抗炎药通常用于减轻关节疼痛。包括甲氨蝶呤和柳氮磺胺吡啶在内的抗风湿病药物已开始使用，以尽早减缓疾病进展。此外，还引进了新的药物，包括转化生长因子-α（TNF-α）抑制剂、白细胞介素-6（IL-6）抑制剂和Janus激酶（JAK）抑制剂(6). 然而，目前还没有治愈RA的方法。早期RA治疗可改善预后。成纤维细胞样滑膜细胞（FLS）是类风湿关节中最显著的细胞类型，对RA的传播起着关键作用(7). 据报道，FLS直接导致软骨破坏，并导致炎症和自身免疫(7). 因此，旨在抑制RA-FLS增殖的治疗可能为RA的治疗提供一种合理有效的方法。
虎杖，也称为虎杖Houtt和Huzhang在中国是一种多年生草本植物，属于蓼科(8).虎杖广泛分布于中国南部和日本，是一种传统而著名的中草药(8). 长期以来，它被民间医学用于治疗炎症、感染、黄疸、皮肤烧伤和高血脂(8,9). 大量报告表明虎杖具有广泛的药理作用，包括抗休克、抗炎、抗氧化、抗癌和保肝作用(10–14). 目前，已经从这种植物中分离和鉴定了67种以上的化合物，包括醌类、二苯乙烯类、黄酮类、香豆素类和连接物(8). 叶黄素8-O-β-吡喃葡萄糖苷（POGD）是一种蒽醌类化合物()从根分离虎杖。据报道，POGD通过诱导细胞周期阻滞和凋亡，对A549细胞株具有显著的抗增殖活性(9). 本研究的目的是提高目前对POGD在MH7A RA-衍生成纤维细胞样滑膜细胞中的抗增殖和抗炎作用的认识。
physicon 8-O-β-吡喃葡萄糖苷的化学结构。
材料和方法
草药
虎杖购自山东省（中国山东）中医药商店。凭证样本虎杖存放于山东淄博市中心医院药剂科（中国山东）。
细胞和培养
MH7A-RA衍生的成纤维细胞样滑膜细胞系来自中国科学院（中国上海）类型培养文库。MH7A细胞在含有10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素和1%链霉素的RPMI-1640培养基中在5%CO中培养237°C下的增湿大气。
化学品和试剂
白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）、白细胞介素-10（IL-10）、白素-12（IL-12）和白介素-17A（IL-17A）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自Invitrogen；赛默飞世尔科技公司（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）；Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、FBS和胰蛋白酶来自Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.细胞计数试剂盒-8、BCA蛋白检测试剂和山羊抗兔/大鼠辣根过氧化物酶结合（HRP）二级抗体购自Beyotime生物技术研究所（中国江苏省海门市）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、二甲基亚砜（DMSO）、地塞米松、完全弗氏佐剂（CFA）和不完全弗氏辅助剂（IFA）购自Sigma（中国上海）；EMD Millipore（美国马萨诸塞州Billerica）；TGF-β1（分类号sc-130348）、抗十戊酸麻痹症（Smad）4（分类号sc-7154）、Smad7（分类号sc-11392）、组蛋白H1（分类号sc-8030）和β-肌动蛋白（分类号为sc-47778）抗体的小型母亲购自圣克鲁斯生物科技公司（美国加利福尼亚州圣克鲁斯）；c-Jun N末端激酶（JNK；分类号ab179461）、磷酸化[（p-）JNK（分类号ab124956）]、p-P38（分类号ab4822）、P38（类别号ab170099）、p-细胞外信号调节激酶（ERK）1/2（类别号ab223500）、ERK1/2（类别号ab 17942）、核因子（NF）-κB p65（类别号ab32536）和NF-κB抑制剂（IκB；类别号ab32518）抗体购自Abcam（美国马萨诸塞州剑桥市）。鸡II型胶原蛋白（CII）购自西安中草药王生物科技有限公司（中国山西西安）。使用的所有其他试剂均为分析纯级。
POGD的分离和制备
POGD的制备是根据前面描述的方法进行的，只需稍作修改(9). 简单地说，用8X75%乙醇水溶液回流三次提取粉碎的草药。在真空下蒸发总提取物以去除乙醇。然后用乙酸乙酯和正丁醇依次提取残余提取液，并在真空下蒸发正丁醇部分以获得干燥的正丁醇提取物。随后，通过硅胶（200-300目）柱色谱分离正丁醇提取物，用氯仿：甲醇（20:1、15:1、10:1、7:1、5:1、2:1和1:1）洗脱。基于薄层色谱分析，将正丁醇提取物亚组分的相似组分组合为六个亚组分（Fra.1-Fra.6）。随后，使用一系列重复硅胶柱色谱和Sephadex LH-20色谱，从馏分4中分离出目标化合物。
POGD的识别
POGD是根据1核磁共振氢谱和13C核磁共振实验，光谱数据如下：1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：11.32（1H，s，1-OH），7.42（1H、d，J=1.6 Hz，H-4），7.25（1H和d，J=2.8 Hz，H-5），7.12（1H，d，J=2.8 Hz，H-7），6.98（H，s和H-2），5.09（1H；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：187.9（C-9），183.6（C-10），165.7（C-6），163.2（C-1），162.6（C-8），148.3（C-3），138.0（C-10a），133.5（C-4a），125.6（C-2），120.7（C-4），115.9（C-8a），114.7（C-9a），109.8（C-7），109.8%（C-5），102.3（C-1′），78.8（C-3′），77.9（C-5′），74.7（C-2′），70.9（C-4′），62.1（C-6′），50.1（6-OCH3），22.9（3-CH3）。这些数据与之前报告的数据类似(9).
使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）进行细胞活力测定
根据制造商的方案，使用CCK-8测定POGD对细胞活性的影响。MH7A电池（5×10三细胞/孔）接种在96个培养皿中，并与不同浓度的POGD（4、8、16、32、64、128和256）孵育μ然后将CCK-8溶液添加到每个孔中，并在培养箱中再培养1小时。最后，使用96 well平板读取器在450 nm处读取光密度（OD）值（美国加利福尼亚州Hercules的Bio-read Laboratories，Inc.）。结果以DMSO处理的对照细胞的百分比计算。
ELISA法测定细胞因子水平
MH7A电池（5×105用TNF-α（10 ng/ml）在37°C和5%CO中处理12 h2分析前加湿空气。将细胞上清液通过pippeting去除，并用PBS洗涤细胞两次。然后将细胞暴露于增加浓度的POGD（8、16和32μ在治疗后，收集细胞上清液，并根据制造商的方案（美国明尼阿波利斯研发系统公司）使用ELISA检测试剂盒测定IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12和IL-17细胞因子的水平。
逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析MH7A细胞中基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-3、MMP-9、环氧合酶-2（COX-2）和血管内皮生长因子（VEGF）mRNA表达水平
RT-qPCR分析POGD对MMP-2、MMP-3、MMP-9、COX-2和VEGF mRNA表达水平的影响。MH7A电池（3×105细胞/孔）接种在6孔板中，并与增加浓度的POGD（15、30和60μg/ml）或载体（DMSO），在37°C下，在10 ng/ml TNF-α存在下72小时。随后，收集细胞，并使用RNAiso Plus试剂盒（中国大连塔卡拉生物科技有限公司）提取总RNA。然后使用PrimeScript™RT试剂盒（Takara Biotechnology Co.，Ltd.）使用总RNA合成MMP-2、MMP-3、MMP-9、COX-2、VEGF和β-actin的cDNA。使用SYBR Green混合物在CFX96 Touch实时PCR检测系统（Bio-Rad Laboratories，Inc.）上扩增合成的cDNA。每10个μl含有5μ1份SYBR绿色混合物，1份μ第1页，共2页μM正向和反向底漆混合物(), 1μcDNA的l和3μl ddH2O。PCR条件为95°C持续10分钟，然后是39个95°C循环15秒和58°C循环60秒。用于RT-qPCR分析的引物如所示使用2-ΔΔCq相对定量分析方法(15)并对所有样品进行一式三份的分析。
表一
| 作者，年份 | 基因 | 引物序列（5′-3′） | 产品规模（bp） | （参考文献） |
|---|
| 聚氨基甲酸酯等, 2016 | 基质金属蛋白酶-2 | 转发：TGGCAAGTACGGCTTCTTGTC | 179 | (16) |
| 反向：TTCTTGTCGCGGTCGTC | | |
| Tran公司等, 2005 | 基质金属蛋白酶-3 | 转发：CAGGCTTTCCCAAGAATA | 129 | (17) |
| 反面：TTGCATTTGGTCAACTCC | | |
| 聚氨基甲酸酯等, 2016 | 基质金属蛋白酶-9 | 转发：TGCGCTACCACCTCGAACTT | 200 | (16) |
| 反面：GATGCCATGACGTCCT | | |
| 奥斯佩尔特等, 2008 | 环氧化酶-2 | 转发：TTCAAATGGATGTGGGAAAT | 305 | (18) |
| 背面：AGATCATCTCTGCCTGAGTATCTT | | |
| 聚氨基甲酸酯等, 2016 | 血管内皮生长因子 | 转发：CGGCGAAGAGAGAGACACAA | 196 | (16) |
| 背面：GGAGGAAGGTCAACACTCA | | |
| 聚氨基甲酸酯等, 2016 | GAPDH公司 | 转发：GAGTCAACGGATTGGTCGT | 185 | (16) |
| 反面：GACAAGCTTCCCCGTTCTCAG | | |
蛋白质印迹分析
采用western blot分析方法检测POGD对MH7A细胞TGF-β1、Smad4、Smad2、Smad7、ERK1/2、P-ERK1/2，JNK、P-JNK，P-38、P-P38、NF-KB p65（N）、NF-KB p65（C）和IKB蛋白表达水平的影响。用任一等级浓度的POGD（15、30和60）处理后μg/ml）或载体（DMSO）在10 ng/ml TNF-α存在下72 h，收集细胞并使用western blot&IP细胞裂解缓冲液提取总蛋白（Sangon Biotech Co.，Ltd.，中国上海）。随后，使用BCA蛋白质分析试剂（Sangon Biotech Co.，Ltd.）测定总蛋白质的浓度。总蛋白质（40μg） 使用SDS-PAGE（12%凝胶）分离每个样品中的样品，并将其吸附在聚偏二氟乙烯滤膜（PVDF）上。随后，在4°C下用抗TGF-β1（1:3000）、Smad4（1:1000）、Smad 2（1:1000，然后与相应的HRP缀合的第二抗体在37°C下孵育2小时。最后，使用ECL检测试剂显示免疫反应带，并使用ImageJ软件（1.48版；美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）分析OD值。为了使蛋白质负荷正常化，TGF-β1、Smad4、Smad2、Smad7、ERK1/2、P-ERK1/2，JNK、P-JNK，P-38，P-P38，NF-KB p65（N），NF-KB p65（C）和IKB的表达水平被确定为与β-actin的相对值，p65（N）的表达水平则被确定为相对于组蛋白H1的相对值。
POGD体内抗关节炎作用的测定
从上海实验动物中心（中国上海）购买60只体重220±20 g的大鼠，其中30只雄性和30只雌性。每只动物均在标准条件下（21±1°C，50-10%相对湿度，12小时光/暗循环）饲养，并可自由获取食物和水。共60只大鼠被随机分为以下六组（n=10）：i）用生理盐水（10 ml/kg）处理的正常健康大鼠；ii）用生理盐水（10 ml/kg）治疗的对照、胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠；iii）地塞米松，CIA大鼠接受地塞米森治疗（阳性药物，0.05 mg/kg）；iv）POGD（20 mg/kg），CIA大鼠接受20 mg/kg剂量的POGD治疗；v） POGD（40 mg/kg），CIA大鼠接受40 mg/kg剂量的POGD治疗；和vi）POGD（60 mg/kg），CIA大鼠接受60 mg/kg剂量的POGD治疗。实验方案由德州人民医院动物护理和使用委员会（中国山东）批准。
评价POGD的抗关节炎作用体内，建立了一个CIA动物模型，正如之前报道的那样，只是做了一些小修改(16). 简而言之，用等体积的CFA乳化0.1 mM乙酸（4 mg/ml）中的CII。大鼠最初通过在尾部底部皮下注射CII乳剂进行免疫（100μl/大鼠）。14天后，CII乳液与等体积的IFA（100μl/大鼠）在同一位置皮下注射，大鼠口服生理盐水、地塞米松和POGD 21天。实验期间，每3天测量一次大鼠的爪子体积和关节炎指数。关节炎指数按以下顺序进行记录：0，未受影响，1，受影响的一种关节，2，受影响两种关节，3，受影响三种关节，4，受影响关节的三种类型加上最大红斑和肿胀。实验结束时，使用眼眶采血方案采集血样，并离心15分钟（1800×g，4°C）。根据制造商的方案，使用商业ELISA试剂盒测定TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-17A的血清水平。
统计分析
所有结果均表示为三次独立实验的平均值±标准偏差。使用SPSS 19.0软件包（IBM SPSS，Armonk，NY，USA）进行统计分析，并使用Dunnett检验进行单向方差分析，以比较两组之间的平均值。P<0.05被认为表明存在统计学上的显著差异。
结果
POGD对MH7A细胞活力的影响
使用CCK-8测定POGD对MH7A细胞活力的影响。如所示，POGD对MH7A细胞生长具有显著的抑制作用，且与IC呈浓度依赖性50值为49.76μ此外，POGD在72小时内以时间依赖性方式抑制MH7A细胞增殖().
POGD对MH7A细胞增殖的抑制作用。（A） 用POGD处理细胞（4、8、16、32、64、128和256μg/ml）持续36小时；进行CCK-8分析以确定细胞增殖抑制率（n=4）和IC50计算POGD值。（B） 用POGD处理细胞（8、32和64μg/ml）分别作用12、24、36、48和72小时；采用CCK-8法测定细胞增殖抑制率（n=4）。POGD，physcion 8-O-β-吡喃葡萄糖苷；CCK-8，细胞计数试剂盒-8。
POGD对TNF-α刺激的MH7A细胞IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12和IL-17A水平的影响
为了验证POGD对MH7A细胞的抗炎作用，采用ELISA法测定TNF-α诱导的MH7A淋巴细胞中炎症细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12和IL-17A的水平。如所示除IL-10外，与TNF-α组相比，POGD在浓度为8、16和32时，这些炎性细胞因子的水平显著降低（P<0.01μ克/毫升。
POGD对TNF-α刺激的MH7A细胞中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12和IL-17A水平的抑制作用。用TNF-α（10 ng/ml）预处理细胞12 h，然后将细胞暴露于POGD（8、16和32μg/ml）再持续24小时；采用酶联免疫吸附试验测定细胞上清液中细胞因子水平（n=4）。**与对照组（TNF-α组）相比，P<0.01。POGD，physcion 8-O-β-吡喃葡萄糖苷；白细胞介素；TNF-α、肿瘤坏死因子-α。
POGD对TNF-α刺激的MH7A细胞中MMP-2、MMP-3、MMP-9、VEGF和COX-2 mRNA表达水平的影响
在TNF-α诱导的MH7A细胞中，用RT-qPCR分析MMP-2、MMP-3、MMP-9、VEGF和COX-2的mRNA表达水平。POGD治疗24h后，MMP-2、MMP-3、MMP-9、VEGF和COX-2的mRNA表达水平与TNF-α组相比显著降低（P<0.01；).
POGD对TNF-α刺激的MH7A细胞MMP-2、MMP-3、MMP-9、VEGF和COX-2 mRNA表达水平的抑制作用。用TNF-α（10 ng/ml）预处理细胞12 h，然后将细胞暴露于POGD（8、16和32μg/ml）再持续24小时；采用逆转录定量聚合酶链反应检测MMP-2、MMP-3、MMP-9、VEGF和COX-2的mRNA表达水平（n=4）。**与对照组（TNF-α组）相比，P<0.01。POGD，physcion 8-O-β-吡喃葡萄糖苷；基质金属蛋白酶；VEGF，血管内皮因子；环氧化酶2；TNF-α、肿瘤坏死因子-α。
POGD对TNF-α刺激的MH7A细胞TGF-β1、Smad4和Smad7表达水平的影响
基于上述结果，POGD不仅抑制TNF-α刺激的MH7A细胞中促炎细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12和IL-17A的表达水平，而且降低MMP-2、MMP-3、MMP-9、VEGF和COX-2的mRNA表达水平。为了进一步研究这些变化的可能机制，使用western blot分析法测量TNF-α刺激的MH7A细胞中TGF-β1、Smad4和Smad7的蛋白表达水平。如所示与TNF-α组相比，POGD组TGF-β1和Smad4的蛋白表达水平显著下调，而TNF-β诱导的MH7A细胞中Smad7的蛋白表达显著上调。
POGD对TNF-α刺激的MH7A细胞中TGF-β1、Smad4和Smad7表达的调节作用。用TNF-α（10 ng/ml）预处理细胞12 h，然后将细胞暴露于POGD（8、16和32μg/ml）再持续24小时；western blot检测TGF-β、Smad4和Smad7的表达（n=4）。**与对照组（TNF-α组）相比，P<0.01。POGD，8-氧-β-吡喃葡糖苷；转化生长因子-β1；Smad，小妈妈反对十诫麻痹；TNF-α、肿瘤坏死因子-α。
POGD对TNF-α刺激的MH7A细胞ERK1/2、P-ERK1/2，JNK、P-JNK，P-38，P-P38表达水平的影响
本研究还使用western blot分析检测了TNF-α刺激和POGD处理的MH7A细胞中ERK1/2、P-ERK1/2，JNK，P-JNK、P-38和P-P38的蛋白表达水平。如所示POGD显著抑制TNF-α诱导的MH7A细胞中P-JNK、JNK，P-P38、P38、P-ERK1/2和ERK1/2的蛋白表达水平（P<0.01）。
POGD对TNF-α刺激的MH7A细胞中p-JNK、JNK，p-P38、P38、p-ERK1/2和ERK1/2表达的调节作用。用TNF-α（10 ng/ml）预处理细胞12 h，然后将细胞暴露于POGD（8、16和32μg/ml）再持续24小时；western blot检测p-JNK、JNK，p-P38、P38、p-ERK1/2和ERK1/2的表达水平（n=4）。**与对照组（TNF-α组）相比，P<0.01。POGD，physcion 8-O-β-吡喃葡萄糖苷；肿瘤坏死因子-α；JNK，c-Jun N末端激酶；ERK，细胞外信号调节激酶；p-，磷酸化。
POGD对TNF-α刺激的MH7A细胞中NF-κB p65（N）、NF-κB p65（C）和IκB表达水平的影响
本研究还利用western blot分析方法检测了POGD对TNF-α刺激的MH7A细胞中NF-κB p65（N）、NF-κ的B p65和IκB表达水平的影响。POGD治疗24小时后，NF-κB p65（N）的蛋白表达水平显著降低，而NF-kb B p65C和IκB的蛋白表达量显著增加（P<0.01），如.
POGD对TNF-α刺激的MH7A细胞中NF-κB和IκB表达的调节作用。用TNF-α（10 ng/ml）预处理细胞12 h，然后将细胞暴露于POGD（8、16和32μg/ml）再持续24小时；western blotting检测NF-κB和IκB的表达水平（n=4）。**与对照组（TNF-α组）相比，P<0.01。POGD，physcion 8-O-β-吡喃葡萄糖苷；肿瘤坏死因子-α；核因子-κB；（N） ，核能；（C） ，细胞质；IκB，NF-κB的抑制剂。
POGD降低CIA大鼠足肿胀和关节炎指数
建立CIA大鼠模型，评价POGD对RA大鼠的治疗作用。如所示与正常大鼠相比，实验大鼠经两次CII免疫后出现RA症状，包括足肿胀和关节炎指数升高（P<0.01）。使用地塞米松治疗后，这些症状明显改善。结果表明，从首次给药地塞米松后第6天起，CIA大鼠的足肿胀程度较对照组减轻（P<0.01；). 此外，地塞米松（0.05 mg/kg）治疗的CIA大鼠的关节炎指数与对照组相比显著降低（P<0.01；). 与地塞米松治疗的结果类似，当剂量为60 mg/kg时，POGD显著减少了爪肿胀（P<0.01），当剂量为20和40 mg/kg时，POGD适度减少了爪肿胀。此外，当剂量为20、40和60 mg/kg时，关节炎指数显著降低。
POGD对CIA大鼠足体积和关节炎评分变化的影响。建立CIA大鼠模型后，大鼠口服生理盐水、地塞米松或不同剂量的POGD。实验期间，（A）爪体积（mm三)每3天测定一次大鼠关节炎指数。数据表示为平均值±标准偏差（n=10）。*P<0.05，以及**与对照组相比，P<0.01。POGD，physcion 8-O-β-吡喃葡萄糖苷；CIA，II型胶原蛋白诱导的关节炎。
POGD降低CIA大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-17A的释放
如所示与正常大鼠相比，CIA大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-17A水平升高（P<0.01）。值得注意的是，与在对照CIA大鼠中观察到的释放相比，每天用20、40或60 mg/kg剂量的POGD治疗CIA大白鼠显著减少了这些调节性细胞因子释放到血清中（P<0.01）。地塞米松治疗组也观察到类似的结果。
POGD对CIA大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-17A释放的影响。建立CIA大鼠模型后，大鼠口服生理盐水、地塞米松或不同剂量的POGD。治疗30天后，收集血样，并使用酶联免疫吸附试验测定血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-17A水平。*P<0.05和**与对照组相比，P<0.01。POGD，physcion 8-O-β-吡喃葡萄糖苷；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素；CIA，II型胶原诱导的关节炎；CIA，II型胶原蛋白诱导的关节炎。
讨论
在本研究中，分析了POGD对MH7A]RA衍生的成纤维细胞样滑膜细胞和CIA大鼠的抗增殖和抗炎活性。POGD显著抑制MH7A细胞生长，并降低TNF-α刺激后炎症细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12和IL-17A的水平。此外，与TNF-α组相比，MMP-2、MMP-3、MMP-9、VEGF和COX-2的mRNA表达水平显著降低。POGD还显著降低了TNF-α诱导的MH7A细胞中TGF-β1、Smad4、P-JNK、JNK，P-P38、P38、P-ERK1/2、ERK1/2和NF-κB p65（N）的蛋白表达水平，但增加了Smad7、NFκB P 65（C）和IκB的蛋白表达。此外，POGD抑制CIA大鼠的足肿胀、关节炎指数和促炎细胞因子的释放。
滑膜细胞扩张是RA患者炎症滑膜的主要病理表现之一(17). 滑膜增生侵入软骨和骨骼会导致关节直接损伤和慢性炎症就地(18). 在增生性滑膜中，RA-FLS是主要的细胞类型，肿瘤样扩张是其特征。据报道，RA-FLS总是导致软骨侵袭(7,19). 因此，对MH7A细胞的抗增殖作用被认为是治疗RA的有效方法。RA-FLS的抑制也减少了促炎细胞因子的产生。在本研究中，POGD对MH7A细胞表现出强大的抗增殖和抗炎活性在体外这些作用对减轻关节滑膜增生、炎症和骨退化非常重要。
众所周知，CIA模型是RA最常用的自身免疫模型，其诱导的免疫学和病理学特征与人类观察到的RA疾病相似(20). 本研究成功建立了CIA大鼠模型，用于评价POGD的抗关节炎活性。结果数据表明，POGD治疗降低了CIA大鼠的足肿胀和关节炎指数，表明POGD可能具有潜在的治疗效果体内.
TNF-α是一种促炎细胞因子，据报道在人类RA的发展和进展中起重要作用(21). 据报道，TNF-α可以诱导淋巴细胞、巨噬细胞和滑膜成纤维细胞释放促炎细胞因子(22). 在本研究中，发现TNF-α刺激的MH7A细胞中炎症细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12和IL-17水平升高，表明人类RA炎症细胞模型已成功建立。本研究获得的数据表明，POGD显著抑制这些细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12和IL-17）的表达水平，表明POGD对TNF-α诱导的MH7A细胞具有抗炎活性。此外，POGD的抑制率（32μ（g/ml）对MH7A细胞的抑制率在36小时<30%，在24小时<20%(). 因此，假设POGD诱导的炎症因子释放抑制不是由MH7A细胞的抗增殖活性引起的。
先前的研究报道，包括TNF-α和IL-1β在内的细胞因子可诱导MMPs和COX-2的表达(23,24). 基质金属蛋白酶的产生是关节破坏的主要原因，包括软骨、骨和肌腱(25). COX-2是一种促炎酶，在炎症反应中也很重要，在炎症部位和肿瘤组织中上调(26). COX-2催化花生四烯酸转化为前列腺素，特别是前列腺素E2（PGE2）(27). PGE2是一种重要的促炎介质，与炎症性疾病有关。在本研究中，POGD显著降低经TNF-α治疗的MH7A细胞中MMP-2、MMP-3、MMP-9和COX-2的mRNA表达水平，这表明POGD通过降低RA中COX-2表达，抑制MMPs介导的靶向关节破坏，并减少促炎性细胞因子的释放。
血管生成被认为是关节炎发展的一个基本过程(28). VEGF在滑膜和滑液中的表达已被证实，它可以导致关节炎中的血管通透性和血管生成(29). 细胞因子，尤其是TNF-α、IL-1β和TGF-β1，可以刺激VEGF的释放，这可能对滑膜的血管生成有重要作用(30,31). 此外，在类风湿关节炎中，软骨和骨基质被降解，细胞外基质（ECM）蛋白被释放出来，它们起到细胞激活剂的作用(32). TGF-β可能在软骨修复中起重要作用，因为它可以诱导胶原合成，导致滑膜增生。在本研究中，POGD抑制了VEGF、TGF-β1和Smad4的表达，并增加了Smad7的表达，这表明POGD对VEGF表达的抑制作用是通过TGF-？途径介导的。
有报道称，有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）参与细胞增殖和炎症反应(33,34). 调节MAPK激酶为治疗肿瘤和炎症疾病提供潜在益处。由于ERK和JNK可以抑制c-Jun和激活蛋白-1的表达，后者调节促炎细胞因子的基因转录，抑制ERK和JNK有助于减缓RA的进展(35). 在本研究中，POGD治疗下调了MH7A细胞中p-JNK、JNK、p-ERK1/2和ERK1/2的表达，从而抑制了促炎细胞因子的分泌。此外，细胞因子水平的降低有助于抗MH7A细胞的增殖活性。p38的调节被认为是POGD对MH7A细胞抑制特性的关键，p38的上调对抗增殖活性至关重要。
NF-κB信号通路在炎症和免疫反应中也起关键作用(36). NF-κB转录因子是先天免疫和炎症的关键协调因子(37). p65是一种NF-κB亚单位，通常通过其抑制剂IκB定位于细胞质(38). 当IκB从NF-κB中分离出来时，NFκB p65可以转移到细胞核并发挥其转录活性，包括调节炎症酶COX-2和细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12和IL-17A的表达(39). 在本研究中，POGD显著降低核p65的蛋白表达，而IκB和胞浆p65的蛋白质水平显著升高，这表明POGD的抗炎作用可能与通过增加其抑制剂IκB的表达而减少NF-κB蛋白有关。
总之，本研究证明POGD具有显著的抗增殖和抗炎活性在体外和体内此外，可能的机制可能包括减少促炎细胞因子的释放，包括IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12和IL-17A，以及通过抑制TGF-β、NF-κB和MAPK信号通路降低MMP-2、MMP-3、MMP-9、VEGF和COX-2的表达。
数据和材料的可用性
本研究中使用或分析的数据集可根据合理要求从相应作者处获得。
作者的贡献
QG和SW为研究的设计做出了贡献。QG、QW、SW、HQ、QZ、XIA LIU和XS为数据的采集、收集和组装做出了贡献。QG和QW参与了统计分析。QG和SW撰写了主要的手稿文本。所有作者阅读并批准了最终手稿。
道德批准和参与同意
实验方案经德州市人民医院动物护理和使用委员会批准。
工具书类
1Okada Y、Wu D、Trynka G、Raj T、Terao C、Ikari K、Kochi Y、Ohmura K、Suzuki A、Yoshida S等。类风湿关节炎的遗传学有助于生物学和药物发现。自然。2014;506:376–381. doi:10.1038/nature12873。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 2Fry J、Molds A、Strube G、Gambill E.风湿病。家庭健康指南。斯普林格。1982:157–164. [谷歌学者] 三。Collison J.实验性关节炎：你想治疗关节炎吗？IDO2。Nat Rev风湿病。2017年；13:196–197.[公共医学][谷歌学者] 4Firestein GS，McInnes IB。类风湿关节炎的免疫发病机制。免疫。2017年；46:183–196. doi:10.1016/j.community.2017.02.006。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 5Calabrese LH、CalabreseC、Kirchner E.2015年美国风湿病学院类风湿关节炎治疗指南应包括乙型肝炎筛查的新标准：Singh等人的文章评论。关节炎护理研究。2016;68:723–724. doi:10.1002/acr.22865。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 6Singh JA、Saag KG、Bridges SL，Jr、Akl EA、Bannuru RR、Sullivan MC、Vaysbrot E、McNaughton C、Osani M、Shmerling RH等，2015年美国风湿病学院类风湿关节炎治疗指南。类风湿性关节炎。2016;68：1–26.doi:10.1002/art.39480。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 7Mor A、Abramson SB、Pillinger MH。类风湿关节炎中的成纤维细胞样滑膜细胞：炎症和关节破坏的关键因素。临床免疫学。2005;115:118–128. doi:10.1016/j.clim.2004.12.009。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 8彭伟，秦锐，李旭，周慧。虎杖的植物学、植物化学、药理学和潜在应用：回顾。《民族药学杂志》。2013;148:729–745. doi:10.1016/j.jp.2013.05.007。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 9谢QC，杨YP。从日本酸模中分离的physcion 8-O-β-吡喃葡萄糖苷的抗增殖作用。诱导A549细胞凋亡和细胞周期阻滞。BMC补体替代药物。2014;14：377.网址：10.1186/1472-6882-14-377。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 10赵KS，金C，黄X，刘J，闫WS，黄Q，坎W。蒲公英治疗休克的机制。临床血液流变学微循环。2003;29:211–217.[公共医学][谷歌学者] 11Bralley EE、Greenspan P、Hargrove JL、Wicker L、Hartle DK。虎杖提取物在小鼠耳部炎症TPA模型中的局部抗炎活性。《燃烧杂志》。2008;5：1.数字对象标识代码：10.1186/1476-9255-5-1。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 12Hsu CY，Chan YP，Chang J.虎杖提取物的抗氧化活性。生物研究。2007;40:13–21. doi:10.4067/S0716-97602007000100002。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 13Kimura Y，Okuda H.从虎杖根中分离出的白藜芦醇可防止Lewis肺癌荷瘤小鼠的肿瘤生长和肺转移以及肿瘤诱导的新生血管生成。营养学杂志。2001;131:1844–1849. doi:10.1093/jn/131.6.1844。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 14张浩，于驰，江YP，彭C，何凯，唐JY，辛HL。虎杖中虎杖苷对四氯化碳诱导小鼠肝损伤的保护作用。公共科学图书馆一号。2012;7：e46574.doi:10.1371/journal.pone.0046574。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 15Livak KJ，Schmittgen TD.使用实时定量PCR和2−ΔΔC类T方法。方法。2001;25：402–408。doi:10.1006/meth.2001.1262。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 16蒲J，方FF，李小强，舒志华，江YP，韩T，彭伟，郑希杰。苦参碱通过抑制炎症反应，对大鼠II型胶原诱导的关节炎具有较强的抗关节炎作用。国际分子科学杂志。2016;17：E1410。doi:10.3390/ijms17091410。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 17Tran CN，Lundy SK，Fox DA。类风湿关节炎的滑膜生物学和T细胞。病理生理学。2005;12:183–189. doi:10.1016/j.pathphys.2005.07.005。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 18Ospelt C，Gay S.常驻滑膜细胞在破坏性关节炎中的作用。最佳实践研究临床风湿病。2008;22:239–252. doi:10.1016/j.berh2008.01.004。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 19左杰，夏Y，李X，欧阳Z，陈智伟。MAPK的选择性调节有助于17-二羟基-3,4-二甲氧基杂蒽酮在类风湿关节炎衍生的成纤维样滑膜细胞MH7A细胞中的抗增殖和抗炎活性。《民族药学杂志》。2015;168:248–254. doi:10.1016/j.jep.2015.03.069。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 20Myers LK、Rosloniec EF、Cremer MA、Kang AH。胶原诱导的关节炎，一种自身免疫的动物模型。生命科学。1997;61:1861–1878. doi:10.1016/S0024-3205（97）00480-3。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 21Giles JT、Bartlett SJ、Gelber AC、Nanda S、Fontaine K、Ruffing V、Bathon JM。肿瘤坏死因子抑制剂治疗和类风湿关节炎严重术后骨科感染的风险。大黄性关节炎。2006;55:333–337. doi:10.1002/第21841条。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 22Umar S，Hedaya O，Singh AK，Ahmed S.胸腺醌通过ASK1调节抑制TNF-α诱导的类风湿关节炎滑膜成纤维细胞炎症和细胞粘附。毒理学应用药理学。2015;287:299–305. doi:10.1016/j.taap.2015.06.017。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 23Lianxu C，Hongti J，Changlong Y.NF-kappaBp65特异性siRNA抑制大鼠IL-1β诱导和TNF-α诱导的软骨细胞中COX-2、NOS-2和MMP-9基因的表达。骨关节炎软骨。2006;14:367–376. doi:10.1016/j.joca.2005.10.009。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 24田杰，陈建伟，高JS，李磊，谢欣。白藜芦醇通过调节PI3k酶/Akt途径抑制TNF-α诱导的人类类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞IL-1β，MMP-3的产生。风湿病国际。2013;33:1829–1835. doi:10.1007/s00296-012-2657-0。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 25Burrage PS、Mix KS、Brinckerhoff CE。基质金属蛋白酶：在关节炎中的作用。Front Biosci公司。2006;11:529–543. doi:10.2741/1817。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 26Aggarwal BB、Shishodia S、Sandur SK、Pandey MK、Sethi G.炎症和癌症：两者之间的联系有多紧密。生物化学药理学。2006;72:1605–1621. doi:10.1016/j.bcp.2006.06.029。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 27霍基CJ。COX-2抑制剂。柳叶刀。1999;353:307–314. doi:10.1016/S0140-6736（98）12154-2。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 28Koch A.血管生成作为类风湿关节炎的靶点。大黄疾病年鉴。2003;62（补充2）：ii60–ii67。doi:10.136/ard.62.suppl_2.ii60。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 29Nagashima M，Yoshino S，Ishiwata T，Asano G。血管内皮生长因子在类风湿关节炎血管生成中的作用。风湿病学杂志。1995年；22:1624–1630.[公共医学][谷歌学者] 30Palelog EM，Young S，Stark AC，McCloskey RV，Feldmann M，Maini RN.肿瘤坏死因子α和白细胞介素-1对类风湿关节炎中血管生成性血管内皮生长因子的调节。大黄性关节炎。1998;41:1258–1265. doi:10.1002/1529-0131（199807）41:7<1258:：AID-ART17>3.0.CO；2-1.[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 31Cheon H，YU SJ，Yoo DH，Chae IJ，Song GG，Sohn J.通过TGF-β1增加类风湿关节炎和正常人滑膜成纤维细胞中促炎细胞因子和金属蛋白酶-1的表达。临床实验免疫学。2002;127:547–552. doi:10.1046/j.1365-2249.2002.01785.x。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 32Goldring S.类风湿关节炎骨和软骨破坏的发病机制。风湿病学。2003;42（补充2）：ii11–ii16。doi:10.1093/rheumatology/keg327。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 33双特异性MAP激酶磷酸酶（MKPs）与癌症。癌症转移评论。2008;27:253–261. doi:10.1007/s10555-008-9123-1。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 34Kaminska B.MAPK信号通路作为抗炎治疗的分子靶点，从分子机制到治疗益处。Biochim生物物理学报。2005;1754:253–262. doi:10.1016/j.bbapap.2005.08.017。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 35Johnson GL、Lapadat R.由ERK、JNK和p38蛋白激酶介导的有丝分裂原激活的蛋白激酶途径。科学。2002;298:1911–1912. doi:10.1126/science.1072682。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 36Baker RG、Hayden MS、Ghosh S.NF-κB、炎症和代谢疾病。单元格元数据。2011;13:11–22. doi:10.1016/j.cmet.2010.12.008。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 37Vallabhapurapu S，Karin M.免疫系统中NF-κB转录因子的调节和功能。免疫学年鉴。2009;27:693–733. doi:10.1146/annurev.immuniol.021908.132641。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 38Beg AA，Baldwin AS.，Jr《IκB蛋白：Rel/NF-κB转录因子的多功能调节器》。基因发育。1993;7:2064–2070. doi:10.1101/gad.7.11.2064。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 39Lyss G、Knorre A、Schmidt TJ、Pahl HL、Merfort I。抗炎性倍半萜内酯helenalin通过直接靶向p65抑制转录因子NF-kappaB。生物化学杂志。1998;273:33508–33516. doi:10.1074/jbc.273.50.33508。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 
