Drug Des Devel Ther公司。2017; 11:2565–2579。
海藻酸寡糖通过抑制微小RNA-29b间接影响血管内主动脉修复后动脉瘤患者的toll样受体信号传导
,#1,2,三，4,* ,#1,2,三，4,* ,1,2,三，4 ,1,2,三，4 ,1,2,三，4 ,1,2,三，4和1,2,三，4
杨勇
1云南省昆明市第二人民医院血管外科
2昆明医科大学附属第四医院血管外科
三云南省血管外科中心血管外科
4中国昆明云南省腹部外科中心血管外科
马振环
1云南省昆明市第二人民医院血管外科
2昆明医科大学附属第四医院血管外科
三云南省血管外科中心血管外科
4中国昆明云南省腹部外科中心血管外科
杨国凯
1云南省昆明市第二人民医院血管外科
2昆明医科大学附属第四医院血管外科
三云南省血管外科中心血管外科
4中国昆明云南省腹部外科中心血管外科
贾湾
1云南省昆明市第二人民医院血管外科
2昆明医科大学附属第四医院血管外科
三云南省血管外科中心血管外科
4中国昆明云南省腹部外科中心血管外科
李国建
1云南省昆明市第二人民医院血管外科
2昆明医科大学附属第四医院血管外科
三云南省血管外科中心血管外科
4中国昆明，云南省腹部外科中心血管外科
杜玲娟
1云南省昆明市第二人民医院血管外科
2昆明医科大学附属第四医院血管外科
三中国昆明，云南省血管外科中心血管外科
4中国昆明云南省腹部外科中心血管外科
平鲁
1云南省昆明市第二人民医院血管外科
2昆明医科大学附属第四医院血管外科，中国昆明
三云南省血管外科中心血管外科
4中国昆明云南省腹部外科中心血管外科
1云南省昆明市第二人民医院血管外科
2昆明医科大学附属第四医院血管外科
三云南省血管外科中心血管外科
4中国昆明云南省腹部外科中心血管外科
#贡献均等。
*这些作者对这项工作贡献均等
版权©2017 Yang等人。本作品由Dove Medical Press Limited出版并授权 摘要
血管内主动脉修补术（EVAR）常伴随动脉瘤复发。海藻酸寡糖（AOS）作为一种天然产物具有潜在的抗肿瘤特性，但其相关机制尚不清楚。Toll样受体（TLR）信号与动脉瘤的炎症活动相关，可能受miR-29b的影响。因此，通过测量TLR4信号中的重要分子来探讨AOS对动脉瘤的抑制作用。EVAR后，共招募248名主动脉瘤患者，并将其随机分为两组：AOS组（AG，每日口服10mg AOS）和对照组（CG，每日服用安慰剂）。研究残余动脉瘤的大小、动脉瘤复发和副作用。动脉瘤复发通过Kaplan–Meier分析确定。2年后，分别有8名和2名患者死于CG和AG。CG残余动脉瘤的大小明显大于AG(对<0.05）。CG组动脉瘤复发率也显著高于AG组(对<0.05）。AOS治疗降低了miR-29b、TLR4、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、核因子κB（NF-kappa B）、白介素1（IL-1）β和白介素6（IL-6）的水平。miR-29b的过度表达和沉默增加和降低了TLR4、磷酸化p65 NF-κB、磷酸化p-38 MAPK、IL-1β和IL-6的水平。Spearman秩相关分析表明，miR-29b水平与TLR4、NF-kappa B、IL-1β和IL-6水平呈正相关(对<0.05）。因此，AOS通过miR-29b间接影响TLR信号来抑制动脉瘤复发。
关键词：海藻酸寡糖，结果评估，主动脉瘤，微创血管内修复，类toll受体信号通路，抗炎药，microRNA-29b，丝裂原活化蛋白激酶
介绍
主动脉瘤（AA）是对公众健康的一个主要且正在出现的威胁。1血管内主动脉修补术（EVAR）已发展成为一种微创治疗方法。尽管EVAR有一些优点，但该技术仍有一些缺点：EVAR术后残余动脉瘤经常复发，是手术失败的重要危险因素；2EVAR中广泛报道了高复发率动脉瘤。三支架辅助弹簧圈栓塞治疗大型或巨大动脉瘤的复发率很高，这可能与这些手术中使用的支架的金属覆盖率有关。4超过17%的患者在2年的节段动脉线圈栓塞后出现动脉瘤复发，13%的患者出现残余动脉瘤。5
在大多数情况下，动脉瘤治疗前后通常认为药物治疗可以控制疾病。6EVAR感染通常伴随着该技术，并将导致动脉瘤复发的高风险。7持续性内漏也是EVAR后的主要副作用。8所有不良反应均显著影响AA患者的生活质量。大多数研究表明，氧化应激9–12和炎症13–16与各种癌症的风险相关。海洋藻类中含有多种生物活性化合物，如褐藻低聚糖（AOS）。据报道AOS含有抗氧化剂17,18和抗炎特性。19已发现AOS具有抗肿瘤活性。20此外，AOS作为一种天然产物几乎没有副作用。AOS可能为各种癌症提供新型抗癌药物。21
然而，AOS对动脉瘤复发和再生的影响以及相关的分子机制尚不清楚。Toll样受体（TLR）是多种先天免疫和炎症活动中的重要蛋白。先前的研究表明，TLR4信号通路的沉默抑制腹主动脉瘤（AAA）的进展。22miRNA作为一种小的非编码RNA，参与多种生物活动，包括细胞发育，23,24平衡，25免疫，26和炎症反应。27,28据报道，miRNAs是血管疾病的重要生物标志物，同时也被认为是开发该疾病治疗方法的潜在靶点。29因此，miRNA是控制肿瘤进展的免疫和炎症反应的重要调节因子。30目前的证据表明miR-29b的治疗性操作对控制AAA的发展具有很大的希望。30因此，我们旨在通过研究AOS对TLR4信号和miR-29b的影响来探讨AOS在AA回归中的功能作用。为了了解AOS的安全性和有效性，还研究了残余动脉瘤的大小、动脉瘤复发和副作用。
方法
海藻酸钠制备AOS
含有α-L-谷朊酸盐单元和β-D-甘露糖酸盐单元的AOS购自青岛青亚化工有限公司（中国青岛）。根据早先的报告，AOS是由海藻酸钠制备而成，使用海藻酸裂解酶，31分解海藻酸钠。简言之，在100 L自来水中用10 mg海藻酸钠裂解酶在39°C下解聚1 kg海藻酸钠2 h。裂解酶在100°C下变性10 min。在UV-2100PC UV-VIS分光光度计（日本京都岛津）234 nm处测量不饱和糖的量。用电喷雾离子化质谱（ESI-MS）进一步测定聚合物的度数（DP）。将水解产物转移到碳谱仪柱中以除去盐，然后浓缩、干燥并在1mL甲醇中溶解。将两微升上清液注入LTQ-XL质谱仪（ThermoFinnigan，Austin，TX，USA）中。AOS是在正离子模式下检测到的：离子源，5 kV；毛细管温度，280°C–310°C；管透镜，260V；鞘气体，35个任意单位。质谱仪设置在m/z 500–1500的范围内。
参与者
所有程序均经云南省第二人民医院伦理委员会批准，并获得每位患者的书面知情同意书。这项研究是根据赫尔辛基宣言进行的。322013年1月至2014年12月期间，云南省第二人民医院共有397名患者出现严重胸痛和背痛。
胸椎主动脉瘤（TAA）和夹层的诊断已根据先前报告发布的临床诊断标准得到证实。33考虑以下包括标准之一：动脉瘤直径大于5cm；动脉瘤直径为4-5cm，在不到半年的时间内增大了0.5cm；动脉瘤直径是正常肾下动脉直径的2倍；突发严重胸痛，伴有撕裂或撕裂症状（典型症状）；前胸痛，伴有前弓或主动脉根部剥离；颈部或下颌疼痛，主动脉弓受累并延伸至大血管；肩胛内撕裂或撕裂疼痛，累及降主动脉；脑血管意外症状、偏瘫、偏瘫和偏瘫。采用以下排除标准：AA家族史和解剖；恶性肿瘤；心理障碍。
进行了计算机断层扫描（CT），选定的患者进行了TAA和/或解剖。最后，选择248名患者进行本研究，并接受改良EVAR。Zenith TX2 TAA带Pro-Form的血管内移植物是一种带有近端和远端材料的两件式圆柱形血管内移生物（美国印第安纳州布卢明顿市库克医疗公司）。近端部分可以是非锥形或锥形。支架移植物由全厚度编织聚酯织物制成，用聚酯和单丝聚丙烯缝合在Cook-Z钢支架上。带有ProForm的Zenith TX2 TAA血管内移植物是完全支架化的，以提供稳定性和膨胀力，从而在部署期间打开移植物的管腔。所有具有Pro-Form的血管内移植物都是两个圆柱形的血管内移植，具有近端和远端材料。近端部分可以是非锥形或锥形。术前使用多层CT或通过带标记物的导管进行诊断成像，确定每个支架颗粒的直径和长度。移植血管直径大于正常大小的10%，与动脉瘤下未分离主动脉段的直径相关。移植物的长度等于从横断部位到动脉瘤下方降主动脉未分离大小的距离。
手术后，将所有患者随机平均分为两组：AOS组（AG），124例AA患者每天服用10mg AOS，对照组（CG），128例AA患者每日服用10mg安慰剂。
终点
根据之前关于胸部EVAR的报告确定了结果标准。34终点包括早期发病率（中风和截瘫）、呼吸衰竭、急性肾损伤、需要透析、动脉瘤相关死亡和再次手术。根据覆盖移植物近端边缘的近端附着部位确定近端附着区<左锁骨下动脉2cm（不覆盖）被定义为3区；如果内移植物的近端范围距离左锁骨下动脉>2cm并且终止于TAA的近端半部分内（T6水平接近TAA的中点），则将其定义为区域4。34动脉瘤相关死亡将随时进行测量。如果机械通气超过1天，需要重新插管和气管造口，则确定呼吸衰竭。
临床随访
手术时使用入院指数收集详细数据。出院后，所有患者在1个月、3个月、6个月和12个月以及每年在门诊进行随访。此外，连续两年每年进行一次CT血管造影。
AA尺寸的测量
使用超声波扫描系统测量AA尺寸（中国徐州Forward医疗器械有限公司）。超声具有敏感性和特异性。在垂直于主动脉轴的肾下主动脉中测量最大横向和前后外径。
酶联免疫吸附分析
静脉穿刺获得5毫升血液。在1500℃下用离心法分离血清克使用人肿瘤坏死因子-α酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Inc.Corporate，Waltham，MA，USA）测量肿瘤坏死因子（TNF）-α的浓度。TLR4的浓度由RayBiotech（美国佐治亚州诺克罗斯）的人类TLR4 ELISA试剂盒测定。使用来自R&D Systems（明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国）的ELISA试剂盒测量白细胞介素1（IL-1）β和IL-6的水平。根据标准校准曲线计算所有浓度。
AOS对内皮细胞活性的影响
从人动脉瘤中分离出的内皮细胞（EC）购自上海细胞银行（中国上海），并在37°C、5%CO的DMEM中培养2环境。细胞浓度调整为1×105/96细胞板中的细胞。使用台盼蓝（中国北京索拉比奥）和[三H] 将细胞与不同浓度的AOS（0、1、10、100和1000 ng/mL）培养3天后，胸腺嘧啶（Amersham biosciences，Piscataway，NJ，USA，比活度5 Ci/mmol）摄取。在显微镜下用血细胞仪测量台盼蓝阳性细胞。对于[三H] 胸腺嘧啶核苷吸收，不同浓度AOS暴露后细胞计数，200μL细胞悬液1.0×105将每种条件下的细胞/mL添加到96 well板的每个孔中。培养24小时后，用一个Ci/孔的[三H] 胸腺嘧啶核苷4小时，然后用自动样品采集器采集，并用液体闪烁计数器进行测量（Beckman Coulter，Brea，CA，USA）。
细胞共同感染
Sangon Biotech（上海）有限公司（中国上海）合成了抗肿瘤药物和miR-29b模拟物。这些细胞系通过Lipofectamine 3000（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市生命技术公司）与抗坏血酸和模拟物共同感染。共感染3天后，用200μg/mL g-418筛选突变细胞。用ELISA法检测细胞株中TLR4、核因子κB（NF-kappa B）、IL-1β和IL-6。同时，还使用台盼蓝和[三H] 胸苷摄取。
miR-29b的实时聚合酶链反应定量
使用RNA分离试剂盒（Tiangen，Beijing，China）、RNeasy Mini试剂盒（QIA-GEN，Valencia，CA，USA）分离总细胞RNA。使用TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）通过逆转录从总RNA合成cDNA。使用实时聚合酶链反应（美国加利福尼亚州赫拉克勒斯生物实验室）测量miR-29b水平。MiR-29b，正向引物：5′-GGCTTCAGGAAGCTGTTT-3′；反向引物：5′-GTGCAGGTCCGAGGT-3′。U6，正向引物：5′-TTGGTGTCGCTCGTCGGCA-3′；反向引物：5′-GTGCAGGTCCGAGGT-3′。U6 snRNA被用作内部对照。
蛋白质印迹
TLR4可以通过磷酸化p65 NF-κB p65调节TLR炎症反应。35丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）作为调节信号介质在机体免疫中起着关键作用。36为了了解miR-29b对TLR4信号传导的影响，磷酸化MAPK和NF-κB作为TLR4信号传导的第二信使37Western blot检测。TLR4（ab17942）、Phospho-p65抗NF-kappa B（ab86299）、Phospho-p38有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK，ab31828）、IL-1β（ab2105）、IL-6（ab6672）、β-肌动蛋白抗体（ab8227）和二级抗体山羊抗Rabbit IgG H&L（HRP，ab6721）的抗人抗体购自Abcam（中国北京）。蛋白质通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移至聚偏二氟乙烯膜（Millipore，Billerica，MA，USA）。在缓冲液（10 mM Tris[pH7.5]和50 mM NaCl）中用5%脱脂牛奶封闭膜，并在4°C下与一级抗体孵育过夜。用二级抗体（1:3000）进一步处理膜。通过增强化学发光系统（美国伊利诺伊州阿灵顿高地Amersham）观察免疫反应带。
统计分析
所有数据均以平均值±标准偏差或频率和百分比表示。变量通过t吨-测试，χ2或费希尔精确测试。使用单变量统计比较早期结果和晚期结果。使用Kaplan–Meier和log-rank试验测量总生存率、无动脉瘤相关死亡和再灌注。计算Spearman秩相关系数，以确认miR-29b相对水平与TLR4、TNF-α、IL-1β和IL-6水平之间的相关性强度。通过SPSS 20（SPSS Inc.，芝加哥，伊利诺伊州，美国）进行统计计算。如果对-数值均<0.05。
结果
AOS特性
酶消化后从海藻酸钠中分离出四种主要成分（DP3、DP4、DP5和DP6）。在产生[M+K]质谱的条件下，通过ESI-MS进一步确认AOS的分离部分+预测质量DP3（C18H23O19Na3）、DP4（C24H30O25Na4）、DP5（C30H37O31Na5）和DP6（C36H44O37Na6）分别为612、810、1008和1206 Da().
电喷雾电离质谱法分析海藻酸钠消化AOS的DP，产生的质谱为[M+K]+.
笔记：DP3（[M+K]）分离后的质谱显示+=651 Da）；DP4（[M+K]）分离后的质谱显示+=849 Da）；DP5（[M+K]）分离后的质谱显示+=1047Da）；分离DP6（[M+K]）后，可见质谱+=1245 Da）。质谱仪设置在m/z 500–1500范围内。
缩写：AOS，褐藻低聚糖；DP，聚合度。
TAA和解剖患者的基线特征
选择后，共有248名TAA患者接受改良EVAR治疗。AOS和安慰剂治疗2年后，8名患者死于CG，2名患者死于AG。因此，116名患者和122名患者分别完成了CG和AG实验(). 所有患者的基线特征列于男性人数多于女性。大多数患者伴有脑血管病、缺血性心脏病、慢性阻塞性肺疾病和肾功能障碍。年龄（AG组65.8±14.9岁vs AG组62.1±15.3岁，对=0.48）和肾功能不全（CG为33.1%，AG为30.6%；对=0.68）在两组中相似。两组夹层动脉瘤的发生率、主动脉破裂的比例、动脉瘤的最大直径以及所有其他参数也相似(对>0.05) ().
当前研究流程图。
笔记：对照组患者每天服用10毫克安慰剂。AG，AOS组患者每天服用10 mg AOS。
缩写：AA，主动脉瘤；CG，对照组；AOS，褐藻低聚糖；AG、AOS集团；TLR4，toll样受体4；NF-κB，核因子κB。
表1
| AG（n=124） | 重心（n=124） | 对-价值 |
|---|
| 年龄，年 | 65.8±14.9 | 62.1±15.3 | 0.48 |
| 男性，n（%） | 84 (67.7) | 86 (69.4) | 0.78 |
| 饮酒，n（%） | 48 (38.7) | 44（35.4） | 0.60 |
| 吸烟，n（%） | 60 (48.4) | 62 (50.0) | 0.80 |
| 配偶，n（%） | 114（91.9） | 112 (90.3) | 0.66 |
| 每日卡路里摄入量，卡路里 | 2,518.2±456.3 | 2,476.6±449.4 | 0.52 |
| 体重指数，m2/千克 | 23.7±3.2 | 22.6±2.9 | 0.67 |
| 糖尿病，n（%） | 9 (7.3) | 7 (5.6) | 0.61 |
| 高血压，n（%） | 78 (62.9) | 74 (59.7) | 0.61 |
| 冠状动脉阻塞性疾病，n（%） | 15 (12.1) | 17 (13.7) | 0.70 |
| 肾功能不全，n（%） | 38 (30.6) | 41 (33.1) | 0.68 |
| 主动脉病理学 | | | |
| 内侧变性，n（%） | 72 (58.3) | 61 (48.9) | 0.16 |
| 夹层动脉瘤，n（%） | 62 (50.0) | 55 (44.4) | 0.37 |
| 创伤性剥离，n（%） | 8 (6.3) | 5 (4.0) | 0.39 |
| 马凡综合征，n（%） | 5 (4.0) | 8 (6.5) | 0.39 |
| 主动脉破裂，n（%） | 5 (4.0) | 5 (4.0) | 1 |
| 莱辛 | | | |
| 3区，n（%） | 67（54.0） | 74 (59.7) | 0.37 |
| 4区，n（%） | 57 (46.0) | 50 (40.3) | 0.37 |
| 动脉瘤最大尺寸（mm） | 50.2±4.8 | 51.0±4.0 | 0.76 |
EVAR的主要结果
胸主动脉CT显示术前易于观察。术后在胸主动脉成功置入多层支架。基于一系列血管造影图像的三维重建显示，TAA在T2–T5段隆起。图像显示手术成功，未发现内漏。相比之下，术前急诊CT显示AAA隆起。最后，移植体植入和人工血管成功植入AAs。
终点
平均随访时间为24±5个月（见). 总的来说，CG和AG的生存率分别为93.5%和98.4%(对=0.05) (). 与AG相比，CG中接受再次预防的患者更多(对<0.05）。相比之下，Kaplan–Meier分析还显示，在同一时期，CG患者没有再次预防的情况明显高于AG患者（对数秩检验，对=0.04). 在2年的随访中，有16名CG患者和6名AG患者接受了主动脉再灌注，包括内漏和逆行剥离。
表2
| 变量 | AG公司
（n=122） | CG公司
（n=116） | 齐方统计 | 对-价值 |
|---|
| 总体生存率 | 122 (98.4) | 116 (93.5) | 3.75 | 0.05 |
| 经常性AA | 6 (4.8) | 16 (13.8) | 5.58 | 0.02 |
| 内漏 | 2 (1.6) | 10 (8.6) | 6.05 | 0.01 |
| 逆向解剖 | 2 (1.6) | 3 (2.4) | 0.26 | 0.61 |
| 泄漏 | 1 (0.8) | 3 (2.4) | 1.12 | 0.29 |
覆膜支架移植成功，所有患者均观察到动脉瘤完全血栓形成或入口闭合，血栓形成稳定。根据Kaplan–Meier分析，术后2年，CG和AG的患者生存率分别为93.5%和98.4%。在2年的随访中，10名患者死亡。其中，三名患者死于主动脉再阻断，七名患者死于内漏和逆行剥离。
副作用
EVAR相关的不良反应包括疼痛（背部或胸部）、晕厥、持续咳嗽、心跳加快、头晕、突然虚弱、肠缺血、腿部无脉、手臂或腿部发冷等(). 在这些不良反应中，AG组的背痛和胸痛发生率以及持续咳嗽和伤口感染的发生率高于CG组(对<0.05）。血管内治疗具有良好的短期疗效和稳定的中长期疗效。AOS可以作为一种治疗选择，例如在紧急情况下或通过减少EVAR引起的副作用的救援方法中。
表3
| 副作用 | AG公司
（n=122） | CG公司
（n=116） | 卡方统计量 | 对-价值 |
|---|
| 疼痛（背部或胸部） | 5 (4.1) | 23 (19.8) | 14.2 | 0.01 |
| 褪色 | 7（5.7） | 12 (10.3) | 1.72 | 0.19 |
| 持续咳嗽 | 7 (5.7) | 26 (22.4) | 13.85 | 0.01 |
| 心跳加速 | 5 (4.1) | 12 (10.3) | 3.50 | 0.06 |
| 头晕 | 7 (5.7) | 10 (8. 6) | 0.75 | 0.39 |
| 突然虚弱 | 12 (10.7) | 8 (6.9) | 0.67 | 0.41 |
| 肠缺血 | 10 (8.2) | 15 (12.9) | 1.42 | 0.23 |
| 无脉冲腿 | 5 (4.1) | 14 (12.1) | 5.14 | 0.02 |
| 手臂或腿冰冷 | 7 (5.7) | 15 (12.9) | 3.67 | 0.06 |
| 手术感染 | 7 (5.7) | 11（9.4） | 1.19 | 0.27 |
| 慢性伤口感染 | 5 (4.1) | 20 (17.2) | 10.93 | 0.01 |
AOS减少了AA大小
与CG和AG手术前相比，2年随访后EVAR手术减少了AA大小(). 在AOS治疗前，AG和CG之间的AA大小没有显著的统计差异(对>0.05). 与CG相比，AOS在2年修复后显著减少AA大小(对<0.01) (). 结果表明，长期使用AOS将进一步控制残余动脉瘤的生长。
不同组AA大小差异的散点图。
笔记：EVAR和安慰剂治疗前的CG-B。AG-B，在EVAR和AOS处理之前。经EVAR和2年安慰剂治疗后的CG-A。经EVAR和2年AOS治疗后的AG-A。AG、AA患者每天服用10毫克AOS，CG、AA病人每天服用10 mg安慰剂。通过超声扫描测量AA大小。测量肾下主动脉的最大横径和前后外径，该主动脉垂直于主动脉轴。如果对<0.05.
缩写：AA，主动脉瘤；AG、AOS集团；AOS，褐藻低聚糖；CG，对照组；EVAR，主动脉腔内修复。
AOS降低AA患者miR-29b水平
AOS治疗前，AG和CG的miR-29b相对水平无显著统计学差异(对>0.05). 长期服用AOS后，miR-29b的相对水平显著降低(对<0.05) (). 研究结果表明，长期食用AOS会降低miR-29b的相对水平。
不同组miR-29b的相对水平。
笔记：EVAR和安慰剂治疗前的CG-B。在EVAR和AOS治疗之前的AG-B。经EVAR和2年安慰剂治疗后的CG-A。经EVAR和2年AOS治疗后的AG-A。在CG-B、AG-B、CG-A和AG-A组中，N=124、124、116和122例。AG、AA患者每天服用10毫克AOS，CG、AA病人每天服用10 mg安慰剂。如果对<0.05.
缩写：AA，主动脉瘤；AG、AOS集团；AOS，褐藻低聚糖；CG，对照组；EVAR，主动脉腔内修复。
AOS降低TLR4、NF-κB、IL-1β和IL-6的水平
EVAR和AOS治疗前，血清TLR4水平无显著性差异()，NF-κB()和IL-1β() (对>0.05). 2年随访后，血清TLR4水平有较大下降()，NF-κB()和IL-1β()与CG相比，AG中(对<0.05）。在EVAR和AOS治疗前，CG患者的血清IL-6水平低于AG患者() (对<0.05）。2年随访后，AG患者的血清IL-6水平显著降低()与CG相比(对<0.05）。结果表明，长期饮用AOS会降低TLR4、NF-κB、IL-1β和IL-6的水平。
AOS对AA患者TLR4、NF-κB、IL-1β和IL-6水平的影响。
笔记：(A类)AOS对TLR4水平的影响。(B类)AOS对NF-κB水平的影响(C类)AOS对IL-1β水平的影响。(D类)AOS对IL-6水平的影响。在CG-B、AG-B、CG-A和AG-A组中，N=124、124、116和122例。AG、AA患者每天服用10毫克AOS，CG、AA病人每天服用10 mg安慰剂。CG-B，服用安慰剂前的患者。CG-A，服用安慰剂两年后的患者。AG-B，服用AOS前的患者。AG-A，服用AOS两年后的患者。如果对<0.05.
缩写：AA，主动脉瘤；AG、AOS集团；AOS，海藻酸寡糖；CG，对照组；IL-6、IL-6；TLR，toll样受体；NF-κB，核因子κB。
miR-29b水平与血清TLR4、NF-κB、IL-1β和IL-6水平呈正相关
显示miR-29b的增加也增加了TLR4、NF-κB、IL-1β和IL-6的水平。Spearman秩相关检验表明miR-29b水平与血清TLR4水平呈正相关()，NF-κB()，IL-1β()和IL-6() (对<0.05），因为rho值分别为0.82、0.75、0.80和0.85。
miR-29b水平与TLR4、NF-κB、IL-1β和IL-6水平之间的关系。
笔记：(A类)miR-29b水平与TLR4水平的关系。(B类)miR-29b水平与NF-κB水平的关系(C类)miR-29b水平与IL-1β水平之间的关系。(D类)miR-29b水平与IL-6水平的关系。采用Spearman秩相关检验比较两个参数的显著性。如果rho值介于0.5和1之间，则存在正关系。如果对<0.05.
缩写：IL-6、IL-6；NF-κB，核因子κB；TLR，toll样受体。
AOS毒性对EC的影响
为了避免AOS因其毒性而对EC产生影响，测量了AOS的浓度。台盼蓝分析表明，在100 ng/mL以上的浓度下，内皮细胞暴露于AOS会导致细胞活力丧失(;对<0.05）。当AOS浓度为1000 ng/mL时，培养72h后细胞存活率仍大于95%[三H] 暴露于不同浓度的AOS后，胸腺嘧啶掺入DNA。如所示，没有显著减少[三H] 当浓度超过1000 ng/mL时测量的胸腺嘧啶核苷摄取(对<0.05）。根据这些结果，每天服用10毫克不会对内皮细胞造成毒性。
AOS对内皮细胞活性的影响。
笔记：(A类)用台盼蓝测定内皮细胞的细胞活力。(B类)使用[三H] 胸苷摄取。数据表示为平均值±标准偏差。每组N=8。
缩写：AOS，褐藻低聚糖；内皮细胞。
AOS抑制EC的生长，但不抑制其活性
从人动脉瘤中分离出内皮细胞。结果表明，当AOS浓度超过100 ng/mL时，AOS会抑制EC的生长。根据结果，所有患者每天使用10 mg/天（每个患者的体重<100 kg）。细胞活性分析表明AOS不能通过使用台盼蓝影响细胞活性()和[三H] 胸苷掺入()即使浓度为1000 ng/mL。
AOS对内皮细胞生长的影响。
笔记：(A类)实时分析AOS对内皮细胞生长的影响。(B类)台盼蓝分析AOS对内皮细胞活性的影响。(C类) [三H] 胸苷掺入分析AOS对内皮细胞活性的影响。N=8。
缩写：AOS，褐藻低聚糖；内皮细胞。
AOS治疗降低miR-29b的相对水平
结果表明，AOS在浓度<10 ng/mL时不会影响miR-29b的相对水平。当浓度大于10 ng/mL时，AOS降低了miR-29b的相对水平，在浓度为1000 ng/mL的时候达到最低水平。结果表明，当microRNA被阻断时，miR-29b的相对水平达到最低水平，当microrRNA过度表达时达到最高水平。
不同组miR-29b的相对水平。
笔记：(A类)AOS对miR-29b相对水平的影响。(B类)不同处理对miR-29b相对水平的影响。每组N=8*对与重心相比<0.05。
缩写：AOS，褐藻低聚糖；CG，对照组；SG、miR-29b被拮抗剂沉默；OG，miR-29b过度表达。
AOS治疗降低EC中TLR4、NF-κB、IL-1β和IL-6的水平
结果表明，AOS在浓度<10 ng/mL时不会影响TLR4的水平。当浓度大于10 ng/mL时，AOS降低了TLR4水平，当浓度为1000 ng/mL后达到最低水平。结果表明，AOS在浓度<10 ng/mL时不会影响NF-kappa B的水平，当浓度大于10 ng/mL时，AOS降低了NF-kapba B的含量，在浓度为1000 ng/mL的时候达到最低水平。结果表明，AOS在浓度<10 ng/mL时不会影响IL-1β的水平，当浓度大于10 ng/mL时AOS会降低IL-1β水平，在浓度为1000 ng/mL的时候达到最低水平。结果表明，AOS在浓度<100 ng/mL时不会影响IL-6的水平。AOS在浓度超过100 ng/mL时降低IL-6的水平，在浓度为1000 ng/mL时达到最低水平。所有结果表明，AOS治疗降低了内皮细胞中TLR4、NF-κB、IL-1β和IL-6的水平。结果可以与患者血清中的水平进行比较。
AOS对内皮细胞TLR4、NF-κB、IL-1β和IL-6水平的影响。
笔记：(A类)AOS对TLR4水平的影响。(B类)AOS对NF-κB水平的影响(C类)AOS对IL-1β水平的影响。(D类)AOS对IL-6水平的影响*对与未添加AOS的CG相比，<0.05。
缩写：AOS，褐藻低聚糖；对照组CG；内皮细胞；IL-6、IL-6；NF-κB，核因子κB；TLR，toll样受体。
MiR-29b水平与内皮细胞TLR4、NF-κB、IL-1β和IL-6水平呈正相关
MiR-29b模拟物和拮抗剂成功转染了内皮细胞，估计转染率在60%到80%之间。表明miR-29b的过度表达增加了TLR4的水平，而miR-29b的沉默降低了TLR4。结果表明，miR-29b的过度表达增加了NF-κB的水平，而miR-29b的沉默降低了NF-kappa B的水平。表明miR-29b的过度表达增加了IL-1β的水平，而miR-29b的沉默降低了IL-1贝塔的水平。结果表明，miR-29b的过度表达增加了IL-6的水平，而miR-29b的沉默降低了IL-6水平。因此，miR-29b水平与内皮细胞中TLR4、NF-kappa B、IL-1β和IL-6水平呈正相关，提示miR-29a的变化将影响TLR4，NF-kapba B、IL-1β和IL-6的水平。
miR-29b对内皮细胞的影响。
笔记：(A类)miR-29b对TLR4水平的影响。(B类)miR-29b对NF-κB水平的影响(C类)miR-29b对IL-1β水平的影响。(D类)miR-29b对IL-6水平的影响。(E类)台盼蓝分析miR-29b对EC活性的影响。(F类) [三H] miR-29b对EC活性影响的胸苷摄取分析*对与重心相比<0.05。
缩写：CG，对照组；内皮细胞；IL-6、IL-6；NF-κB，核因子κB；OG，miR-29b过度表达；SG、miR-29b被拮抗剂沉默；TLR，toll样受体。
蛋白质印迹
为了测量miR-29b对磷酸化p65 NF-κB和磷酸化p38 MAPK变化的影响，进行了Western blot分析。Western blot分析表明miR-29b过度表达增加了磷酸化p65 NF-κB的水平()，磷酸化p38 MAPK()，TLR4级()，IL-1β()和IL-6()与CG水平相比。相反，miR-29b抑制剂降低磷酸化p65 NF-κB的水平()，磷酸化p38 MAPK()，TLR4级()，白细胞介素1β()和IL-6()与CG水平相比。所有结果表明，miR-29b可以影响TLR4信号的活性。
(A类–F类)miR-29b对TLR4信号分子表达影响的Western blot分析。
笔记：(A类)Western blot分析miR-29b对p65 NF-kappa B、p38 MAPK、TLR4、IL-1β和IL-6表达的影响。(B类)miR-29b对NF-κB相对蛋白水平的影响(C类)miR-29b对磷酸化p38 MAPK表达的影响。(D类)miR-29b对TLR4表达的影响。(E类)miR-29b对IL-1β表达的影响。(F类)miR-29b对IL-6表达的影响*对与重心相比<0.05。
缩写：CG，对照组；IL-6、IL-6；NF-κB，核因子κB；OG，miR-29b过度表达；SG、miR-29b被拮抗剂沉默；TLR，toll样受体。
讨论
这是一项回顾性研究，评估AOS在AA治疗中的疗效和适用性。基于248例接受EVAR的患者，CG和AG的早期死亡率和神经并发症没有显著差异。根据晚期结果，AG的总生存率高于CG(对<0.05）。结果表明AOS有助于AA的修复。CG组的再干预率和持续出现的并发症高于AG组(对<0.05）。两组治疗两年后无动脉瘤相关死亡的情况存在显著差异(对<0.05）。
AA治疗仍然是一个挑战，尽管一种创伤较小的方法可以商业化地用于治疗AA。自从引入EVAR以来，它是传统开放性修复的一种安全可行的替代方法。然而，手术仍有一些副作用。呼吸衰竭是一种主要并发症，影响术后发病率和死亡率，导致住院时间延长。除了开胸手术外，体外循环和低温导致炎症反应也是术后呼吸衰竭的原因。38由于它们的侵入性较小，在EVAR中呼吸衰竭相对罕见。在本研究中，CG患者发生呼吸衰竭的人数多于AG患者(对<0.05）。AOS显著降低了这些副作用(对<0.05）。
EVAR因其围手术期死亡率和发病率的提高而得到迅速发展。然而，高再预防率仍与EVAR有关。39在这里，AA的复发率明显较低与AOS治疗有关（CG有16例，AG有6例）。在细胞水平上，AOS被证明可以降低miR-29b的水平()、TLR4、NF-κB、IL-1β和IL-6()miR-29b的过度表达和沉默将分别增加和降低TLR4、磷酸化p65 NF-κB、磷酸化p-38 MAPK、IL-1β和IL-6的水平(). NF-kappa B包含磷酸化位点，磷酸化对激活TLR4信号通路非常重要。40磷酸化MAPK在调节TLR4信号传导中也起着重要作用。41减少复发性AA病例的原因可能是AOS降低了血清miR-29b水平()并导致TLR4、磷酸化p65 NF-κB、磷酸化p-38 MAPK、IL-1β和IL-6的减少(). 另一方面，miR-29b与血清TLR4、NF-kappa B、IL-1β和IL-6水平呈强阳性关系(). 这些结果表明，AOS治疗通过降低miR-29b水平降低了血清TLR4、NF-κB、IL-1β和IL-6的水平。
AOS治疗似乎与降低长期死亡率有关。患者的中期随访显示，累积生存率显著提高。与主动脉疾病相关的CG中有8例死亡，AG中有2例死亡。所有这些结果都为海藻天然产物在AA患者治疗中的潜在应用提供了可能(). 逆行剥离和内漏是导致患者死亡的重要并发症。这些显著的并发症导致了EVAR术后动脉瘤相关的死亡率。然而，我们医院前两年接受EVAR的患者中发生了晚期动脉瘤相关死亡。AOS治疗改善了我们机构的EVAR，因为与CG相比，动脉瘤相关死亡率降低。如上所述，使用组合技术有一些优点，包括1）AOS减少了AAs的发生率；2） 感染率降低；3） 死亡人数的减少；4） 出血、气胸和中风等并发症较少；和5）由于AOS导致的修复材料引起的其他副作用的减少。
用于AA患者治疗的海藻AOS的卡通描述。研究发现，低聚糖通过抑制miR-29b使TLR4、NF-kappa B、IL-1β和IL-6失活，从而防止动脉瘤再生。
缩写：AA，主动脉瘤；AOS，褐藻低聚糖；IL-6、白细胞介素6；NF-κB，核因子κB；TLR，toll样受体。
当然，本研究存在一些局限性：1）分离出四个主要AOS组分（DP3、DP4、DP5和DP6）。我们想在随后的实验中使用一种生物活性成分。然而，目前无法以适合患者群体的规模制备单一成分。另一方面，低聚糖是复杂的碳水化合物分子，其纯度将反映产品质量，因此本文对其成分进行了分析。无论如何，为了确定特定组件的功能，未来还需要进一步的工作；2） 缺乏阴性CG，如开放手术修复；3） AOS对大多数炎性细胞因子和抗氧化酶的影响在这里没有探讨；4） 目前的研究结果表明，AOS抑制了内皮细胞的生长，而这仍然很难与动脉瘤治疗的临床应用联系起来。我们的目的是通过AOS抑制内皮细胞的激活来控制动脉瘤的生长，因为内皮细胞是从动脉瘤中分离出来的。为了进一步证实这一结果，需要在未来的工作中进行动物实验。TLR4磷酸化的表观遗传机制尚未研究。无论如何，还需要进一步的研究来证实AOS的治疗效果。还需要前瞻性的多中心数据来证实目前的发现。
结论
综上所述，本研究结果表明AOS通过miR-29b间接影响TLR信号，抑制残余动脉瘤的生长，减少动脉瘤复发。AOS治疗可以作为AA修复和控制其后续发展的辅助方法。AOS为AA的微创血管内修复和解剖提供了一种辅助方法。AOS减少了复发性AA及其副作用，如伤口感染率。为了更好地使用AOS，还需要进一步的工作来确认目前的治疗效果。
致谢
这项工作得到了云南省医疗卫生单位内部研究机构科研项目（No 2014NS048）和（2017NS137）的支持。
工具书类
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